Name: isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells at JoVE.com

Bu eser (PAL ve K99HL116769 AJT için R01HL056046) Sağlık Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve Nationwide Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü (PAL ve AJT kadar) oldu.

Etik Beyanı: Bu çalışma Sağlık Rehberinin National Institutes göre gerçekleştirilmiştir ve Nationwide Çocuk Hastanesi Kurum Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. 1. Hazırlık / ayarlayın Not: Bu izolasyon tekniği bir halka standında yan yana yerleştirilmiş iki Langendorff ısıtma bobinleri gerektirir ve bir dolaşan su banyosu paralel bağlanmış. <ol><li> su banyosu dolaşım açın ve Langendorff kanülün ucunda 33-34 ° C&#39;lik bir nihai sıcaklığa ulaşmak için sıcaklığı ayarlamak (bu, kullanılan su banyosu nedeniyle 6-7 ° C kaybı 40 ° C olarak ayarlanır ayarlamak boru boyunca sıcaklık). perfüzyon pompaları açmak ve 0.5 ml / dak perfüzyon hızını ayarlamak. <ol><li> otoklavlanmış ultra saf su ve 100 ml% 70 etanol, 50 ml, her yıkama su ceketli ısıtma bobinleri iki ekli boru ve 25 gauge kanül temizleyin. </li><li> ısıtma bobinlerini temizleyinve bir şırınga ile hava basma fenol kırmızısı olmadan Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 10 ml ile yıkanır. ısıtma bobinleri ve tüp HBSS bırakın. </li><li> boru kırmızı fenol olmadan oda sıcaklığında HBSS ile dolu bir steril 10 mi Luer-kilit şırınga takın. Bu olumsuz VSMC izolasyonu etkisi sindirim sırasında hava emboli neden olabileceğinden HBSS dolu bir şırınga takarken herhangi bir hava kabarcığı boru ve ısıtma bobinleri içinde sıkışıp emin olun. </li></ol></li><li> fenol kırmızısı olmadan buz HBSS ile dolu başka bir steril 10 ml şırınga ısıtma bobinleri ve yerden 25 gauge kanül çıkarın. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde bu tutun. Diğer kanül için tekrarlayın. </li><li> Enzim sindirimi çözeltisi hazırlayın. <ol><li> Dijestiyon çözeltisi, 75 ml 300 U / ml bir nihai konsantrasyon elde etmek için spesifik pek çok sayıda uygun kolajenaz tip 2 tartılır. </li><li> fenol kırmızısı ile HBSS, 75 ml kolajenaz çözülür. Daha sonra, 0, 1.5 ml ilave.1 Mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve karışım, 1 M CaCI2 75 ul. </li></ol></li><li> Hemen sindirim çözeltisi kullanılarak halinde, 37 ° C&#39;ye ısıtınız. Aksi takdirde, en fazla 6 saat süre ile 4 ° C&#39;de yerleştirin. Bu çözelti, her gün taze yapılmalıdır. </li><li> durak çözüm / kaplama ortamını hazırlayın. <ol><li> 100 mi, yüksek glikoz (4.5 g / L), DMEM 500 ml FBS, primocin L-glutamin, 5 ml, esansiyel olmayan amino asitler 5 ml HEPES 5 mi, 1 ml ısı ile inaktive edilmiş ekleyin. Filtre sterilizasyonu önerilir. </li><li> Kısım 4 ° C&#39;de, A1-A6 sayılı on iki 15 ml konik tüpün her birine durdurma çözeltisi, B1-B6, ve yer 6 mi. Kısım 37 ° C inkübatör içinde 50 ml konik ve yerine durdurma çözeltisi 50 mi. Not: Gerekirse bu adım ayrıca önceki izolasyon gün hazırlanabilirler. Bu durdurma çözeltisi hücre izolasyonu, aşağıdaki kaplama ortamı olarak kullanılır. </li></ol></li><li> 30 G iğne ile donatılmış iki adet 1 ml&#39;lik şırınga hazırlayınheparin, 100 ul (1.000 birim / ml). </li><li> 5-0 cerrahi ipek bir 5 cm parça kesin. Diğer iki kat daha uzun bir ucu ile cerrahi ipek gevşek bir yukarıdan aşağı düğüm. 25-gauge kanül üzerine yerleştirin, fakat sıkmayın. Diğer 25 G kanül için tekrarlayın. </li><li> Steril, buzla soğutulmuş, HBSS olmayan fenol kırmızısı, 2 ml olan dört adet 35 mm steril Petri kapları (# 1-4) doldurun. buz üzerinde tutun. </li></ol> 2. Ötenazi, Kalp İzolasyon ve kanülasyonu <ol><li> Kalp izolasyondan önce, durdurma çözeltisi sindirim çözümü ve 50 ml konik sıcak olduğundan emin olun. bir halka standında bir büret kelepçe (ya da halka standı kelepçe) buz ve yerden ekli 25 G kanül ile HBSS dolu şırıngayı çıkartın. </li><li> % 3 isofluorane kullanarak fareler anestezi. Fare, her arka bacak üzerinde bir ayak dokunuşuyla anestezi onaylayın. bacak seyirmesi, fare henüz çok 1 dakika bekleyin ve ayak dokunmatik tekrar anestezi değildir. </li><li> kürk a çıkararak juguler ven Açığamakasla boyun anterior nd cilt. Sonra, dikkatle juguler ven çevreleyen herhangi bir yağ çıkarmak için forseps kullanabilir. yağ ayrılmasından sonra, yavaş yavaş, heparin, 100 ul (1.000 birim / ml) enjekte edilir. aşırı kanama önlemek için ven üzerinde bir cerrahi sünger yerleştirin. </li><li> 1 dakika sonra, açık göğüs ilk brakiyosefalik şubesi aracılığıyla sağlam çıkan aorta tutmak için emin olun, kavisli bir forseps ile kalbi, asansör kalp maruz ve makas kullanarak tüketim için. Hemen fenol olmadan 35 mm çanak içine kırmızı buz HBSS ile (# 1) kalbi yerleştirin ve durulayın. Not: Bir diseksiyon kapsamı kullanarak aşağıdaki 4 adımı uygulayın. </li><li> ucu çanak 2. sadece buz gibi soğuk HBSS yüzeyinin altında bulunan ve açıkça mikroskop aracılığıyla görülebilir, böylece halka üzerine monte edilmiştir 25 G kanül 45 ° açıyla durmak yerleştirin. çanak # 2 kalbini aktarın. </li><li> Dumont forseps kullanarak, hafifçe p künt diseksiyon ile aşırı adipoz kaldırarak aorta maruzRevent delme veya aort yırtılması. Sonraki 