This work was supported by NIH grants HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) and HL-102836 (KAP) and Cimphoni Life Sciences (part of DW salary). The authors thank Meghann Sytsma for editing the manuscript.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. protokol Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (: AUA # 1517 Protokolü) tarafından onaylandı. fareler içeren tüm araştırmalar PHS politikasına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Decoy Peptid 1. Tasarım <ol><li> IRF5 3D yapısını bulun ve üzerinde tasarım temel. 438 (ELSWSADSIRLQISNPD) - 17 mer Tasarım, aspartat (D), 421 de IRF5 fosforilasyon taklit etmek için serin (S) için ikame edilmiş olan IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) olarak adlandırılan. 3D sülfhidril grupları ve aktivasyon IRF5 en mekanizmasının bilgisi, yani, serin fosforilasyon analizi IRF5 hedefleme için bir strateji, bir yem peptidi üretmek üzere olduğunu göstermiştir. Bkz: Şekil 1. 3D yapısında en iyi bölgeyi tanımlamak için, küçük Molekül tasarımı için bir moleküler modelleme yazılımı kullanmakes ve peptidler 15. NOT: Bu süreçte kritik adım 3D hedef proteinin yapısı ve olası bağlanma sitelerinin mevcut olmasıdır. IRF5 3 boyutlu yapısı doğru fosforilasyon sonra nasıl IRF5 dimerleşir temsil eder. serin veya treonin için aspartat ikame dış kaynaklı. Peptit IRF5 bağlı olmadan ayrı ayrı olarak sentez edilir. </li><li> Sadece orijinal sekansı temelinde S. D ile ikame ederek, fosfo-alan çoğaltma (ELSWSADSIRLQISNPD Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH2 (IRF5D) amino asidi dizisi ile, yeni bir peptid IRF5S olun. </li></ol> 2. Biolayer İnterferometri (BLI) Not: yeniden birleştirici IRF5 için arıtma dış kaynaklı edildi. 16 <ol><li> 1 bir mol oranında Biyotin etiketli IRF5: biotin 1 uzun zincirli bağlayıcı içeren bir biyotinilasyon maddesi ile ligand. uzun zincirli bağlayıcı bir daha aktif ve homojen liga sağlayacaktırnd yüzey. <ol><li> 20 mM biotin reaktif 13 uL 2 mg 1 ml / ml IRF5 ekleyin veya gerekirse hacmini artırmak. 2 saat buz üzerinde inkübe edin. Etiketlemeden sonra, işaretlenmiş protein reaksiyon karışımının ayrılması için bir tuz giderme spin kolon kullanımı. </li></ol></li><li> 15 dakika boyunca biyosensör ile biyotin etiketli ligand inkübe edin. aşırı etiketleme önlemek ve 1 ayarlayın: 1 molar oranı. Etiketlemeden sonra, işaretlenmiş protein reaksiyon karışımının ayrılması için bir tuz giderme spin kolon kullanımı. </li><li> IRF5 decoy peptidin farklı konsantrasyonlarda 10 dakika için biyotin etiketli IRF5 biyosensörler inkübe edin. Birleşme ve ayrılma hızları, 18 17, 10 tarif edildiği gibi tespit edilmiştir. </li></ol> 3. Apoptoz ve Çoğalma Tahlilleri <ol><li> Tetrazolyum ve bioreduction ile çoğalma tahlili <ol><li> IRF5D PBS içinde seyreltilmiş olarak uygulanabilir (1 mg /kg / gün, 21 gün Tsk / + ve C57BL / 6J farelerine tek başına PBS standart scruffing tekniği ya da bir 27 gauge iğne ile deri altına), 20 g fare bir hacmi 20 uL enjekte edilir. </li><li> izofluran (% 5) ile fareler anestezi ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. sternum boyunca göğüs açık keserek kalbini tüketim. forseps ile kalbi yukarı kaldırın ve kalp kaldırmak. </li><li> Lyse 50 mM Tris-HCI pH 7.4, Bradford tahlili 19% 0.5 NP-40, 250 mM NaCI, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 ve tespit protein konsantrasyonu ihtiva eden bir protein liziz tamponuyla kalpler. </li><li> bölüm 7&#39;de tarif edildiği gibi izole edilmiş C57BL / 6J kardiyak matrisle tabakalı 96-gözlü plakalar seyreltin PBS 20 ug / mL &#39;lik bir konsantrasyona kadar C57BL / 6J kalp matrisinin süspansiyon haline getirilmiş ve her bir C57BL / 6J kalp 30 mcL ekleyin. Bu kuluçka makinesi içinde 37 ° C de bir gece boyunca çökelmeye olsun. </li><li> endotel bazal m 500 mi kültür, insan göbek damarı hücrelerinin% 0.4 sığır beyin ekstresi,% 0.1 askorbik asit,% 0.1 hidrokortizon,% 0.1 insan epidermal büyüme faktörü,% 2 fetal sığır serumu ve gentamisin / amfoterisin B için eklenen% 0.1 edia. Kültür oyuk başına 25,000 hücre yoğunluğunda% 5 CO2 ve% 95 hava odası 96 yuvalı plakalar üzerinde hücreleri. 