We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. Plazmid Yapı <ol><li> Daha önce 1,6 açıklandığı gibi teknoloji klonlama yoluyla yapıları oluşturmak. <ol><li> İlk BASL kodlama dizilerini amplifiye etmek için uygun olan primerler ile yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanarak, YDA ve MPK6 ve giriş vektörleri içine alt klonlanması. 7&#39;de ayrıntılı protokol bulun. </li><li> (Sırasıyla DNmpk6 8 ve DNyda 4) MPK6 ve YDA baskın negatif sürümlerini oluşturmak için şablon olarak MPK6 ve YDA giriş plazmidleri kullanmak ve bölgeye yönelik mutajenez yöntemi 9 ile nokta mutasyonlar. </li></ol></li><li> PH35CG 10 içine BASL entegre standart LR (attL x attR rekombinasyon) reaksiyonları (7 ayrıntılı prosedürü) yürütmek, tütün geçici deneyleri için yapıları inşa etmek, DNyda ve pXNGW içine DNmpk6 ve pXCGW sırasıyla 11 vektörleri. <ol><li> enzim sindirimi ve dizileme ile elde edilen plazmidler teyit edin. Bir kez successful Agrobacterium GV3101 ırkına 12 tumefaciens içine ikili yapılar dönüştürmek ve 2 28 ° C &#39;de seçme plakaları üzerinde büyümek - 3 gün. </li></ol></li></ol> Agrobacterium Sızma Çözüm 2. Hazırlık <ol><li> Inşa pH35CG, pXNGW ve pXCGW için 100 ug / ml Luria-Bertani (LB), uygun antibiyotik ile birlikte ortam 10 ml taze bir kaç transforme edilmiş Agrobacterium koloniler inoküle (gentamisin 25 ug / ml, Rifamisin 25 ug / ml, spektinomisin, aynı konsantrasyonlar P19 için Kanamisin 50 ug / ml gentamisin ve rifamisin (transgenik susturma karşı proteinleri eksprese) 13. </li><li> Yaklaşık 16 saat boyunca 200 rpm hızda 28 ° C çalkalayıcı Agrobacterium kültürleri büyür ve sonra (1.5 ulaştığı tahmin - 1.8) OD 600 ölçümü (Şekil 2A-B). 10 dakika boyunca 2.500 xg&#39;de kültürleri aşağı doğru döndürün. Yeniden askıya ve waMgCl 2 10 mM (infiltrasyon çözeltisi) ile hücre pelletleri sh. </li><li> Yine kültürleri aşağı Spin ve nihai OD 600 = 0.5 (Şekil 2C-D) ulaşmak için sızma solüsyonu uygun miktarda pelet yeniden askıya. 3 saat - bitkiler nüfuz etmeden önce, 1, oda sıcaklığında hücre karışımları bırakın. Bu aşama, hücre homeostazının muhafaza edilmesine yardımcı olur. </li></ol> 3. Tütün Fabrikası ve Yaprak Enjeksiyon <ol><li> Yaprak enjeksiyon için (16 saat ışık / 8 saat-karanlık döngüleri ile 23 ° C) standart bitki büyüme odasında 5 haftalık 14-4 yetiştirilen tütün bitkileri (Nicotiana benthamiana), kullanın. Not: Bu aşamada, tütün bitkileri genellikle 6 yaprakları (2 büyük, 2 orta, ve 2 küçük) var. İki orta ölçekli yaprakları yaprak enjeksiyonu (iki küçük olanlar genellikle çok genç iken iki büyük olanlar, çok eski) için en uygun bulunmaktadır. </li><li> sızma gün önce, tobac suco bitkiler toprak doyurmak için. </li><li> 3 saat - infiltrasyon günde 1 karanlıkta bitkiler önceden inkübe edin. Bu adım yaprak epidermal hücreler nüfuz zaman büyük ölçüde Agrobacterium kolaylaştıran, epidermis stoma yaygın açmanızı sağlar. </li><li> Yaprakları tarihleri ​​ile etiketlenmiş renk bantları bayrağını kullanarak sızmış olması. Mark alanlar siyah kalın sharpie ile infiltre olması (isteğe bağlı; sızmış alanlar enfekte edildikten sonra görebilir.). </li><li> Agrobacterium yeniden süspansiyon eşit hacimlerde alın ve Hafifçe girdapladıktan (Şekil 2E) ile, 100 x 15 mm Petri kabı içinde karıştırın. NOT: durumda, CFP-BASL 1 ml, 1 DNyda-nYFP ml ve DNmpk-cYFP 1 ml P19 1 ml karışık. </li><li> Infiltrasyonu işlemde, infiltrasyon karışımı ile 3 mi iğnesiz şırınga dolgu (1-2 mi) ve tütün yaprak (Şekil 2F) alt tarafına (eksen dışı) itin. infiltre iken, yararlıitmek için tek bir elinizi kullanın ve diğer yandan hafifçe (itme kuvvetine karşı, adaxial) üst tarafını destekleyecek. Not: infiltrasyon karışımı başarıyla enjekte edildikten sonra, enfekte alanlar epidermis kolayca tanınabilir hale gelecektir. Ancak, sızma nedeniyle sert enjeksiyon (doku hasarı) ya da yetersiz itme (herhangi bir sıvı penetrasyon) başarısız olabilir. Her bir test için, (çeşitli bitkilerden) iki bağımsız yapraklarda en az iki enjeksiyon göstermektedir. </li><li> geri büyüme odasına enfekte bitkiler yerleştirin. Genellikle, protein ekspresyonları 48 saat aşağıdaki sızma sonra saptanabilir. </li></ol> 4. Konfokal Görüntüleme <ol><li> (- 4 disk / alan üretilebilir normalde 3) (Şekil 2G) 48 saat