25 G kanül üzerinde aorta slayt forseps kullanabilir. </li><li> Bu nedenle retrograd perfüzyon vana bütünlüğünü tehlikeye olacak ve yakın değil, aort kapak ötesinde aort, aşağı doğru kanül Kılavuzu. kanül yerleştirildikten sonra, aorta üzerinde önceden bağlanmış ipek kaydırın ve sıkın. kalbi korumak için aort etrafında bir kare düğüm oluşturmak için ikinci bir düğüm. </li><li> Aort güvenli bağlı sonra, yavaşça 25 G kanül takılı şırınga buz HBSS ile koroner dolaşıma kalan kan yıkayın. Aşırı koroner basıncı önlemek için çok fazla itmek değil özen gösterin. Sadece çok yavaş ve nazik floş floş tamamlamak için gereklidir. Kaçak serbest aort kanülasyon de bu nazik temizleme sırasında görülebilir. </li><li> HBSS akışını başlatmak için perfüzyon pompası açın. dikkat ederek, HBSS dolu şırınga (ekli kalp ile) 25 G kanül kaldırHBSS ile dolu kanül göbeğini tutmak ve sıcak HBSS dolu ısıtma bobinleri bağlayın. 8 dakika boyunca 0.5 ml / dk&#39;lık bir oranda perfüzyon pompası ile kalbin perfüzyon başlayın. </li><li> ilk kalp kanüle ve sistem üzerinde perfüze olan sonra tekrar ikinci kalp için 2,1-2,8 adımları. Bu izolasyonların nedenle dikkatli planlama ve zamanlama gereklidir her kalp için sendeleyerek edilecektir. </li></ol> 3. Sindirim <ol><li> HBSS ile yıkama işleminden sonra, önceden ısıtılmış sindirim çözeltisi, 10 ml ile doldurulmuş bir pompa şu anda 10 mi HBSS şırınga değiştirin. 0.5 ml / dak hızında 12 dakika boyunca sindirim çözeltisi, her bir kalp serpmek. Bu herhangi bir kalıntı kan ve endotel hücrelerini içerecek bu ilk sindirim kaynaklanan fraksiyonları toplamak etmeyin. </li><li> 12 dakika sonra, 0.4 ml / dk perfüzyon oranını değiştirmek, soğuk durdurma solut dolu (her sindirim için birinci ya da ikinci kalp karşılık gelen boru A1 ve B1), 15 ml&#39;lik bir konik yerVSMC zenginleştirilmiş perfüzat toplamaya başlamak için kalbin altında bir buz kovası içine iyon. </li><li> 15 dakika sonra, şimdi her iki fraksiyonların toplanmasından sonra, 10 dakika boyunca 89 xg boru A2 ya da B2 ve döner konik tüp A1 ve B1 toplama konik olarak değiştirin. Pompa üzerinde sindirim çözeltisi ile doldurulmuş şırınga çözeltisinin en az 1 ml olduğunda, sindirim çözeltisi taze doldurulmuş 10 ml şırınga ile değiştirin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, her toplama tüpünden aspire süpernatant, yaklaşık 0,5 ml bırakarak. Sıcak durdurma çözeltisi (ya da kaplama ortam) 2 mL A1 süspanse pelet. gevşek kapaklı 37 ° C inkübatör B1 tüp ve yer tüp A1 tüpten tabanda ekleyin. </li><li> Tekrarlayın 90 dakika olmak üzere toplam tahsilat süre kullanılır (A6 ve B6 yoluyla) tüm tüplere kadar 3.3 ve 3.4 adımları tekrarlayın. sindirim 80 dakikada, tüp A6 ve B6, respe bu hücreleri ventrikül içinde sıkışıp olabilecek hücreleri temizlemek ve toplamak için kalp tepe kesip açmakctively. Not: Bazen kalp 90 dakika zaman noktası öncesinde kanül kapalı düşecek. Böyle bir durumda, sindirim çözeltisinin 2 ml&#39;si ile doldurulur, steril bir 35 mm Petri kabı içine kalp ve yer almak. Kalbin tepe kesin ve hafifçe sindirim çözeltisi ile kalbi durulayın. Daha sonra, 50 ml&#39;lik bir konik steril bir 100 um hücre süzgecinden sindirim çözeltisi 2 ml filtre ve tüp A6 ya B6 ekle. </li><li> sonraki tüpleri (A2 ve B2) her dönüşte sonra, (A1 ve B1 kombine) Önceki toplama tüpüne yeniden süspanse VSMC&#39;lerde ekleyin. Ayrıca, pompa sindirim çözüm tükendi ve sindirim boyunca gerekli 10 ml şırınga geçiş izin özen gösterin. </li><li> Hortum birleştirildikten sonra, 10 dakika boyunca 89 xg VSMC zengin süspansiyon santrifüj. </li><li> mümkün olduğunca toplama tüpleri aspire kadar süpernatant. bir 35 mm kültür çanak medya ve plaka kaplama 2 ml kalan pelletini. Yeri kültür çanak i24 saat boyunca 37 ° C inkübatör n. </li></ol> 4. Hücre Kültürü Not: biyogüvenlik kabini kalan adımları tamamlayın. <ol><li> 24 saat sonra, yavaşça kaplama medya aspire. Kültür normalde enkaz büyük miktarda olacaktır. Hücreleri yıkamak için sıcak, steril PBS 2 ml ekleyin ve bir saat yönünde hareket dönerken hafifçe iki parmakla karşı çanak dokunun. </li><li> 360 ° döndürdükten sonra, PBS aspire ve ikinci kez tekrarlayın. PBS aspire ve steril, ılık PBS başka bir 2 ml ekleyin. plaka üzerinde hiçbir enkaz az olduğundan emin olmak için mikroskop altında kültür çanak kontrol edin. Hücre izdiham bu anda belirlenebilir. </li><li> enkaz kültür kaplarına kalırsa, adımı 4.2 tekrarlayın. kültür çanak enkaz açık ise, PBS aspire ve sıcak kaplama medya 2 ml ekleyin. </li><li> 24 saat sonra, kültür nihai kalıntıları veya ölü hücrelerin çıkarılması için sıcak, steril PBS ile tekrar yıkama hücreleri. PBS ve p aspirehücreler üzerinde sıcak kaplama medya başka bir 2 ml dantel. </li><li> Her gün hücreleri üzerinde kontrol edin ve taze ısınmış kaplama medya ile her 48 saat beslenirler. Bu noktada, hücreler standart hücre kültür deneyleri için de kullanılabilir. prosedür mükemmel kadar 7 gün sürebilir, ancak VSMC, kaplama sonrası yaklaşık% 80 birleşen 4-5 gün olmalıdır. sonraki pasajlar yarma, 1 maksimum kullanıyorsanız: 4 35 mm yemekleri (ya da kültür kaplarına karşılaştırılabilir bir alana). </li></ol>