0 ile IRF5D artan konsantrasyonları ile teşvik - ortama 100 ug / mL (miktarlar, 0 ve 50 ul / ml arasında idi). </li><li> Üç gün sonra, hücre çoğalmasını belirlemek bir mikroplaka okuyucusu üzerinde absorbans farkları değerlendirmek. Reaksiyon MTS tetrazolyum bileşiğinin bioreduction olup. NADPH ve NADH, metabolik olarak aktif hücrelerin deki dehidrojenaz enzimleri yoluyla üretilir. </li><li> MTS tetrazolyum bileşiği, -20 ° C&#39;de donmuş olarak saklanır gibi, bileşik oda sıcaklığında yavaş yavaş yaklaşık 90 dakika eritin. Pipet 20, 96 oyuklu plakanın her oyuğuna uL, ve buna kültür ortamı, 100 uL ilave edin. Bir Humi 1 ila 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakasıasitleştirildi,% 5 CO 2 odacık. </li><li> 490 nm&#39;lik bir dalga boyunda emicilik okuyun. </li></ol></li><li> Kaspaz aktivitesi ile Apoptosis denemesi NOT: Deneysel set-up 3.1.5 için 3.1.1 yukarıdaki aynıdır. <ol><li> ortama 100 ug / mL - 0 ile IRF5D artan konsantrasyonları ve hücreleri uyarır. </li><li> EC&#39;ler için Kaspaz 3/7 alt-tabaka için yeşil algılama ekleyin ve 37 ° C&#39;de 30 dakika için inkübe edilir. 502/530 nm&#39;lik bir emme / emisyon dalga ile eş zamanlı olarak mikroplaka okuyucusu üzerinde flüoresans değerlendirmek. üç nüsha olarak denemeler. Not: yeşil flüoresan madde, bir nükleik asit bağlayıcı bir boya bağlı bir dört amino asitli bir peptiddir. kaspaz 3 ve 7 aktivasyon sonrasında parçalanan Bu reaktif floresan olur. Bu floresans ölçülmüştür. avantajı, yıkama basamakları bir azalmadır. </li></ol></li></ol> Duyun IRF5 ve ICAM-1 ifadesinin 4. Değerlendirmet <ol><li> Standart bir scruffing tekniği ile ya da tek başına Elbette bu / + ve C57BL / 6J fareleri bir kez PBS ile 27 gauge iğne ile deri altından (20 g fare bir hacmi 20 uL enjekte 1 mg / kg / gün), PBS içinde seyreltilmiş IRF5D yönetme 21 gün boyunca günde. </li><li> izofluran (% 5) ile fareler anestezi ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. sternum boyunca göğüs açık keserek kalbini tüketim. forseps ile kalbi yukarı kaldırın ve kalp kaldırmak. </li><li> Lyse 50 mM Tris-HCI pH 7.4, Bradford tahlili 19% 0.5 NP-40, 250 mM NaCI, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 ve tespit protein konsantrasyonu ihtiva eden bir protein liziz tamponuyla kalpler. <ol><li> kalplerin lizatları üzerinde bir batı leke gerçekleştirin. 25 ug toplam protein ve% 5 mersaptoetanol ihtiva eden Laemmli numune tampon maddesi ile 40 ul bir hacme kadar örnekleri seyreltilir. 5 dakika boyunca 50 mV% 15 TGX jel - 4 örnekleri çalıştırın. Boya ön bitene kadar 1 saat boyunca 100 mV gerilim artırın.</li><li> 15 dakika - (gerekirse 8.3 pH ayarlamak, 25 mM Tris, 190 mM glisin,% 20 metanol) ve 10 boyunca inkübe 1x transfer tampon maddesi içinde jel yerleştirin. </li><li> Transfer sandviç (sünger, filtre, jel, selüloz membran, filtre, sünger) birleştirin. kabarcıklar arasında sıkışıp emin olun. leke katot ve anot üzerinde jel üzerinde olmalıdır. 100 mA soğuk odada 1 saat aktarın. </li><li> Sonraki gün, leke yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 yağsız kuru süt içine bir arka plan blok. Tris benek her biri 5 dakika süreyle% 5 Tween üç kez içeren tamponlu tuz durulayın. </li><li> IRF5 veya ICAM-1 için primer poliklonal antikorları kullanılarak primer antikorlar ile gece boyunca inkübe edin. 1000 seyreltme: Tris antikorlar bir 1 tamponlu tuz ile seyreltilir. </li><li> Tris ikincil antikorlar tamponlu tuz ile seyreltilir ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca leke inkübe edin. İkincil antikorlar için, kullanımı yabanturpu peroksidaz konjüge edilmiş eşek anti-fare IgG (1: 10,000) ve yaban turbu peroksidaz eşek anti-keçi IgG (1: 10,000), sırasıyla. </li><li> üreticinin protokolüne uygun olarak, karıştırma bileşenleri sonra, blot kemilüminesans uygulanır ve ilgili bantlar luminesce 3 dakika inkübe edilir. bir X-ışını filmine leke Açığa. yoğunluğunu ölçmek için ImageJ kullanın. Kontrol bantları 10 yoğunluk değerlerini normalize. </li></ol></li></ol> IRF5 İnhibisyon sonra İltihaplı Hücre Sayıların 5. Değerlendirme <ol><li> Standart bir scruffing tekniği ile veya PBS ile deri altından 27 gauge iğne ile, PBS (1 mg / kg / gün) ile seyreltilmiş IRF5D yönetme başına TSK / + ve 21 gün C57BL / 6J fareler. </li><li> izofluran (% 5) ile fareler anestezi ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. sternum boyunca göğüs açık keserek kalbini tüketim. forseps ile kalbi yukarı kaldırın ve kalp kaldırmak. Yapış dondurmak ve analize kadar eksize kalpleri saklayın. </li><li> Tiss donmuş kalpleri monteKullanılan kriyostat uygun vi sahipleri. immünohistokimya için bir kriyostat üzerinde 10 mikron kalınlığında donmuş kesitler halinde kesilmiştir. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca fosfat tamponlu tuz içerisinde% 1 paraformaldehit ile dondurulmuş bölümler düzeltildi. 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton-X 100 ile bölümleri geçirgenliği. Dikkat: Paraformaldehyde düzenlenmiş kanserojen ve dikkatle ele alınması gerekmektedir. </li><li> anti-tavşan CD64, bir monosit / makrofaj işaretleyici 1 seyreltin: 200 PBS içinde. sabit bölümleri için de geçerlidir ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. </li><li> anti-fare NIMP, birincil nötrofil işaretleyici 1 seyreltin: 200 PBS içinde. sabit bölümleri için de geçerlidir ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS ile üç kez slaytlar yıkayın. </li><li> İkincil antikorların anti-tavşan sulandırmak Alexa 488 konjuge ve anti-sıçan Alexa 488 1 konjuge: 200 PBS içinde. </li><li> anti-tavşan Alexa 48 uygula8 konjüge anti-fare Alexa 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bölümlere 488 konjuge sekonder antikor duruma göre. antikor hacmi bölümün boyutuna bağlı olarak değişir. miktar cömertçe bölümü kapsamalıdır. Çoğu durumda hacmi 100 ila 200 ml. </li><li> PBS içinde 1000 seyreltme: 1 bir nükleer boya olarak 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanın. 1 ml PBS içine 1 uL ekleyin ve son yıkama aşamasında DAPI kullanın. Bir kapak kayma sulu montaj medya ekleyin ve slayt üzerine koydu. </li><li> 40X petrol objektif kullanarak konfokal mikroskobu ile floresan işaretli bölümleri analiz edin. Kullanım uyarma CD64 ve NIMP için daha büyük 530 nm 488 ve emisyon dalga boylarını dalga boylarını. DAPI 360 nm ile heyecanlı ve mavi 460 nm&#39;de yayılan edildi. Farklı etiketleme ile (her grupta 3 farklı farelerden, n = antikor başına 10 görüntü) monositler / makrofajlar ve nötrofiller ayırt ve say. sayılan hücrelerin sayısı; ifade eder. </li&gt; </ol> IRF5 inhibisyonu sonra 6. Hücre bağlı damar genişlemesi <ol><li> (- 100 mg / kg 80) / ksilazin (10-12,5 mg / kg) karışımı ile ve bir ketamin ile peptid tedavisiz C57BL / 6J fareler, kontrol TSK / + fareler anestezi. intraperitoneal ketamin / ksilazin karışımı enjekte edilir. elle fare kısıtlamaktadır. <ol><li> 25 göstergesi veya daha küçük iğne kullanın. karın sağ alt kadranda içine iğne takın. iğne kan damarı ya da bağırsak girmemesini sağlamak için enjeksiyondan önce pistonu geri çekin. </li></ol></li><li> anestezi yeterli düzeyde ulaşıldıktan sonra, yatar pozisyonda fare sabitleyin alkol batırılmış gazlı bezle kürk silin ve bir makas göğüs boşluğu açmak ve kalp kaldırmak kullanarak. NOT: eksanguinasyonla fare euthanize ve kan damarlarını keserken, böylece kanama en aza indirmek damarsal basıncı azaltarak daha kolay diseksiyonu yapacaktır. <ol><li> cilt usin açınçenenin öne doğru yatan dokuları rahatsız değil için makas ga çifti, özenle çene kemiğine göğüs yanal kadar kesim. </li><li> etrafında yumuşak dokuyu kaldırarak facialis arteri teşrih. </li><li> Dikkat: MOPS tampon kalmış maruz doku tutarken facialis arter üzerinde gemi veya römorkör zarar vermeyin (2.0 mM CaCl2 · 2H 2 O, 0.02 mM EDTA, 5.0 mM glukoz, 4.7 mM KCI, 1.17 mM MgSO 4 · 7H 2 O, 3,0 mM MOPS, 145 mM NaCI, 1.2 mM NaH 2 PO 4 · H2O, 2.0 mM pirüvik asit) kuruma önlemek için. binoküler stereo zoom diseksiyon mikroskobu (45x için 3.5x büyütme) ve fiber optik ışık kaynağı altında gerçekleştirin. </li></ol></li><li> facialis arteri izole edin. <ol><li> arter kesilecektir nerede ilk çatallanma ve distaline facialis proksimal kavrayın. ebeveyn arter, eksternal karotid arterden artere kesin. facialis Arterie kaldırve IRF5D tedavi olmadan kontrol farelerinde, Tsk / + farelerin s. </li><li> hala forseps arter tutarken, iki şube herhangi kesilmemiş çevresindeki doku tespit ve kopmuş edilebilir ise gemi nazikçe kaldırdı sağlayan, facialis geliyor kesti. </li><li> çatallanma gemiyi kurtarmak için hem kızı