Monoklonal antikorlar, tek bir B-lenfosit klonundan üretilen mono-spesifik antikorlar ve aynı epitopa bağlanan monovalent antikorlar olarak bilinir. Son zamanlarda, monoklonal antikor tabanlı ELISA gıdalar veya doğal ürünlerin nitel veya nicel analizi için gelişmekte olan platform haline gelmiştir. Bu yöntem sıkıcı ön işlem adımları olmadan doğru, hassas ve etkili bir yöntemdir.
Bu biyolojik numuneler ve gelecekteki klinik uygulamalar için gereklidir. TCM mAD'lerinin hazırlanması, TCM formülünün karmaşık sistem özellikleri üzerine yapılan çalışmalarda hayati bir adımdır. Yapay antijen sentezi, fare bağışıklığı ve hücre füzyonu da dahil olmak üzere küçük moleküler bileşiklere karşı mAB'ler üretmek için bir protokol geliştirdik.
Hapten yapay antijen sentezlemek için taşıyıcı protein ile bağlıdır. Yapay antijen ve komple adjuvants karıştırılır ve emülsifiye edilir. Fare deri altı enjeksiyonla aşılanmış.
Aşılanmış farenin dalağını çıkar ve tek hücreli süspansiyon yapın. Miyelom hücrelerini karıştırın. Splenositler PEG yöntemi ile HAT duyarlı fare miyelom hücre hattı ile izole edilir ve eritilir.
ELISA ile antikorları hazırlayabilen bir hücre hattı seçin. Antijene reaktif olan monoklonal antikorları salgılayan hibridomomlar klonlanır. Hibridoma hücre hattı kurmak cryopreserved olduğunu.
Bir narigin BSA konjuge sentezinde periodate oksidasyon prosedürü kullanılmıştır. İlk olarak, narigin narigin çözeltisi beş mililitre taze hazırlanmış sodyum pariodate çözeltisi 100 mikrolitre mililitre başına miligram bir miligram son konsantrasyonda çözüldü. Bir saat oda sıcaklığında karışımı karıştırın.
İkinci olarak, narigin sodyum periodate reaksiyon karışımına iki mililitre taşıyıcı protein ekleyin. Karışımı pH dokuz çözeltisine ayarlayın ve altı ila sekiz saat boyunca reaksiyona devam edin. Üçüncü olarak, yapay antijen CBS yabancılaşmak için üç gün boyunca PDS diyaliz yöntemi ile saflaştırılmış oldu.
Freund'un tam adjuvan ve eksik adjuvan fare bağışıklama için kullanılmıştır. Aşılama için, Freund'un tam adjuvan eşit hacmi ile eşleç 50 mikrogram karıştırın ve tamamen emülsifiye. Dorsal deri altı enjeksiyon yoluyla her BALB/c faresine bu karışımın 100 mikrogramını administrate.
İki hafta sonra eksik adjuvan ile karışık konjuge aynı miktarda deri altı enjeksiyon ile bir güçlendirici aşı teslim. Primer bağışıklama için Freund'un komple adjuvan ve immünojeni subdermal enjeksiyon ile kullanıldı. Güçlendirici bağışıklama için Freund'un eksik adjuvan ve immünojensubenjeksiyon ile kullanıldı.
Adjuvan olmadan darbe aşısı için subdermal enjeksiyon veya intraperineal enjeksiyon ile sadece immünojen kullanıldı. Yem tabakası hücreleri esas olarak abdominal epitel hücreleri veya makrofaj kökenli. HAT ekran ortamının hazırlanmasında RPMI 1640 FBS ve HAT kullanılmıştır.
HAT takviyesi 10 mililitre RPMI orta çözülmüş, daha sonra içine eklendi 500 mililitre RPMI 1640 içeren 20% FBS. ICR faresi beş dakika boyunca %75 etil alkolle sterilize edildi. Hemostatik forceps ile karın kürk çıkardıktan sonra,% 75 etanol ile bölgeyi dezenfekte.
Karın boşluğuortaya çıkarmak için dış deri kesin. Karın içine steril RPMI 1640 orta üç mililitre enjekte. Sonra çözelti içine ek hücreleri ayırmak için karın masaj.
15 mililitrelik bir santrifüj tüpü içine fetal hücre süspansiyon aspire. 1, 000g 10 dakika hücre süspansiyon santrifüj sonra, supernatant atın ve tek hücre süspansiyon almak için fetal hücreleri yeniden askıya. Bu işlemden sonra, HAT ortamı nı kullanarak hücreleri çözün.
Hücre üyelerinden mililitre başına 100,000 yapmak için hücreleri say. Hücreleri 96 kuyu hücre kültür plakasına aktarın. Plakaları bir gecede 37 derece, %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.
Seçilen aşılanmış fare beş dakika boyunca %75 etil alkol le sterilize edildi. Yıkama tamponu olarak ASpire RPMI 1640 orta. Dalak ortaya çıkarmak için makas kullanarak deri ve kas dokusu çıkarın.
Dalağını cımbızla dikkatlice izole edin. Daha sonra DALağını RPMI 1640'ta yıkayın. Dalağını izole edin ve parçalara ayırın.
Yavaşça dalağını vur. Daha sonra bir dalak hücre süspansiyon hazırlamak için hücreleri çözmek için bir RMPI 1640 orta ile tedavi edildi. Bundan sonra, hücreler 800 örgü hücresüz tarafından filtre edildi.
Büyük dokuları çıkarmak için dalağını dikkatlice çivile. Büyük dokulardan kaçınmak hücrelerin füzyonunu etkiler. RPMI 1640 orta ile dalak hücre süspansiyon oldu.
Sonra hücre süspansiyonu santrifüj tüpüne eklendi. 10 dakika boyunca 1,000g de santrifüj tarafından dalak hücreleri hasat. Ve sonra supernatant atın.
Dalak hücrelerinin bir ila 10 milyar arasında olması gerekiyordu. Ekili ve güçlendirilmiş miyelom hücrelerini kuvözden çıkarın ve hücre süspansiyonu elde etmek için şişeyi hafifçe sallayın. RPMI ile süspansiyon iki kez oldu.
Dalak hücre süspansiyonu ve miyelom hücrelerini karıştırın. Hücreleri say ve konsantrasyonu ayarla. Dalak hücrelerinin miyelom hücrelerine son rasyonu 1-5-10 arasında olmalıdır.
Hücre karışımını santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Hücrelere% 50 polietilen glikol çözeltisi bir mililitre ekleyin ve yavaşça bir dakika için 37 derece karıştırın. 30 saniye boyunca ayakta, rpmi 1640 orta iki mililitre ekleyin ve reaksiyonu sona erdirmek için iki dakika boyunca 37 derece kuluçka.
Başka bir dakika için iki mililitre RPMI ekleyin. Sonra, 10 mililitre RPMI 1640 ekleyin. 10 dakika 800g de Santrifüj.
Supernatant atılması, HAT çözeltisi ekleyin ve 37 derece 5% karbondioksit yedi gün boyunca hücreleri yetiştirmek için devam. Yedi gün sonra, 96 kuyu plakasındaki hücre süpernatanları hücre füzyonundan sonra aspire edildi ve kaplama antijeni ile önceden kaplanmış ELISA plakalarına eklendi. Bir saat boyunca 37 derecede ekili, ikincil antikor eklendi ve yarım saat için ekili.
Substrat çözeltisi 100 mikrolitre ekledikten sonra. Tepkiyi durdur. Mikroplaka okuyucuiçine ELISA plakaları için, endpoint yöntemi 450 nanometre veri okuyun kullanılmıştır.
450 nanometre de ölçülen emicilik ve pozitif hibridomlar ekran. Monoklonal hibridomları hazırlamak için sınırlayıcı seyreltme yöntemini kullanın. Seçilen hibridomlardan HD ortamını çıkardıktan sonra RPMI 1640'taki hücreleri yeniden askıya alın ve sayarsınız.
RpMI 1640 tarafından bir hücre, iki hücre ve her kuyu başına dört hücrenin 96 iyi plaka ve kültür deki hücrelerini seyreltin. 24 kuyu plakası, 25 ve 75 santimetre kare şişeler için pozitif hibridomlardan hücreleri ekimi için transfer. Miyodomaları eksi 80 derecede 24 saat boyunca bir degrade soğutma kutusunda saklayın.
Daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın. Antiserumların titremi dolaylı ELISA tarafından belirlendi. Fare bir ile dört narigin BSA konjuge ile aşılanmış önemli ölçüde aşılı olmadan kontrol faredaha yüksekti.
1'den 5'e, 000'e kadar olan titre yeterli difüzyondur. Hapten konjuge'nin moleküler ağırlığı MALDI-TOF analizi ile doğrulandı. Şekil 2'de gösterildiği gibi, BSA standardı ve nariginin moleküler ağırlığı bilindiği için, narigin moleküllerinin BSA ile konjuge olduğunu hesaplayabilir ve belirleyebiliriz.
HAT seçim medyasında sadece hybridoma hayatta kalabilir ve büyüyebilir. Büyüme yedi gün sonra, hücre kültürü ELISA tarafından test edilebilir. Pozitif hibridomlar yeniden klonlandı ve genişletildi.
Bu görüntüler istikrarlı monoklonal ve poliklonal hibridoma hücre hatları için konvansiyonel sonucu göstermektedir. Bu deneyin kritik noktası hapten için özel mAbs tarama, ancak taşıyıcı protein değil. MAb'nin özgüllüğü daha sonra yapısal olarak ilişkili diğer bileşiklerin varlığında incelendi.
Çapraz reaktivite antijen için mAb özgüllüğünü değerlendirmek için hesaplandı. Naringin kalibrasyon eğrisi ve astar aralığı elde edildi. Antijene özgü monoklonal hibridomlar genişletildi ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojen de kriyoopreserved edildi.
Bu videoyu izledikten sonra, ben küçük bir moleküler bileşiklere karşı monoklonal antikorlar oluşturmak için nasıl iyi bir anlayışa sahip umuyoruz. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneyler için iyi şanslar.