<ol>
	<li>Katz, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arterioles+in+type+2+diabetic+(db/db)+mice+undergo+a+distinct+pattern+of+remodeling+associated+with+decreased+vessel+stiffness.">Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness.</a> Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).</li><li>Husarek, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiotensin+receptor+blocker+losartan+reduces+coronary+arteriole+remodeling+in+type+2+diabetic+mice.">The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice.</a> Vascul Pharmacol. , (2015).</li><li>Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coronary+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+A1+adenosine+receptor-knockout+mice.">Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).</li><li>Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+attenuates+contraction+of+primary+cultured+rat+airway+smooth+muscle+cells.">Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+two-phase+Ca2++release+and+apoptosis+controlled+by+TRP-ML1+channel+activity+in+coronary+arterial+myocytes.">Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).</li><li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease.">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).</li><li>Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SM22+alpha,+a+marker+of+adult+smooth+muscle,+is+expressed+in+multiple+myogenic+lineages+during+embryogenesis.">SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis.</a> Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function.">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+phenotype+and+function+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells.</a> J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).</li><li>Souza-Smith, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenteric+resistance+arteries+in+type+2+diabetic+db/db+mice+undergo+outward+remodeling.">Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling.</a> PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).</li><li>Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+of+coronary+arteries+in+36+species+of+mammalian+from+mouse+to+giraffe.">Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe.</a> Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Bu çalışmanın amacı, fare kalplerinden pürüzsüz koroner damar verimini artırmak için mevcut hücre izolasyonu protokolleri adapte oldu. Vasküler düz kas biyoloji öncü çalışmaların çoğu kültürlenmiş sıçan aortik düz kas hücreleri ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar VSMC büyüme, göç ve hipertrofisi 7 kontrol moleküler mekanizmaları temel bilgi sağladı. Alan ilerledikçe Ancak, VSMC fenotip ve işlevini vasküler yatakta özel bir dizi faktöre göre kontrol edilmiştir ortaya çıkmıştır. Örneğin, çevresel damarlarda göre, koroner arterler, farklı fonksiyonel tepkileri gösterir yaralanma cevaplarda artış belirgin belirtileri sergileyen ve kanal, reseptörler ve sinyal molekülleri 10,11 benzersiz bir dizi gösterir. gemi sözleşme miyokardiyumun sistol sırasında sıkıştırılmış çünkü koroner yatak da, eşsiz bir hemodinamik kuvvetlere maruz kalmaktadır. Bizim son çalışma bu Coron göstermektedirtip 2 diyabetli db / db farelerde li mikrovasküler remodeling aort ve mezenterik direnç damarlarının 1,12 farklıydı. Düşük geçiş VSMC&#39;Ier gerekli kullanarak in vitro çalışmalar, bu farklılıkların hesaba moleküler mekanizmaları anlamak için. Izole ve fare aort veya mezenterik arter VSMC&#39;lerde kültüre farklı ve köklü çeşitli yöntemler olmasına rağmen, şu anda, fare koroner dolaşım 3&#39;ten VSMC&#39;Ierin izolasyonu yayımlandı sadece bir çalışma var. Bu protokol, koroner dolaşım primer fare VSMC&#39;Ierin izolasyonu için geliştirilmiş bir yöntem ortaya koymaktadır. Bizim protokol gevşek Teng ve arkadaşları tarafından yayımlanan tek dayanmaktadır. 3. orijinal tekniğe başvuran modifikasyonlar zenginleştirilmiş nüfus ve VSMC&#39;lerde yüksek verim sağlar. Bu sonuçlara ulaşmak için gerekli olan kritik adımlar kanül doğru yerleştirilmesini içeren, nazik floşKalbin ing aşırı kan kaldırmak ve sindirim sonunda kalbin apeks kesme. üç, kanül yerleştirme büyük önem taşımaktadır. Koroner dolaşım aort kapak hemen distal koroner çıkımının gelen perfüze. Bu nedenle, sol ventrikül içine kanül yerleştirilmesi ile supap bütünlüğünün bozulması zayıf koroner perfüzyonu ve uygulanabilir VSMC&#39;Ierin sayısı belirgin bir azalmaya neden olacaktır. Koroner dolaşımın nazik yıkama kültürü için kullanılan son pelet aşırı kan kaldıracak değil sadece, aynı zamanda kanül doğru yerleştirme elde edilir belirleyecektir. Son olarak, sindirim sırasında, bazı VSMC böylece hücreleri serbest ve kaplama bir daha izdiham verecektir sindirim sonuca apeks kesme, ventriküllerin içinde sıkışıp hale gelebilir. kullanılabilir önemli bir değişiklik 25 G sonda iğne veya Harvard Aparatı fare aort cannul kullanımıİğne kanülü yerine bir. sonda iğne kullanılarak Bununla birlikte, bir iğnenin ucunda top ile koroner ostiumları engellemek için ekstra bakım değil almalıdır. İğnenin ayarı önce perfüzyon gerekiyorsa nazik yıkama adımı ortaya çıkaracaktır. Buna ek olarak, sindirim çözeltisi içinde kullanılan kolajenaz türü uygun VSMC izolasyonu için önemlidir. Tip II kollajenaz saf değil - böyle tripsin, klostripain ve caseinase gibi diğer enzimler içerir. Bu nedenle, soya fasulyesi tripsin miktarı sindirim kullanılan kolajenaz spesifik çok göre ayarlanması gerekebilir sindirim çözeltisine ilave inhibitördür. tekniğin bir sınırlama, tüm koroner dolaşım VSMC izole olmasıdır. Koroner mikrodamarlar odaklanmış Daha önceki çalışmalarda (çapı 80-120 mikron) 1,2, ancak farelerde ana koroner arterler daha büyük (&gt; 160 mikron) 13 vardır. Buna ek olarak, bu tekniknique ayrıca koroner venöz dolaşımı değil, sadece arteriyel dolaşımın hücreleri izole eder. Langendorff tekniği, 100 yılı aşkın bir süredir kullanılmış olsa da, fare genomu manipülasyon daha yeni gelişmeler (örneğin knock-in, knock-out, mutasyonlar) geniş bir uygulama çeşitli güncellenmiş teknik yararlanmak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. izolasyonu ve kültürü sonra, hücreler, farmakolojik maddeler ile viral enfeksiyon ve tedavisi dahil olmak üzere, ek deneyler için kullanılabilir. Genetik olarak tadil edilmiş fareler ve standart hücre kültür ortak kullanımı faregiller koroner dolaşım VSMC&#39;Ierin derin bir inceleme için izin verir.