arterleri kesme ulaşana kadar bu şekilde devam edin. kalp kaldırmasını vaskülatürde rahatlamış basınç nedeniyle kesme önce gemi sıkıştırmak için gerek yoktur. Diğer facialis arter disseke ve izole iken MOPS tamponunda bir kap yerleştirin. </li><li> 175 mikron - 125 terminal çapa sahip cam pipetler üzerine onları bağlayarak damarları cannulate. MOPS tamponu ile cam pipetler ve tampon rezervuarları önyükleyebilir. Dikkat: pipetler oluşumunu hava kabarcıklarını önleyin. </li><li> Oftalmik sütür ile pipetler üzerine damarları kravat. </li></ol></li><li> ters triocular MICR damar odaları monteBir video kamera eki ile Oscope. gemilerin ekran ölçümleri için bir video kumpas ölçüm sistemi üzerinden video çalıştırın. 20 <ol><li> iki aşamalı bir süreç içinde basınç. İlk olarak, 20 mmHg basınca eşit kap üzerindeki bir yükseklikte MOPS doldurulmuş rezervuarlar, el teknesine rezervuar hatlarında musluk vanalarını açın ile. bağları ve çevresinde geminin uzunluğu aşağı sızıntı işaretleri için gemi kontrol edin. İkincisi, 60 mmHg rezervuarları yükseltmek ve gemi reinspect. </li><li> 60 mmHg basınç sonra kaplar, 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. </li></ol></li><li> 3.0 x 10 -8 10 7 M U46619 - 1 kullanılarak maksimum çapının% 75 - asetilkolin (10 -7 M -4 10) yanıt olarak damar genişlemesini belirlemek üzere, bir çapa 50 kap preconstrict. bırakıldıktan sonra kabı, 6 dakika için stabilize edilmesi 2 dakika süresi adımda banyosuna asetilkolin ekleme şekildebanyoda nihai konsantrasyonlar 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 vardır. Her üç grupta da vazodilatasyon ölçün. </li></ol> Kardiyak Ekstrasellüler Matrix 7. İzolasyonu <ol><li> ve izofluran (% 5) ile peptid tedavi olmadan C57Bl / 6J kontrol fareleri ve Tsk / + fareler anestezi ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. sternum boyunca göğüs açık keserek kalbini tüketim. forseps ile kalbi yukarı kaldırın ve kalp kaldırmak. </li><li> bir kap içine çıkarıldı kalpleri koyun ve 15 ml hipertonik% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) ilave edin. % 1 SDS çözeltisine bir karıştırma çubuğu ilave edilmesi ve bir karıştırma plakası üzerinde kabı koyarak hücreleri parçalamak için oda sıcaklığında 18 saat süre ile% 1 SDS çözeltisi içinde kalpleri çalkalayın. Dikkat: hipertonik çözelti içinde çok uzun süre bırakılırsa hücre dışı matriks parçalanır farkında olun. kalpleri hipertonik çözelti içinde yeterince uzun ajite değilse Tersine, daha sonra hücrelerin düzgün olmazçözülür ve beherde kalan hücre döküntüsü olacaktır. </li><li> 15 ml% 0.5 Triton X-100 içinde, 30 dakika boyunca yıkanır. Daha sonra 15 ml PBS ile 15 dakika boyunca yıkanır. tek tek her kalbi Decellularize. </li><li> sıvı nitrojen içinde hücre dışı matris ek bileşen dondurma ve önceden soğutulmuş havan ve havan tokmağı ile dondurulmuş kardiyak hücre dışı matrisi powderize. </li><li> PBS% 1 antibiyotik ihtiva eden toz haline getirilmiş bir matris süspansiyonu yapın. Çoğu durumda ilave hacmi 300 uL olan. yüksek ayarında buz üzerinde 60 sn - 30 süspansiyon sonikasyon. NOT: Numune soğuk tutar çok önemlidir. Süspansiyon nedeniyle yüksek protein glikan içeriği çok viskoz olduğunu unutmayın. </li><li> Bir Bradford tahlili kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. NOT: süspansiyon anti-biyotik ve anti-mantar olduğundan emin olun. Penisilin / Streptomisin en yaygın olarak kullanılan ve tavsiye edilir. </li></ol> Immunohistochemist Nükleer Translokasyon 8. Değerlendirmery <ol><li> kat yemekleri ve slaytlar 20 ug PBS kardiyak hücre dışı matris / ml bir son konsantrasyon kullanımı. kardiyak hücre dışı matris kaplama için 100 mm tabak içine çözeltisi ve bir slayt üzerine nihai hücre dışı matris çözeltisi 150 uL pipetleyin 500 uL. </li><li> Kültür neonatal kalp miyositleri sıçan 24 saat boyunca 50 ug / ml arasında bir konsantrasyonda IRF5D ekleyerek IRF5 inhibe eder. Tedavi edilmeyen miyosit kültürleri kontrol bırakın. </li><li> çekirdek kullanarak Immünofloresan sitoselden IRF5 kaçakçılığı değerlendirmek ve konfokal mikroskobu ile analiz edin. , IRF5 yeşil etiketleme belirlemek çekirdeğin mavi DAPI leke tespit </li><li> birincil anti-IRF5 antikor uygulayın. PBS içinde 200 seyreltme: Primer antikor, bir 1 kullanılmıştır. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin slaytlar ve üç 5 dakika Yıkama adımları ile takip edin. İkincil antikor Alexa 488-işaretlenmiş keçi anti-fare IgG antikoru idi. </li><li> Sulandırmak ikincil antikor 1: 1,000 diPBS içinde dökülmesinden. 37 ° C&#39;de 30 dakika için ikincil antikor inkübe edin. DAPI ile nükleer leke elde edin. PBS 1000: DAPI 1 seyreltin. 5 dakika boyunca slaytlar 3 kez toplam yıkayın ve üçüncü ve son yıkama adımına DAPI ekleyin. </li><li> Daha önce olduğu gibi konfokal mikroskopi ve çekirdeklerde ölçü floresan ve sitoplazmada kullanarak yakalama kaçakçılığı 10 nitelendirdi. , IRF5 yeşil etiketleme belirlemek çekirdeğin mavi DAPI leke tanımlar. Onlara yeşil etiketleme ile mavi çekirdekleri sergileyen hücreler çekirdeğe sitoplazmada trafiğe IRF5 aktif içerir. IRF5 aktif değil yeşil etiketleme sitoplazmada bulunur. </li><li> 40X petrol objektif kullanarak konfokal mikroskobu ile floresan işaretli hücrelerin analiz. IRF5 için daha büyük 530 nm 488 nm ve emisyon dalga boylarında bir eksitasyon dalga boyu kullanın. 360 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve DAPI görüntülenmesi için 460 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu kullanın. </li></ol><ol><li> içinde ve gruplar arasında tekrarlanan ölçümler için varyans (ANOVA) analizi yapın. Öğrenciler t-testi Bonferroni değişiklik ile ANOVA izleyin. ortalama standart hata gibi verileri ifade eder. </li></ol>

<ol>
	<li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+interferon+regulatory+factor+5+(IRF5)+expression+in+human+ductal+carcinoma+correlates+with+disease+stage+and+contributes+to+metastasis.">Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).</li><li>Dideberg, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insertion-deletion+polymorphism+in+the+interferon+regulatory+Factor+5+(IRF5)+gene+confers+risk+of+inflammatory+bowel+diseases.">An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases.</a> Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).</li><li>Graham, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+haplotype+of+interferon+regulatory+factor+5+(IRF5)+regulates+splicing+and+expression+and+is+associated+with+increased+risk+of+systemic+lupus+erythematosus.">A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus.</a> Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).</li><li>Krausgruber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF5+promotes+inflammatory+macrophage+polarization+and+TH1-TH17+responses.">IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses.</a> Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).</li><li>Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+5+in+human+autoimmunity+and+murine+models+of+autoimmune+disease.">Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease.</a> Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).</li><li>Mayes, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochip+analysis+identifies+multiple+susceptibility+Loci+for+systemic+sclerosis.">Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis.</a> Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).</li><li>Dimitroulas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-and+Macrovascular+Treatment+Targets+in+Scleroderma+Heart+Disease.">Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease.</a> Curr Pharm Des. , (2013).</li><li>Botstein, G. R., LeRoy, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+heart+disease+in+systemic+sclerosis+(scleroderma):+advances+in+clinical+and+pathologic+features,+pathogenesis,+and+new+therapeutic+approaches.">Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches.</a> Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).</li><li>Oram, S., Stokes, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heart+in+scleroderma.">The heart in scleroderma.</a> Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4F+decreases+IRF5+expression+and+activation+in+hearts+of+tight-skin+mice.">4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice.</a> PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).</li><li>Steen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heart+in+systemic+sclerosis.">The heart in systemic sclerosis.