sonrası infiltrasyonu at, enjekte edilen bölgede bir yaprak diski çıkarılması için bir delgeç kullanın. yavaşça su damlaları ile bir slayt (yukarı abaxial tarafı) yaprak diskleri aktarmak ve monte etmek için cımbız kullanın. Çok har basılmasını önlemekkapak kayma d sıkılmış / hasarlı hücreler konfokal mikroskop (Şekil 2H) altında iyi göstermez çünkü. </li><li> konfokal görüntüleme önce ifade seviyelerini kontrol etmek için bir epi-floresan bileşik mikroskop üzerine monte örnekleri tarayın. Not: Bizim deneyime dayalı, orta ifade seviyelerini göstermek hücreler en konfokal mikroskop altında temsil edilmektedir. </li><li> konfokal mikroskop 40X (NA 1.3) lens ile başlayın. floresan protein ve orta seviyelerde ifade eden hücreler merkezinde kaldığı şekilde istenen konuma slaydı ayarlayın. OBP ve YFP için uyarma / emisyon spektrumları 458 nm / olan 480-500 nm ve 514 nm / 520 - sırasıyla 540 nm. </li><li> Görüntüler daha sonra en dengeli floresan yoğunluğu / gürültü oranı için lazer yoğunluğu ve akıllı kazancı ayarlamak önizleme &quot;Canlı&quot; düğmesini etkinleştirin. Görüntüleme kalitesini artırmak tarama piksel ve / veya çerçeve / hat ortalamasını artırmak için. Son olarak, rea için odaklama topuzunu ayarlamakch medyan odak düzlemi ve görüntü almak için &quot;Capture&quot; butonuna tıklayınız. Not: OBP ve YFP görüntüleri veya sırasıyla &quot;sıralı&quot; tarama modu, seçeneği işaretleyerek sırayla veya aynı anda yakalanabilir. </li><li> Z-projeksiyon hücrelerinin derinlemesine görünüm için istendiğinde, tarama aralığı derinliğini tanımlamak, &quot;xyz&quot; görüntüleme modunu seçin (10-15 mikron) ve hedef hücrenin alt üst görüntüleri toplamak . seçmek .tiff dosyaları olarak &quot;yeniden adlandırmak&quot; ve ihracat görüntüleri resim dosyası üzerinde sağ tıklayarak Leica yazılımı ile elde edilen görüntüleri derleyin. </li><li> Resim 30 - ölçümü analizi için 40 hücreleri. </li></ol> 5. Görüntü İşleme ve miktarının belirlenmesi Analizi <ol><li> görüntüleri işlemek ve kantifikasyonunu yapmak Fiji yazılımı (http://fiji.sc/Fiji) kullanın. <ol><li> Floresan yoğunluğu grafikleri çizilir. <ol><li> daha CFP / YFP sentezleme olup görselleştirmek içineşit dağıtılmış, hücre çevresi boyunca CFP ve YFP sinyal gücünü göstermek için Fiji kullanın. Bunu başarmak için, öncelikle Fiji ardından resmi başlatmak için &quot;Dosya&quot; ve &quot;Aç&quot; seçeneğini başlatın. aracı menüsünden &quot;çizgi&quot; tıklayın ve sağ tıklayarak &quot;Segment çizgi&quot; seçeneğini seçin. Ilgi bölgeyi karar verin ve CFP veya YFP sinyali (Şekil 3A-C) iz hücre çevresi boyunca bir çizgi çizin. Not: Fiji dilimli çizgisinde mutlak floresan yoğunluğu değerini ölçer. </li><li> Parçalara hattı boyunca CFP / YFP seviyelerini temsil eden pozisyon ve yoğunluk değerleri ile bir grafik oluşturmak için açılır menüyü &quot;Analiz&quot; ve &quot;Plot profili&quot; seçeneğini seçin. İstenirse, karşılaştırılabilir yoğunluk grafikler oluşturmak için EXCEL veya diğer grafik yazılımı içine (menü &quot;Kopyala&quot; seçerek) yoğunluk değerlerini çoğaltmak. </li></ol></li><li> polarite derecesini ölçmek. <ol><li> yaklaşık 20 Represen toplamak3 tekrarlı deneyler niteliksel hücreler tütün hücrelerinde CFP ve YFP polarite derecesini değerlendirmek için. (L olarak tanımlanan) düşük floresan yoğunluğu üzerinde (H olarak tanımlanır) yüksek floresan yoğunluğu oranına göre polarite derecesine hesaplayın. Not: ölçme yöntemi Şekil 3&#39;te açıklanmıştır. <ol><li> H ve L değerlerini ölçmek için, &quot;Tedbir&quot; açılır menüden &quot;Analiz&quot; ve sonra seçim tıklayın (yukarıda anlatılan) hücre çevresinde ilgi bölge boyunca bir parçalı bir çizgi çizin. Bir &quot;Sonuçlar&quot; penceresi açıldığında, kullanmak miktarının gerçekleştirmek için değerler &quot;ortalama&quot;. </li><li> Örneğin CFP ve YFP, nispeten homojen bir ifade gösteren hücrelerden, CFP-BASL (Şekil 3A) ve YFP ölçülmesiyle, H ve L değerlerini elde, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP (Şekil 3B) birlikte ekspresyonundan tamamlanmaktadır iki rastgele eşit uzunlukta olan periferik segmentleri seçildi. </li> &lt;li&gt; Bu durumda, floresan proteinleri belirgin polar birikimini gösteren hücrelerden, CFP-BASL, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP (Şekil 3C), ko-ekspresyonu zenginleştirilmiş floresans sinyalleri ile çevre bölgelerinden H değerleri toplamak ve düşük / hayır floresan birikimi ile bölgelerden Ls. </li><li> normal dağılım 20 birlikte hücre ve testi, H / L Elde edilen oranları havuz. (Normal dağılım için) Student t testi p değerleri veya (non-normal dağılım için) Kolmogorov-Smirnov (KS) testi hesaplayın. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis.">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li><li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis.">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase.">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304, 1494-1497 (2004).</li><li>Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+and+expanded+roles+for+MAPK+signaling+in+Arabidopsis+stomatal+cell+fate+revealed+by+cell+type-specific+manipulations.">Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations.</a> Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).</li><li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis.">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19, 63-73 (2007).</li><li>Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BASL+Polarity+Protein+Controls+a+MAPK+Signaling+Feedback+Loop+in+Asymmetric+Cell+Division.">The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division.</a> Dev Cell. 33, 136-149 (2015).</li><li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+Streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway(R)+TOPO+vector+system.">Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system.</a> Plant methods. 4, 4 (2008).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+evidence+that+the+Arabidopsis+MAP+kinase+MPK6+is+involved+in+anther,+inflorescence,+and+embryo+development.">Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.</a> J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).</li><li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+site-directed+mutagenesis.">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).</li><li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+transport+activity+by+heterotrimerization+of+Arabidopsis+ammonium+transporter+complexes+in+vivo.">Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo.</a> Plant Cell. 25, 974-984 (2013).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method.">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH protocols. 2006 (7), (2006).</li><li>Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus.">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> Plant J. 33, 949-956 (2003).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in molecular biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+signaling+in+Arabidopsis.">Cell polarity signaling in Arabidopsis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).</li><li>Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIN+phosphorylation+is+sufficient+to+mediate+PIN+polarity+and+direct+auxin+transport.">PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).</li><li>Furutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar-localized+NPH3-like+proteins+regulate+polarity+and+endocytosis+of+PIN-FORMED+auxin+efflux+carriers.">Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers.</a> Development. 138, 2069-2078 (2011).</li><li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+localization+and+degradation+of+Arabidopsis+boron+transporters+through+distinct+trafficking+pathways.">Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).</li><li>Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCTOPUS,+a+polarly+localised+membrane-associated+protein,+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana.">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Genel Kullanım ve sinyal iletimi için Tütün geçiş sentezleme sisteminin olası değişiklikler: floresan proteinin aşırı ekspresyonunu (FP) başarılı bir şekilde, bitki hücrelerinde protein hücre içi lokalizasyonu hızlı inceleme için kullanılmıştır Tütün epidermis proteinleri etiketli. Bununla birlikte, in planta protein kompleksi dinamik sinyal dağılımını incelemek komplike hücre içi ortamlarda, geçici protein-protein etkileşimi ve sinyal transdüksiyon etkinli...

Proteinler öngörülemeyen hücresel ortamda meydana gelen neredeyse tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır karmaşık bir hiyerarşik ağ ve form kompleksleri içinde etkileşimde. Ancak, büyüme yanıtları bitki gelişiminden, sadece hızlı değil, aynı zamanda etkin bir şekilde hücre içi düzeyde bu dinamik sinyal olaylarını tespit etmek ve izlemek edemez uygun araçlardan bir eksikliği vardır. Tütün yaprağı epidermis geçici protein sentezleme sistemi canlı hücrelerin floresan proteinleri görselleştirmek için avantajlar cazip gelmiştir. Bu sistem post-translasyonel protein modifikasyonu ve protein lokalizasyonu hızlı incelenmesine olanak yarı in vivo koşulları sağlar. tamamlanmaktadır YFP sinyal inceleyerek, bimoleküler flüoresan tamamlama (BiFC) deneyi, bitki hücrelerinde protein-protein etkileşimi olasılığı bildirir. Diğer yöntemler, örneğin, maya-iki hibrid (Y2H) ve CO ile karşılaştırıldığında-immunoprecipitation (Co-IP) BiFC, protein-protein etkileşimleri hücre içi seviyede oluşabilir bölmeleri görselleştirme güçlü bir yol temin etmektedir. Asimetrik hücre bölünmesi (ACD) doku / organ oluşumu için yeni bir hücre tipleri oluştururken hücre popülasyonu kök tutar için, ökaryotik multicellularity teşvik etmek için vazgeçilmez bir mekanizmadır. Arabidopsis stoma gelişimi bitkilerde ACD çalışmak için bir model sistem olarak kullanılmıştır. öncü hücre, Meristemoid anne hücresi, asimetrik bölmek ve içine ayırt edebilir (ve bir stoma soy zemin hücre (SLGC) (bekçi hücreleri bir çift içine sonlandırmadan önce hücre benzeri bölünmeleri kök uğrar), bir Meristemoid iki farklı kızı hücreler üretmek için bölen bir kaldırım hücresi), sırasıyla (Şekil 1). stoma ACD olarak, Stoma Lineage içinde Asimetrisinin yeni protein Kırma (BASL) inc hangi bölünme asimetrilerini sürücü premitotically polarizelude fiziksel asimetri ve hücre kaderi asimetri 1. MAPKKK YODA ve MAPK, MPK3 ve 6 oluşan bir MAPK kaskad stoma bölümü desen ve kader kabulü 2,3, 4,5 için merkezi. Son zamanlarda, Zhang ve diğ. ACD 6 stoma Arabidopsis YDA-MAPK sinyal yoluna polarite protein BASL bağlı. kanonik YODA-MAPK yolağı, MPK3 / 6&#39;ya kadar, BASL fosforile ve kutuplaşma aktive eder. Fosforile BASL bir iskele olarak fonksiyonları ve YODA (YDA) ve MPK3 / 6 acemi bir protein kompleksi oluşturmak ve hücre korteks 6 da sinyalini konsantre. MAPK bileşenleri ve BASL ve YDA-MAPK yolağı arasındaki pozitif geri besleme döngüsü Polarizasyon bitki hücrelerinde protein kutuplaşma için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Yerel olarak zenginleştirilmiş MAPK sinyal yakından stoma ACD 6 hücre kaderi farklılaşma (Şekil 1) bağlantılı olduğu varsayılmaktadır. k birBu model desteklenen ey deneysel veriler BASL 6 ekspresyonu ile sebep olunan MAPK mekansal yeniden dağıtım gösterdi tütün tahlilleri geldi. MAPK molekülleri genellikle hücrenin içine her bulunduğu için, MAPK sinyal meydana geldiği, genel olarak, takip etmek kolay değildir. Bu çalışmada, biz sinyal rölesi oluştuğu önermek yukarı kinaz ve aşağı olanlar arasındaki etkileşimi görselleştirmek için bölünmüş YFP sistemi kullanılmaktadır. Bu, ek olarak BiFC sisteminin kullanımı uzatılmış birlikte ifade (protein-protein etkileşimi göstermektedir) bölünmüş YFP çift üçüncü bir proteini (CFP-etiketli) tamamlanmaktadır YFP uzamsal CO- ile modüle edilebilir ve bunun nasıl görselleştirmek CFP proteini ifade etmiştir. Bu şekilde, Tütün Epiderm hücre kortekste polarize dokusuna da dağıtım YDA ve MPK6 arasındaki etkileşimlerin uzaysal yeniden düzenlenmesi neden CFP-BASL bu ko-ifadesini gösterdial hücreleri. Bu sistem, bu nedenle hücre dahili veya harici stimuli ile meydan zaman koşulları altında, bitki hücrelerinde, dinamik sinyal olaylarını izlenmesi için geliştirilecek bir potansiyele sahip (örneğin, başka proteinler, kimyasal uygulama, patojen saldırısı ya da çevresel değişiklikler, vb birlikte ifadesi. ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D/TOPO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td>200521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J673-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x75mm Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x50 mm Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>&#160;LAS AF Lite software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 x objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;, NA 1.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SORVALL 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Canemco &#38; Marivac</td>
			<td>205EQA-Spec</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

canlı hücrelerde dinamik sinyal olaylarının Görselleştirme bir meydan okuma olmuştur. Bu, bitki hücrelerinde sinyal transdüksiyonu uzaysal dağılımının izlenmesi için test protein-protein etkileşimi kurulu bir geçici ifade sisteminin tütün epidermal hücrelerinde biyomoleküler floresan tamamlama (BiFC) deneyi genişletilmiştir. Bu protokol, etkileşimi ve Arabidopsis MAPKKK Yoda ve MAPK6 arasındaki sinyal plazma membranında meydana göstermek için BiFC tahlili kullanılmıştır. çatgı proteini BASL birlikte ifade edildiğinde Yoda-MAPK etkileşimi dağıtılabilir ve mekansal CFP-BASL ile birlikte polarize. Bu modifiye tütün sentezleme sistemi lokalizasyonu ve dinamik değişiklikleri (az 4 gün) ve floresan protein renk (en az üç) çarpanı ağırlayacak sinyalizasyon hızlı inceleme için izin verir. Biz de protein dağılımı (asimetrik mekansal lokalizasyonu, ya da &quot;kutuplaşma&quot; ölçmek için ayrıntılı yöntemler sundu;), Tütün hücrelerinde. Bu gelişmiş tütün ifade sistemi, canlı bitki hücrelerinde dinamik sinyal olaylarının hızlı test için yaygın olarak kullanılan bir potansiyele sahiptir.

hiperaktif MAPK sinyallemesinin başlatılan hücre ölümünü engellemek için, YDA (DNyda) ve MPK6 (DNmpk6) kinaz aktif olmayan ve tütün hücrelerine eş-sentezleme tahlilinde kullanılmıştır. Ne BiFC de CFP-BASL kendisinde oluşturulan düzensiz dağılım deseni (Şekil 3A-B) ortaya DNyda ve DNmpk6 arasındaki etkileşim. CFP-BASL DNyda-DNmpk6 etkileşim çifti girmiştir Ancak, OBP ve YFP sinyalleri hem son derece kutuplaşmış bir şekilde (Şekil 3C...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System at JoVE.com

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Görüntüleme.  Rutgers, The State University of New Jersey. The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

Video: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biyoloji

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Farelerde Hidrodinamik Gen Taşıyıcı Proteinlerin Geçici İfadesi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.