Bu yöntemin amacı, hücre kültürü ve standart hücre kültürü deneylerinde kullanım için murin koroner dolaşım vasküler düz kas hücreleri (VSMC&#39;Ier) izole etmektir. Biz Diyabette vasküler yeniden moleküler mekanizmaları değerlendirmek için bu tekniği geliştirdi. Biz daha önce diyabet 1 db / db fare modelinde septal koroner arteriyollerde hipertrofik yeniden içe bildirdi. Bağlı murin septum koroner bulunan doku miktarının sınırlı, db / db ve kontrol farelerinde protein değişiklikleri (örneğin, Western blot) araştıran standart deneysel teknikler, en iyi zordur. Buna ek olarak, daha önce anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB), losartan, db / db farelerinde 2 gözlenen yenileme azalttığını göstermiştir. Bu nedenle, koroner dolaşımdan başlıca VSMC&#39;lerde izolasyonu bize daha fazla katk olabilir diyabetik farelerde VSMC fenotip değişiklikleri veya sinyal aktive yolları, araştırmak için izin verirolumsuz koroner arteriole yeniden için ting. Çeşitli çalışmalar değil, her belirli vasküler yatakta daha kemirgen aorta, izole VSMC kullanarak kanonik sinyal yollarını aydınlatmıştır. Bununla birlikte, farklı olabilir, her vasküler yatakta VSMC&#39;Ierin öne vasküler yatak koroner aort belirli yenileme ve db / db farelerinde 1 mezenterik sirkülasyonu göstermiştir. Nedenle, daha iyi bir VSMC&#39;Ierin her set meydana gelen patolojik değişiklikleri anlamak için her vasküler yatakta VSMC&#39;Ierin izole etmek için gereklidir. izole edilmesi ve aort VSMC&#39;Ierin kültürlenmesi için farklı yöntemler bir bolluk vardır. Ancak şu anda, fare koroner dolaşım 3&#39;ten VSMC&#39;Ierin izolasyonu yayımlandı sadece bir çalışma var. Teng ve ark. Fare koroner dolaşım VSMC&#39;lerde izole etmek için bir yöntem bildirmek için ilk oldu; Ancak, önemli ölçüde protokolü değiştirdik onlar da endotel cel izole olarakls. Diğer laboratuarları da Teng ve ark gelen protokolü kullandık. Koroner arter miyositleri ve havayolu düz kas hücreleri 4,5 izole etmek. Biz dahil olan değişiklikler yüksek koroner dolaşım VSMC&#39;Ierin zenginleştirilmiş hücrelerin bir popülasyonu verecektir. İzole memeli kalp veya Langendorff tekniği retrograd perfüzyon Oscar Langendorff&#39;a tarafından 1897 6 yılında kurulmuş ve hala yaygın kardiyovasküler hücrelerin izolasyonu için kullanılmaktadır bugün. Modern fare genetik modifikasyon ilerlemesi ile birleştiğinde Burada sunulan teknik, koroner dolaşımdan VSMC&#39;Ierin moleküler davranış yakın soruşturma için değerli bir araç sağlar.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Fisher</td><td>MT-25-060</td><td></td></tr><tr><td>Primocin - 20 ml</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 10 mM 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut 200 mM - Gibco</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 100 &amp;micro;m nylon mesh</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td><td>Fisher</td><td>12-565-91</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td><td>Fisher</td><td>14-516-124</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type-2&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red)</td><td>Life Technologies</td><td>14170-161</td><td></td></tr><tr><td>5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td><td>Radnoti</td><td>158830</td><td></td></tr><tr><td>11 plus pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water pump</td><td></td><td></td><td>any brand will work</td></tr></tbody></table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

yalıtım ve büyük gemilerden vasküler düz kas hücreleri (VSMC&#39;Ier) kültürü iyi bilinmektedir birlikte, koroner dolaşımdan izole Kültür VSMC&#39;Ier çalışmıştır. Sağlam aort kemerli Kalpler çıkarılır ve sindirim çözeltisi kolajenaz tip II, 0.1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve 1 M CaCI2 300 birim / ml içeren retrograd Langendorff ile perfüze edildi. guruplarına kaplama ortamı içinde yeniden süspansiyon haline, santrifüjle topaklar haline 90 dakika boyunca 15 dakika aralıklarla toplanmış ve doku kültür tabaklarında kaplandı. VSMC&#39;Ier SM22α varlığında α-SMA ve vimentin ile karakterize edilmiştir. Bu tekniği kullanarak ana avantajlarından biri, farelerin koroner dolaşımdan VSMC&#39;lerde izole etmek yeteneğidir. Hücreler kullanılabilir uygulamalar için bazı sınırlar elde edilen hücrelerin küçük bir sayı, izole koroner VSMC köklü hücre kültürü teknikleri ve Assa çeşitli kullanılabilir, ancakys. genetiği değiştirilmiş farelerin VSMC&#39;lerde araştıran çalışmalar yapı-fonksiyon ve vasküler patolojiler ile ilişkili sinyal süreçleri hakkında ayrıntılı bilgi verebilir.

Nedeniyle bizim koroner VSMC izolasyon tekniğinin yeni bir yönüne, hücre izolasyonu saflığını belirlemek için çalıştı. Fare koroner VSMC&#39;Ier ilk yıkamadan sonra kültürdeki hücrelerin morfolojisi dayanarak geçit 2. kendi morfolojisi ve immünofloresan boyama kadar dayanan tespit edildi, izolasyon prosedürü etkili bir kalp miyositleri ve endotel hücrelerini ortadan kaldırır. VSMC&#39;Ier geçit 2 (Şekil 1) kadar onların morfoloji korur. Ancak, adventisyal ve interstisyel fibroblastlar tarafından kirlenme olasılığı vardır. Bu potansiyel şaşırtmak ekarte etmek için, biz SM22α için izole hücreler boyanmış, α-düz kas aktini (α-SMA), VSMC hem pasajlar 1-2 (Şekil 2), 7,8, ve vimentin, bir fibroblast işaretleyici 9 işaretleme kalemler. Bizim hücre izolasyon CD31 yoksun olduğunu Biz de göstermektedir geçit 2. aracılığıyla bu belirteçlerin hiçbir değişiklik gözlenen / PECAM boyama (insan coronBu izolasyon protokolü kullanılarak endotel hücre kirlenme eksikliği gösteren bir pozitif kontrol olarak kullanılan li mikrovasküler endotel hücreleri). Toplu olarak, bizim hücre izolasyon prosedürü, koroner dolaşım VSMC&#39;Ierin bir hemen hemen saf popülasyonu verir ve şu anda daha fazla deney için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53983/53983fig1.jpg" /> Şekil 1:. Parlak saha faz kontrast koşullarında 10X büyütmede görüntülü heterozigot db / db farelerde izole Örnek kültürlenmiş koroner VSMC Yetiştirme koroner VSMC (geçit 2). Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53983/53983fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53983/53983fig2.jpg" /> Şekil 2: Immunoflheterozigoz koroner VSMC&#39;Ierin Kaplama kültürlenmiş koroner VSMC&#39;Ierin uorescence boyama. (db / db) SM22α, α-SMA, vimentin antikorlar ile etiketlenir geçitlerin 1-2 de fare ve CD31 / PECAM. Görüntüler 10X büyütmede çekilen. Önemli bir değişiklik geçişi gözlenmiştir. Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53983/53983fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells at JoVE.com

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Bu protokolün amacı, koroner dolaşımdan fare primer vasküler düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültür teknikleri (VSMC) göstermektir. VSMC&#39;Ier izole edildikten sonra, pek çok standart kültür teknikleri için kullanılabilir.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

isolation-of-murine-coronary-vascular-smooth-muscle-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Görüntüleme.  The Ohio State University College of Medicine.  Bu protokolün amacı, koroner dolaşımdan fare primer vasküler düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültür teknikleri (VSMC) göstermektir. VSMC'Ier izole edildikten sonra, pek çok standart kültür teknikleri için kullanılabilir. 

Video: Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

İzolasyon ve Kemirgen Aort eksizyonu; Kardiyovasküler Hastalığı Çalışmasında Çok Yönlü Tekniği

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Tıp

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Biyoloji

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Nörobilim

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of vasoconstriction and vasorelaxation. After isolating the IPA and VSMCs, the characteristics of vascular responses in physiological and pathological conditions can be assessed in the absence of extrinsic factors such as nerve signals, hormones, cytokines, etc. Thus, the IPA and VSMCs serve as excellent models for studying vascular physiology/pathophysiology, along with various experimental investigations, such as modulation by pharmacological agents, patch-clamp electrophysiological analysis, calcium imaging, etc. Here, we have used a technique for isolating the IPA to investigate vascular responses in an organ bath setup. IPA segments were mounted on the organ bath chamber via intraluminal wires and stimulated by various pharmacological agents. The changes in IPA vascular tone (i.e., vasoconstriction and vasorelaxation), were recorded using an isometric force transducer and physiological data analysis software program. We implemented several experimental protocols, which can be adapted to investigate the mechanisms of vasorelaxation/vasoconstriction for studying the pharmacological activities of phytochemical or synthetic drugs. The protocols can also be used to evaluate drugs&#39; roles in modulating various diseases, including pulmonary arterial hypertension. The IPA model allows us to investigate the concentration-response curve, which is crucial in assessing drugs&#39; pharmacodynamic parameters.

Vascular responses of arterial pulmonary circulation can be explored using intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). The present study describes the isolation of IPA in detail and the protocols used for investigating vasorelaxation in response to physiological stimuli.

Vasküler Yanıtları Araştırmak için İntrapulmoner Arter ve Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Murin CD34+ Kök Hücrelerinin Damar Duvarından İzolasyonu ve Manyetik Olarak Ayrılması

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

Yazar Spot Işığı: Manyetik Boncuk Tarama-Birleştirilmiş Akış Sitometrisi Kullanılarak Vasküler Duvarda Yerleşik Murin CD34+ Kök Hücrelerinin Gelişmiş İzolasyonu ve Karakterizasyonu

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

Farelerden Vasküler Duvarda Yerleşik CD34+ Kök Hücrelerin İmmünomanyetik İzolasyonu

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...