</a> Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).</li><li>Deshpande, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCSB+Protein+Data+Bank:+a+redesigned+query+system+and+relational+database+based+on+the+mmCIF+schema.">The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema.</a> Nucleic Acids Res. 33, D233-D237 (2005).</li><li>Concepcion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+biomolecular+interactions+using+biolayer+interferometry+for+kinetic+characterization.">Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).</li><li>Matthew, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+biosensor+technologies+in+drug+discovery.">Current biosensor technologies in drug discovery.</a> Drug Discovery. , 69 (2006).</li><li>Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+MED-SuMo+applications.">A review of MED-SuMo applications.</a> Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).</li><li>Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mucosal+immunization+of+recombinant+adenovirus-based+vaccine+expressing+F1+protein+fragment+induces+protective+mucosal+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+infection.">Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection.</a> Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).</li><li>Frenzel, D., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Titration+Series+with+Biolayer+Interferometry.">Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry.</a> PloS one. 9 (9), 106882 (2014).</li><li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-4F,+an+apolipoprotein+A-1+mimetic,+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease.">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Bauer, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+phosphorylation+and+protein-protein+interactions+revealed+by+loss+of+function+and+gain+of+function+mutants+of+multiple+serine+phosphorylation+sites+in+endothelial+nitric-oxide+synthase.">Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase.</a> J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).</li><li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice.">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).</li><li>Hoogenboom, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+phage+display+technology+and+its+applications.">Antibody phage display technology and its applications.</a> Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).</li><li>Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+colorimetric+assay+for+cell+proliferation+and+viability+utilizing+the+tetrazolium+salt+XTT.">An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT.</a> J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).</li><li>Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+3-(4,+5-dimethylthiazol-2-yl)-2,+5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+(MTT)+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays.">Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-4F,+an+apolipoprotein+A-1+mimetic,+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease.">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li><li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+D-4F+on+vasodilation,+oxidative+stress,+angiostatin,+myocardial+inflammation,+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice.">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li><li>Roy, S., P, P., Mavragani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF-5+-+A+New+Link+to+Autoimmune+Diseases.">IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases.</a> Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. , 35 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Gol Tsk / + farelerin kalplerinde inflamasyon, fibrozis, ve vasküler fonksiyon üzerine IRF5 rolünü aydınlatmak için bir IRF5 inhibitörü tasarlamak oldu. Bulgular IRF5D proliferasyonu veya apoptosisi teşvik etmediğini bulunmaktadır. Ayrıca, iltihabın azalır ve damar fonksiyon geliştirildi. Bu veriler IRF5 Tsk / + farelerin kalp inflamasyon ve fibrozis gelişiminde önemli bir mekanik rol oynadığını düşündürmektedir ve bir tedavi hedefi olarak hizmet potansiyeline sahip olduğunu. <p class="jove...

<html> hücre büyümesi ve hücre ölümü, bağışıklık karşılıklarının düzenlenmesinde, interferon ayarlayıcı faktör transkripsiyon faktörü ailesinin rolü için esastır. IRF5 tip 1 arasında, bağışıklık karşılıklarının düzenlenmesinde, bir enflamatuar teşvik yanıt ve tip 2, bir bağışıklık tepkisi hedefleme doku onarımı için çok önemli olarak vurgulanır. IRF5 kanseri 1 ve otoimmünite, 2, 3, 4, 5 anahtardır. Sıkı cilt fare (Tsk / +) nedeniyle fibrillin-1 genindeki bir mutasyon çoğaltma doku fibrozis ve skleroderma için bir modeldir. sıkı cilt Bu mutasyon sonuçları ve bağ dokusu bir artış. Bu fareler, miyokardiyal inflamasyon, fibrozis ve son olarak, kalp yetmezliği 5, 6, 7 geliştirilmesi&gt; 8, 9. Skleroderma Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 6 yaklaşık 150.000 hasta etkileyen bir otoimmün fibrotik bozukluktur. Bu hastalığın diğerlerinden ayıran kalp 7, 8, 9, 10, 11 dahil olmak üzere, iç organların fibroz bulunmaktadır. Çalışmanın doğası inhibitör peptid tasarımını talep etti. yazılım yaklaşımı bir faj ekranı kullanarak geleneksel bir yaklaşım üzerinde seçildi. yazılım yaklaşımı daha kolay ve daha az zaman alıcıdır. RCSB veri bankası, uygun bağlanma bölgelerini 12 tanımlamak için kullanılır. rekombinant protein ile yeni tasarlanmış peptid etkileşimini incelemek ve bağlayıcı parametreleri üzerinde odaklanmak, bir teknik denilen biolayer enterforemetre kullanıldı. Biolayer interferometri, bir biyosensor göre TECHNIQ olanue bir biyosensör ve bağlayıcı bir örneği kullanarak bağlanma afinitesi, dernek ve ayrılmayı belirler. biyosensör floresan, luminescently, radyometrik ve kolorimetrik etiketli olabilir. Ölçüm kütle eklenmesi veya tükenmesi birleşme ve ayrışma 13, 14 benzer dayanır. Bu çalışmanın amacı, miyokard inflamasyon ve fibrozis IRF5 rolünü anlamak oldu. hedef doku fibrozis ve skleroderma gelişiminde IRF5 rolünü anlamak için oldu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Triton X 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100- 100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bardford reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23200</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensors</td>
			<td>Forte-Bio</td>
			<td>MR18-0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD64 (H-250)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>sc-15364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellEvent Caspase-3/7 Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher/Life Technologies</td>
			<td>C10427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3580</td>
			<td>Promega</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D-1306</td>
			<td>1:1000 dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti rat Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21208</td>
			<td>1:1000 dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL plus</td>
			<td>GE healthcare/Amersham</td>
			<td>RPN2133</td>
			<td>After a lot of trial and error we came back to this one</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti rabbit Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:1000 dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP&#160; anti-goat</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>sc-516086</td>
			<td>!:10000 dilution in TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP donkey anti-mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>sc-2315</td>
			<td>1:10000 dilution in TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICAM-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>sc-1511</td>
			<td>1:200 dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRF5 antibody (H56)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>sc-98651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro plate reader Elx800</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIMP neutrophil marker</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>sc-133821</td>
			<td>1:200 dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED</td>
			<td>Forte Bio</td>
			<td></td>
			<td>protein-protein binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide design&#160; Medit SA software</td>
			<td>RCSB.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant IRF5 protein synthesis</td>
			<td>TopGene Technologies</td>
			<td></td>
			<td>protein expression, synthesis service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Pharmacy</td>
			<td></td>
			<td>Schedule III controlled substance, presciption required&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MedVet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights</td>
			<td>Am Scope</td>
			<td>SKU: SM-1TSX-L6W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Desalting Columns</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2161515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Media EBM Bullet kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3124</td>
			<td>kit contains growth supplemets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIA-100K</td>
			<td>&#160;Boeckeler Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% TGX gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5671081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MedSuMo software</td>
			<td>Medit, Palaiseau, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vasodilation of isolated vessels and the isolation of the extracellular matrix of tight-skin mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

Şekil 1 &#39;de gösterilen sonuçlar, bir peptid tasarım şeklini göstermektedir. Şekil 1, sol üst, kinazlar bir dizi ile fosforile olduğu IRF5 bölgeyi (2 sarı oklar arasında, amino asitler (aa) 425-436) gösterir. Şekil 1, sağ üst, IRF5 en fosforile etki bağlayan sarı oval gösterir. 3DSH dimerik yapı Helix 2 (aa303-312) solundaki bir yarık ya da vadi gözlemlemek için döndürüldü. IRF5 ve fosfor-kuyruk alanı tam o...

Watch this Scientific Journal Video about Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice at JoVE.com

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

İzole Kapların vazodilatasyon ve Sıkı cilt Fare Ekstraselüler Matrix İzolasyonu

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

vasodilation-isolated-vessels-isolation-extracellular-matrix-tight

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin. We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. 

Video: Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, function, and fate in general. Although increasingly more adherent cell types&#39; responses to matrix stiffness have been characterized, how adherent cells&#39; susceptibility to bacterial infection depends on matrix stiffness is largely unknown, as is the effect of bacterial infection on the biomechanics of host cells. We hypothesize that the susceptibility of host endothelial cells to a bacterial infection depends on the stiffness of the matrix on which these cells reside, and that the infection of the host cells with bacteria will change their biomechanics. To test these two hypotheses, endothelial cells were used as model hosts and Listeria monocytogenes as a model pathogen. By developing a novel multi-well format assay, we show that the effect of matrix stiffness on infection of endothelial cells by L. monocytogenes can be quantitatively assessed through flow cytometry and immunostaining followed by microscopy. In addition, using traction force microscopy, the effect of L. monocytogenes infection on host endothelial cell biomechanics can be studied. The proposed method allows for the analysis of the effect of tissue-relevant mechanics on bacterial infection of adherent cells, which is a critical step towards understanding the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria. This method is also applicable to a wide variety of other types of studies on cell biomechanics and response to substrate stiffness where it is important to be able to perform many replicates in parallel in each experiment.

We have developed a multi-well format polyacrylamide-based assay for probing the effect of extracellular matrix stiffness on bacterial infection of adherent cells. This assay is compatible with flow cytometry, immunostaining, and traction force microscopy, allowing for quantitative measurements of the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.

İzole Kapların vazodilatasyon ve Sıkı cilt Fare Ekstraselüler Matrix İzolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler