Name: analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads at JoVE.com

CG, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), (Marie Curie Kariyer Entegrasyon n˚8304162) ve Avrupa Birliği&#39;nin Horizon kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) hibe tarafından desteklenmektedir 2020 araştırma ve yenilik programı (ERC Başlangıç ​​Hibe n˚639300).

Manyetik Boncuk 1. Ligand Konjugasyon Not: Ligand konjügasyon 2.8 mikron çapında olan süperparamanyetik tosil-aktive boncuklar kullanılarak gerçekleştirilir (stok çözelti konsantrasyonu 10 8 boncuk / mL, 30 mg tane / mL) eklenmiştir. Aşağıdaki protokol, bir 60 mm doku kültürü plakası içinde% 80 konfluansa büyütülmüş MRC-5 hücreleri için uygun, yaklaşık 2 x 10 5 hücre, örnekleri dayanır. buna göre farklı akışlar farklı boyutlarda veya hücre plakaları kullanılması durumunda boncuk ve reaktiflerin ses seviyesini ayarlayın. hücre başına 2 boncuk olması için süperparamanyetik tanelerin miktarının kullanılması. Bu nedenle, 4 x 10 5 boncuk 60 mm tabak için ihtiyaç vardır. <ol><li> İyice en az 30 sn vorteks orijinal flakon boncuk tekrar süspansiyon. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne (4 x 10 6 boncuk karşılık gelir) yeniden süspansiyon haline getirilmiş süperparamanyetik tanelerin kısım 40 uL. </li><li> Manyetik separati tüp yerleştirinçözeltiden manyetik boncuklar ayırmak için stand. Süpernatantı atın manyetik ayırma standından tüp kaldırmak ve 1 ml 0.1 M Na-fosfat pH 7.4 boncuklar tekrar süspansiyon. <ol><li> 1 ml 0.1 M Na-fosfat, pH 7.4 ile iki kez tekrar yıkama aşaması. </li></ol></li><li> Son yıkamadan sonra, 1 ml 0.1 M Na-fosfat, pH 7.4 içinde yeniden süspanse boncuklar. </li><li> Kombine 100 ug Sığır fibronektin (FN) ya da boncukları içeren 1 ml 0.1 M Na-fosfat, pH 7.4&#39;e başka hücre yapışma reseptörü ligandı ve pipetleme karıştırın. </li><li> FN veya negatif kontroller için BSA, poli-D-lisin ya da apo-transferin ile başka bir spesifik ligand yerine önceki adımları tekrarlayın. </li><li> İsteğe bağlı olarak, jel analizi için, çapraz bağlama verimliliği analizi için ligand solüsyonu 10 uL kısım almak ve konsantre edilerek Laemmli numune tamponu uygun bir hacmi ile karıştırılır. </li><li> Bir rotor üzerinde, 37 ° C&#39;de 12-24 saat boyunca ligand ihtiva eden çözelti ile boncuk inkübe edin. </li><li> Reaksiyon fazla 10-20 saniye boyunca, sonikasyon (sürekli 39 W güç) oluştuktan sonra boncuk agrega görünüyorsa. </li><li> manyetik ayırma standı kullanarak boncuk izole kalan çözelti aspire ve 1 mL PBS /% 0.2 BSA pH 7.6 çözümü ekleyin. 37 ° C &#39;de, rotor üzerindeki 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 1 ml PBS /% 0.2 BSA, pH 7.6 ile iki kez bir mıknatıs kullanılarak boncuk yıkayın. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse boncuk /% 0.2 BSA, pH 7.6. </li><li> Sonikasyon boncuk agrega fazla 20-30 saniyeden görünüyorsa. </li><li> İsteğe bağlı olarak, Western blot ile bağlanma verimliliğini analiz etmek için bir 10 uL numuneyi çıkarın (konsantre Laemmli numune tamponu uygun bir hacmi ile karıştırıldı). </li><li> kadar 1 ay boyunca 4 ° C&#39;de deneyleri veya mağaza boncuk hücre geçin. </li><li> İsteğe bağlı olarak, manyetik boncuk FN çapraz bağlanmasını analiz etmek için, Coomassie mavisi ile SDS-PAGE jeli ve leke çalıştırın. </li></ol> Dorsal üzerinde yapışma reseptörlerine Bound Ligandla kaplı Boncuk üzerinde gerilme kuvvetlerinin 2. UygulamaHücreler yüzey <ol><li> Uygun büyüme ortamı içinde 60 mm doku kültürü çanağı üzerinde kültürü yapışan hücreler% 80 konfluent elde edilene kadar (genellikle DMEM 4.5 g / L D-glikoz FCS,% 10 ile takviye edilmiş). </li><li> Denatüre edici olmayan iyonik olmayan liziz tamponu (20 mM Tris HCI pH 7.6, 150 mM NaCI, 2 mM MgCI2,% 0.1 NP-40) ve soğuk mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. </li><li> 1 ml PBS içinde bölümü 1.10 ve tekrar süspansiyon ligand kaplı boncuklar Pelet /% 0.2 BSA, pH 7.6. sıcak kültür ortamı ve vorteks 5 mL ligand kaplı boncuklar çözeltisi 100 uL ekleyin. </li><li> Aspire 60 mm kültür çanak orta ve 5 mL boncuk ile desteklenmiş sıcak büyüme ortamı ekleyin. </li><li> Hücre kültürü koşulları altında 20 dakika boyunca (37 ° C ve% 5 CO2) Taneler, tortu ve hücrelere yapışmasının sağlanması için inkübe edin. Boncuk fagositoz ile içselleştirilmiş olabilir çünkü 20 dk aşmaması için çok önemlidir. </li><li> İsteğe bağlı olarak, 10X veya 20X obje kullanarak ışık mikroskobu altında boncuk gözlemlemekctive ve hafif takılı ve yüzer boncuk arasında ayrım çanak sallayarak boncuk yapışması için kontrol edin. </li><li> inkübatör kültür çanak tutarken, üst yüzünde bağlı bir yuvarlak 38 mm neodimyum mıknatıs ile bir kapak normal çanak kapağı takas. Mıknatıs kapağın alt yüzü üzerine yerleştirilmiş iki küçük 13 mm neodimyum mıknatıslar tarafından yerinde tutulur. mıknatıslar çok güçlü olduğundan, bunları dikkatli bir şekilde manipüle. </li><li> Hücre kültürü şartlarında arzu edilen bir zaman noktası için bir gerilim (37 ° C ve% 5 CO2) maruz hücreler inkübe edin. </li><li> Tedaviden sonra, buz üzerinde çanak yerleştirin ve dikkatlice çanak tüm orta aspire. </li><li> Hücre lisis tamponu 300 uL ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. Önceden soğutulmuş 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne bir hücre kazıyıcı ve transfer kullanarak lizat toplayın. </li><li> manyetik ayırma standı kullanarak manyetik boncuk pelet ve yeni bir ön-chill toplam hücre lizatı transferi1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ed. daha fazla analiz için -20 ° C&#39;de Bu fraksiyon saklayın. </li><li> 1 ml buzla soğutulmuş lizis tamponu ile boncuk 3 kez yıkayın. , Boncuk pelet 50 uL Laemmli numune tamponu ekleyin kuru blok ısıtıcı kullanılarak 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de pipetleme ve kaynatın karıştırılır. Bu fraksiyon izole yapışma kompleksleri içerir. -20 ° C&#39;de biyokimyasal analiz veya saklamak için devam edin. </li><li> Boncuklar ayırma (yaklaşık 300 uL) sonra elde edilen toplam hücre lizatından, Western blot analizi için, 50 uL numuneyi çıkarın. NOT: Bu protein-protein etkileşimi çalışmaları (immüno GST açılan tahlilleri) işaretlenebilir veya GTPaz aktivitesi deneyleri gibi başka biyokimyasal çalışmalar için kullanılan sol 250 uL (lizis tamponu değiştirmek ilgi GTPaz bağlı olarak gerekli olabilir). </li></ol>

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+forces:+architectural+control+of+mechanotransduction.">Balancing forces: architectural control of mechanotransduction.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).</li><li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).</li><li>Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adaptation+to+mechanical+stress:+role+of+integrins,+Rho,+cytoskeletal+tension+and+mechanosensitive+ion+channels.">Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels.</a> J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).</li><li>Zhao, X. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+activates+smooth+muscle+alpha-actin+promoter+activity+through+the+Rho+signaling+pathway.">Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+biosensors+to+measure+mechanical+forces+within+cells.">Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells.</a> Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. l. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+atomic+force+microscopy+and+side-view+optical+imaging+for+mechanical+studies+of+cells.">Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells.</a> Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).</li><li>Bays, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinculin+phosphorylation+differentially+regulates+mechanotransduction+at+cell-cell+and+cell-matrix+adhesions.">Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions.</a> J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+tensional+forces+on+PECAM-1+elicit+a+global+mechanotransduction+response+via+the+integrin-RhoA+pathway.">Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway.</a> Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).</li><li>Gordon, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Allostery:+Evidence+for+a+Force+Requirement+in+the+Proteolytic+Activation+of+Notch.">Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch.</a> Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).</li><li>Lessey-Morillon, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RhoA+guanine+nucleotide+exchange+factor,+LARG,+mediates+ICAM-1-dependent+mechanotransduction+in+endothelial+cells+to+stimulate+transendothelial+migration.">The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration.</a> J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).</li><li>Osborne, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+regulates+LARG+and+GEF-H1+during+EMT+to+affect+stiffening+response+to+force+and+cell+invasion.">TGF-&#946; regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).</li><li>Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+on+JAM-A+activates+RhoA+via+GEF-H1+and+p115+RhoGEF.">Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF.</a> Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).</li><li>Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+fields+applied+to+collagen-coated+ferric+oxide+beads+induce+stretch-activated+Ca2++flux+in+fibroblasts.">Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts.</a> Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).</li><li>Glogauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+and+tyrosine+phosphorylation+interact+coordinately+with+actin+to+regulate+cytoprotective+responses+to+stretching.">Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching.</a> J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).</li><li>Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+myosin-II-responsive+focal+adhesion+proteome+reveals+a+role+for+&#946;-Pix+in+negative+regulation+of+focal+adhesion+maturation.">Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for &#946;-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).</li><li>Schiller, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;1-+and+&#945;v-class+integrins+cooperate+to+regulate+myosin+II+during+rigidity+sensing+of+fibronectin-based+microenvironments.">&#946;1- and &#945;v-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).</li><li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+nuclei+adapt+to+force+and+reveal+a+mechanotransduction+pathway+in+the+nucleus.">Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus.</a> Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).</li><li>Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+integrin+and+growth+factor+receptor+signaling+pathways+within+the+focal+adhesion+complex.">Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex.</a> Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).</li><li>Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+alpha(5)beta(1)+integrins+determines+adhesion+strength+whereas+alpha(v)beta(3)+and+talin+enable+mechanotransduction.">Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).</li><li>Ajeian, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+integrin-associated+complexes+from+mesenchymal+stem+cells.">Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells.</a> Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).</li><li>Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitivity+of+integrin+adhesion+complexes:+Role+of+the+consensus+adhesome.">Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome.</a> Exp Cell Res. , (2015).</li><li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+integrin-based+adhesion+complexes.">Isolation of integrin-based adhesion complexes.</a> Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).</li><li>Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Fr&#233;millon, A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+modulation+of+adhesion+complex+composition.">Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition.</a> PloS One. 9 (12), e115213 (2014).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+integrin+adhesion+complexes.">Proteomic analysis of integrin adhesion complexes.</a> Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+&#945;4&#946;1+integrin+adhesion+complexes+reveals+&#945;-subunit-dependent+protein+recruitment.">Proteomic analysis of &#945;4&#946;1 integrin adhesion complexes reveals &#945;-subunit-dependent protein recruitment.</a> Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).</li><li>Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+magnets+and+magnetic+beads+to+dissect+signaling+pathways+activated+by+mechanical+tension+applied+to+cells.">Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells.</a> Methods. , (2015).</li><li>Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+activity+regulates+vinculin+recruitment+to+focal+adhesions+through+FAK-mediated+paxillin+phosphorylation.">Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation.</a> J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).</li><li>Sawada, Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+transduction+by+Triton+cytoskeletons.">Force transduction by Triton cytoskeletons.</a> J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).</li><li>Grinnell, F., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+fibronectin-coated+beads+with+attached+and+spread+fibroblasts.+Binding,+phagocytosis,+and+cytoskeletal+reorganization.">Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization.</a> Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).</li><li>Schroeder, F., Kinden, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytosis+using+fluorescent+latex+beads.">Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads.</a> J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).</li><li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction.">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).</li><li>Seo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanogenetic+Toolkit+for+Interrogating+Cell+Signaling+in+Space+and+Time.">A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time.</a> Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim.

Burada tarif edilen yöntem, hücre yüzeyi yapışma reseptörlerine gerilim uygulamak ve daha sonra saflaştırmaya olanak sağlamak üzere basit bir yaklaşım oluşturmaktadır. Ancak, bazı adımlar hedeflenen yapışma reseptörleri bağlı verimli yapışma arıtma ve potansiyel iyileştirme yapılabilir gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir. Biz kullanıcı aşağıda karşılaşabileceğiniz olası sorunları sunuyoruz. Bu 2.8 mikron çapında manyetik boncuklar kullanılabilir, ancak daha büyük taneler gibi 4.5 mikron çapında kullanılabilir. Fagositoz 30-60 dakika inkübasyon sırasında daha hızlı ortaya çıkabilir ve bu boncuk deplasman manyetik alan 34, 35 altında sınırlı olacaktır böylece büyük boncuk güçlü yapışma beri Ancak, boncuk çapı 2-5 mikron sınırlı olmalıdır. Nedenle, kısa süreler için inkübasyon süresi sınırlamak ve uygun boncuk boyutunu kullanmak önemlidir. Hücre başına kuluçkalanmış boncuk sayısı f miktarını etkileyecekTek bir hücre tarafından orce deneyim. Bir etkin gerilim ve hücreleri uyarır ister birlikte, hücre başına çok fazla boncuk alakasız sinyal yollarının aktivasyonu neden olabilir. Genellikle FN-kaplanmış boncuklar için, hücre başına iki boncuk ortalama inkübe, ancak bu miktar, hücre tipi, hücre yüzey reseptörüne bağlı olarak [1 ila 5 boncuklar hücre başına] ayarlanabilir. Mıknatıs ile ilgili olarak, burada açıklanan yöntem, bunun, ancak, seyreltilmemiş gliserol, bilinen viskozitesi 31 Bir Newtonyen sıvı manyetik boncuk yer değiştirme ölçümü ile 2.8 um nihai kuvvet (yaklaşık 30-40 pN ölçülmüştür olan bir mıknatıs kullanılmaktadır mümkün gerekirse kuvvet daha fazla miktarda uygulamak için büyük mıknatıslar kullanmak. mıknatıslar son derece güçlü olduğunu not etmek ve bunları dikkatle işlemek için önemlidir. ayrıca, PBS /% 0.2 BSA, pH 7.6 tampon maddesi ile 1 saat kuluçkadan (aşama 1.9) sonra, ECM ligand (aşama 1.7), m 12-24 saat kuluçkadan sonraagnetic mikroboncuklarının agrega oluşturabilir. Hücre başına 2 boncuk oranı saygı mümkün olduğu kadar boncuk ayırmak için kritik öneme sahiptir. : 1 oranını Bununla birlikte, yine de, 5 olması kabul edilebilir. Boncuk ayrılması, karıştırılması ve pipetleme veya sonikasyon kullanılarak da elde edilebilir, ancak kısa bir süre (20-30 s) dir. Çeşitli proteinler, integrin ligandı (FN, kolajen), spesifik hücre yüzey reseptörlerine hedef rekombinant proteinlerin veya antikorlar da dahil olmak üzere boncuklar, konjuge edilebilir. Dorsal hücre yüzeyine ligand kaplı manyetik boncuklar bağlanma boncuklar üzerine ligandın düşük bir bağlanma etkisine zayıflamış olabilir. Boncuk ve birleştirme işleminin sonunda tanelerin bir kısım eklenmeden önce seyreltildi ligand çözeltisi bir kısım toplayarak tanelere ligand kontrol etmek için önerilmektedir. Bu bölümler, SDS-PAGE analizi ve Coomassie Blue lekelemesi ile işlenebilir. Hiçbir değişiklik varsayollar veya tespit edildiği beklenen mechanosensing süreçleri sinyalizasyon, farklı olasılıkları dikkate almak önemlidir. sorunu tanımlamak için bir yolu mıknatıslı deney süresini modüle etmektir. Hücresel süreçlerin hızı kullanılan hücre türüne göre değişir bilinmektedir. Başka bir seçenek bilinen gerginlik duyarlı molekülleri test etmek ve blotlama batılı kendi sonrası translasyonel modifikasyonlar kontrol etmek olacaktır (örneğin paxillin fosforilasyon veya FAK fosforilasyonu için analiz edilebilir). kuvvet miktarı da kritik bir seçenek olabilir kalın bir mıknatıs (aynı sınıf N52) veya daha büyük boncuklar kullanarak olabilir. Buna ek olarak, ligand / reseptör bağlanma etkinliği analiz yapışma kompleksi tarafından araştırılmıştır (örneğin, cadherin veya integrin gibi) hücre yüzeyi reseptörleri için bir nokta olabilir. Hücre confluency da gerginlik hücresel cevabı etkileyebilir. Bu hücre davranışını ve cystokeletal ön gerilimi etkiler, hücre / hücre yapışmasını gözlenmiştir gibi, önemli olduğuna inanılmaktadırt confluency gerginlik hücresel cevabı etkileyebilir unutmayın. Bu integrin göre yapışıklıklar gerilim uygulanması için% 80 konfluent tavsiye olsa da, farklı koşullar, deney sistemi optimize etmek için test edilebilir. Bu yöntem gerginlik duyarlı adhesome yanı sıra ilişkili sinyal yollarını deşifre etmek için güçlü bir araç sağlar olsa da bazı sınırlamalar vardı. Bu tür küçük boyutlu manyetik boncuklar kullanılarak ana endişe hücrelerin kendi içselleştirme riski olduğu İlk olarak, bu yöntem, farklılaşması ve proliferasyonu gibi hücre kaderine değiştirme uzun süreli mechanosensitive sinyal hücresel yanıtları çalışmak için kullanılamaz. Diğer bir kısıtlama kuvvetleri kültür plakasının hücre tabakasına uygulanan ne şekilde yer alır. Manyetik alan mıknatısın çevresinde her zaman daha yüksek olduğu için Nitekim, kuvvetler hücrenin azalan bir gradyanı ile kültür plakasının yüzeyinde değişebilirÇevreden merkeze doğru uzanan ve heterojen hücresel yanıtları yol açabilir. Burada tarif edilen prosedür mechanosensitive yolakları okuyan ve gerilmeye tabi yapışma kompleksleri moleküler bileşim araştıran sağlayan bir basit ve uygun maliyetli bir yöntem teşkil etmektedir. bu hücrelerin siklik suşu uygulanır germe aygıtının gibi diğer yaklaşımlar, hücre dışı matriks ile etkileşen tüm hücre yüzeyi reseptörlerine gerilim uygulanmasına yol açar. Burada tarif edilen yöntem bu, ligandları veya hücre yüzey reseptörlerini hedefleyen antikorları integrin çok belirgin mechanosensitive sistemlerinin çalışma izin olarak kullanılabilir hücre yüzeyi reseptörlerinin özel bir alt-grup ve ligandların büyük bir çeşitlilik kuvveti uyarımını sağlamak gibi bir avantajı vardır. Bu yöntemin diğer bir avantajı, bu gerilim deneyimli eleme yük taşıyıcı üzerinde çalışmak için proteinlerin kompleksleri saflaştırma yol açmasıdırbilinen NTS mechanotransduction 36 merkezi bir rol oynamaktadır. Saflaştırılmış yapışma kompleksi de gerilim ya da aktin polimerizasyon deneyinde yanıt olarak kinaz aktivitesini araştırmak örneğin kinaz tahlilleri gibi çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar 14 için kullanılabilir. Ek olarak, bu deney sistemi selüler mekanik yanıtını keşfetmek için ve belirlenen sinyal yolları ile yanıt ilişkili manyetik cımbız ile akuple edilebilir. İlginçtir, magnetoplasmonic nanopartiküller zaman ve mekan 37 hassas kontrolü ile yük Notch ve E-kaderin mekanik olarak son zamanlarda kullanılmıştır. Bu son gelişme, farklı, uzamsal zamansal ve mekanik girişli mechanosensitive sinyal yollar keşfetmek yardımcı olabilir.

Metazoada olarak, mekanik gerilme, proliferasyon, farklılaşma ve canlılık, 1, 2 gibi hücresel süreçleri sayısız düzenleme ile doku gelişimi ve homeostazı yönlendirir. Mekanik gerilim hücre dışı matrisin ortaya çıkabilir veya yapışık hücreler, örnek hücre-dışı matris üzerine çeker ve gerginlik duyarlı moleküllerin yoluyla sertliğini probları aktomiyosin kontraktil makineler yoluyla hücre dışı ortamı ile üretilebilir. gerilime karşılık olarak, mechanosensitive yapışma proteinleri, karmaşık bir sinyal gruplarının tetiklenmesinde uygun değişikliklere uğrar. Buna karşılık, bu sinyal yolları hücre dışı ortama hücresel davranış ayarlar proliferasyonu, farklılaşması ve hayatta kalma kapsayan bir mechanoresponse orkestra. Bu tür süreçler hızla mekanizmalarının döngü üzerine geri beslemeye (saniye dakika) kısa vadeli bir sürede çözülebilecek<html> mechanosensitive yapıları değiştirerek notransduction. Örneğin, integrin göre yapışıklık Rho GTPaz aracılı hücre iskeleti yeniden 3, 4, 5 arasındaki gerilim yanıt olarak güçlendirir. Buna paralel olarak, diğer sinyal yollarının sonunda hücre kaderi 6 etkileyen genetik programları kontrol etmek için saat ve gün içinde aktif hale getirilir. Birçok çalışma, hücre determinizm ve hastalık gelişimi 1, 2 matris sertlik etkisini vurgulamıştır Oysa, yapışma aracılı mechanotransduction kesin moleküler mekanizmalar hala zor kalır. Çeşitli yaklaşımlar, akış sistemleri, flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) -tension sensörleri 7 de dahil olmak üzere hücre davranışı hücre tarafından üretilen kuvvetler veya dış kuvvetlerin etkilerini incelemek için geliştirilmiştirlass = &quot;xref&quot;&gt; 8 uyumlu yüzeyler 9, manyetik cımbız, optik cımbız 10 ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 11. Burada belirli bir yapışma reseptörleri uygulanan gerilme kuvvetlerine karşılık olarak mechanotransduction yolları karakterize süperparamanyetik boncuklar kullanılarak, bir protokol mevcut. Süperparamanyetik boncuklar bir manyetik alan içine konulduğunda, tersine çevrilebilir manyetize parçacıklardır. Bir kez özel bir reseptör için bir ligand ile kaplı, bu boncuklar hücre dışı bir güç uygulamanın etkilerini incelemek için güçlü bir araç sunar. Bu yöntem bazı çalışmalarda 3, 5, 12 ile onaylandı - 17 ve büyük ölçüde yapışık hücreleri üzerinde biyokimyasal analizi kolaylaştırmak için avantaj sunuyoruz. Biyokimyasal analizi ile takip benzer kollajen kaplı manyetik boncuklar kullanılarak, erken iş bir artış olduğunu bildirdigerilim 5, 18, 19 karşılık olarak protein tirozin fosforilasyon ve RhoA aktivasyonu. Aşağıda tarif edilen yöntem, aynı zamanda integrin 3 uygulanan gerilimden aşağı sinyalleme yolunu tanımlamak için fibronektin (FN) kaplı boncuklar ile kullanılmıştır. Bu çalışmada, Guilluy ve ark. gerginlik integrin yapışma kompleksleri iki guanin nükleotid değişim faktörleri (gefs), LARG ve GEF-H1, işe yoluyla RhoA aktive olduğunu gösterdi. Bu yana, diğer çalışmalar GEF-H1, burada açıklanan metodolojiye sağlamlığını gösteren farklı yöntemler 20, 21 kullanılarak hücre tarafından üretilen gerilim yanıt olarak yapışma kompleksleri için işe olduğunu göstermiştir. Bunun bir sonucu olarak, aktive edilmiş RhoA sitoskeletal yeniden ile, yapışma takviye sağladığı gösterilmiştir. Bu sistem, aynı zamanda gerilim tatbik t araştırmak için kullanıldıHücre / hücre adezyon reseptörleri o. İntegrin ilişkili adhezyon kompleksleri 12 benzer vinkulin işe bir artışa neden olmadan E-kaderin hücre dışı kaplanmış manyetik boncuklar üzerine kuvvetlerinin uygulanması. Collins ve arkadaşları PECAM-1 integrin teşvik ve RhoA aktivasyonu 13 gerginlik bu uygulama görülmektedir. manyetik boncuklar kullanarak başka deneysel bir yaklaşım izole çekirdekleri uygulanan gerilim çalışmadır. Nesprin-1 çekirdek zarı proteine karşı antikorlarla kaplanmış boncuklar kullanılarak, çekirdek zarı kompleksleri dinamik mekanik gerilim 22 yanıt olarak ayarlanır olduğunu göstermek için saflaştırılmıştır. Bu sonuçlar, mechanotransduction yollarının çalışmada bu yöntemin güçlülüğü destekler. Akış veya çekme kuvveti sistemleri genel olarak hücresel işlemleri teşvik Dahası, manyetik boncuk özel reseptör ligandları kullanarak, bir hücre yapışma reseptörünü hedefleyen 13, 15 karşı monoklonal antikorlar. Bu yöntemin diğer bir avantajı, basit bir bağ afinite saflaştırma prosedürü ile yapışma komplekslerinin izolasyondur. İyi hücrelere ligand kaplı boncuklar ilave yapışma reseptörleri bağlayan ve çeşitli yapışma proteinlerinin 23 alımı uyardığı bilinmektedir. Ligand kaplı manyetik boncuklar kuvvetlerin daha uygulaması 24, farklı gerilim bağımlı sinyalleme yolunu 4 aracılık makromoleküler platformlara bu yapışma kompleksleri döner. Bir mıknatıs kullanılarak kordon konsantrasyon izledi hücre liziz yapışma platformları izolasyonunu mümkün kılar. adezyon kompleksleri saflaştırmak için kullanılan diğer yöntemler, daha önce yapışkan hücreler kullanılmaktadır. Bunlar protein-protein etkileşimlerini muhafaza etmek için kimyasal çapraz-bağlanmasını birleştirirve deterjan ve kesme akış veya sonikasyon 20, 21, 25, 26, 27, 28, bir hücre parçalama adımı. Son adım yapışma kompleksleri içeren nihai ventral plazma zarlarının topluluğudur. Bu yöntemlerden farklı olarak, manyetik boncuk seçici adezyon reseptörlerinin özel bir ailesi hedef hücre yapışması kompleksleri daha büyük bir saflaştırma seviyesi sağlar. Manyetik boncuklar daha önce ligand kaplı mikro-29, 30 bağlı yapışmayan hücreler adezyon kompleksleri saflaştırılması için kullanılmıştır. kuvvet, kısa sürekli bir süre (dakika saniye) uygulanır taklit biyolojik durumlar aşağıda açıklanan yöntem. Bu nedenle, arıtılmış yapışma komplekslerinin moleküler kompozisyonu hem de soruşturma için güçlü bir araç sağlar veaşağı mechanosensitive-sinyal yolları. Burada yapışma yüzey proteinlerine gerilme kuvvetlerinin uygulamak için manyetik boncuklar kullanılarak için ayrıntılı bir deneysel protokol mevcut. Kalıcı Neodimyum mıknatıs kültür çanak yüzeyinin üstüne yerleştirilir. Tek bir 2.8 mikron manyetik boncuk kuvvet sabiti (yaklaşık 30-40 pN) 31 böylece mıknatıs kutup yüzü 6 mm yükseklikte yer almaktadır. Germe uyarım süresi çıkar ve aktivasyon zamanı ölçekli molekülüne bağlı olarak operatör tarafından belirlenir. Hücreler nihayet yapışma kompleksleri bir mıknatıs kullanarak boncuk ayırma ile saflaştırılmış ve biyokimyasal analizler işlenir, parçalanır. Bu protokol, ligand kaplamalı süperparamanyetik tanelerin hazırlanması ve biyokimyasal analizler, ardından Mıknatıs gerilim uygulanmasını içerir. Ayrıca, integrin tabanlı ADH uygulanan bu gerilim gösteren bir veri temsil eden örnek sunmakesions yapışma biçimlenme indükler ve protein tirosin fosforilasyonunu değiştirir.

<table><tbody><tr><td>Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>grade N52 dimension: 1 1/2&quot; dia. x 1/2&quot; thick</td></tr><tr><td>Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>grade N42 dimension: 1/2&quot; dia. x 1/4&quot; thick Black Plastic Coated&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>superparamagnetic beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>Fibronectin from bovine plasma</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428-50MG</td><td>Bovine Apo-Transferrin</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>60*15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads

Mechanosensitive hücre yüzeyi yapışma kompleksleri hücreler ortamda mekanik özellikleri duyu sağlar. Son zamanlarda yapılan çalışmalar adhezyon bölgelerinin kuvvet algılayıcı molekülleri, ve soy spesifik gen ekspresyonunu düzenleyen ve fenotipik çıktıları sürücü kuvveti bağımlı transkripsiyon faktörlerini belirledik. Ancak, biyokimyasal yollar içine mekanik gerilim dönüştürme sinyal ağları yakalanması zor kalmıştır. hücre yüzey reseptörüne uygulanan mekanik gerilim ile yapan sinyal yollarını araştırmak için, süperparamanyetik mikroboncuklar kullanılabilir. Burada hücre yüzeyi yapışma proteinlerine kuvvetleri uygulamak için, manyetik boncuklar kullanılarak bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, ligand kaplı boncuklara bağlı yapışma kompleksleri manyetik izolasyonu ile, sadece bir güç bağımlı çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar ile sitoplazmik sinyal yollarını ancak yapışma biçimlenme araştırılması mümkündür. Bu protokol ligand-co hazırlanmasını içermektedirated Süperparamanyetik boncuklar ve uygulama biyokimyasal analizler takip gerilme kuvvetleri tanımlar. Ayrıca, integrin tabanlı yapışma uygulanan gerilimin gösteren verilerin temsili numune yapışma biçimlenme tetikler ve protein tirozin fosforilasyonu değiştirir sağlar.

Tekniğin şematik Şekil 1a&#39;da gösterilmektedir. Ligand konjugasyon sonra, manyetik boncuk 20 dakika için hücreler ile kuluçkalanmıştır, ve daha sonra, kalıcı bir mıknatısın, çeşitli zaman miktarı için yaklaşık 30-40 pN gerilme kuvvetleri uygulamak için kullanılır. Şekil 1b MRC5 hücre yapışma reseptörlerine bağlanan 2.8 um FN-kaplı manyetik boncuklar gösterir. Hücre Parçalama işleminden sonra Süperparamanyetik boncuk yıkama aşamaları çok önemlidir ve arıtma derecesini belirler. Üç yıkamadan en az tavsiye edilir. Uzun pozlama ile GADPH immünblotlarında yapışma kompleksleri saflığını (Şekil 2a) test etmek için yararlı olabilir. FN-kaplanmış boncuklar gerilime karşılık olarak yapışma kompleksleri zaman içinde meydana mechanotransduction işlemlerini incelemek için kullanılmıştır. yapışma karmaşık fraksiyonun manyetik ayırma sonra, lizat ve yapışma karmaşık fraksiyon tarafından analiz edildiWestern blot. Beklendiği gibi, hatta, mekanik uyarma ile (Şekil 2b) yokluğunda adezyon kompleksleri fraksiyonu Talin, vinkülin ve paxillin ancak GAPDH görülmektedir. Daha önceki raporlarda 32 ile uyumlu olarak, 33, gerginlik yapışma kompleksleri vinkulin işe tetikledi. Germe yapışma komplekslerine paxillin işe etki yoktu, tirozin 31 üzerinde fosforilasyon toplam hücre lizatı ve adezyon kompleksi fraksiyon hem de mekanik gerilim yanıt olarak geliştirilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig1.jpg" /> Yöntemin 1. Açıklama Şekil. (A) tekniğinin şematik gösterimi. İstenen kaynaşma elde edilene kadar hücreler öncelikle kültür ortamı içinde kültürlenir. Daha sonra, süperparamanyetik taneler 15-20 dakika boyunca ilave edilir. Çekme kuvvetleri yaklaşık 30-40 pN vardırDaha sonra farklı zaman miktarı için kalibre mıknatıs kullanarak uyguladı. (B) fibronektin kaplı süperparamanyetik boncuklar hücre yapışma reseptörlerine bağlanır. Hücreler ortamda Süperparamanyetik boncuk (beyaz ok) eklendikten sonra iletilen ışık mikroskobu 15 dakika faz kontrast tarafından görüntülenmiş. (Üst resim: Ölçek çubuğu = 25 mikron, alt resim: Ölçek çubuğu = 100 mikron) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55330/55330fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig2.jpg" /> Şekil 2. mekanik gerilim yapışma olgunlaşmasını indükler. Adezyon kompleksleri (A) saflaştırma. GAPDH immünoblot toplam hücre lizatı için yükleme kontrolü olarak kullanılır ve yapışma kompleksleri saflığını kontrol etmek için. nitroselüloz membran th göstermek için uzun bir pozlama kullanılarak görüntülendi olmuşturyapışma karmaşık fraksiyonunda sinyalin e yokluğu. (B) Gerilim yapışma olgunlaşmasını uyarır. Yükleme kontrol (GAPDH) ve mekanik gerilmeye cevap olarak işe ya da yapışma kompleksleri fosforile olduğu bilinen aday (vinkülin Talin ve paxillin) bağışık lekelenmesi edilir. Bu deney, MRC5 hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55330/55330fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads at JoVE.com

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

analyzing-cell-surface-adhesion-remodeling-response-to-mechanical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Görüntüleme.  Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR.  mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut. 

Video: Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Biyomühendislik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Biyokimya

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Kalbinde Manyetik Boncuklar Kullanılarak İn Vivo Mekanotransdüksiyon Çalışması

Manipulating Mechanical Forces in the Developing Zebrafish Heart Using Magnetic Beads

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction and physical stimuli generated by the beating heart. Intracardiac hemodynamics, driven by blood flow, emerge as fundamental information shaping the development of the embryonic heart. Here, we describe an effective method to manipulate mechanical forces in vivo by grafting a 30 &#181;m to 60 &#181;m diameter magnetic bead in the cardiac lumen. The insertion of the bead is conducted through microsurgery in anesthetized larvae without perturbing heart function and enables artificial alteration of the boundary conditions, thereby modifying flow forces in the system. As a result, the presence of the bead amplifies the mechanical forces experienced by endocardial cells and can directly trigger mechanical stimulus-dependent calcium influx. This approach facilitates the investigation of mechanotransduction pathways that govern heart development and can provide insights into the role of mechanical forces in cardiac valve morphogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Zebra Balığı Kalbinin Şekillenmesinde Rol Oynayan Mekanik Kuvvetleri Anlamak

This protocol outlines a method for grafting a magnetic bead into the developing zebrafish heart through microsurgery, enabling the manipulation of mechanical forces in vivo and triggering mechanical stimulus-dependent calcium influx in endocardial cells.

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Kalbindeki Mekanik Kuvvetlerin Manyetik Boncuklar Kullanılarak Manipüle Edilmesi

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction ...

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Kalbindeki Mekanik Kuvvetlerin Manyetik Boncuklar Kullanılarak Manipüle Edilmesi

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Kalbindeki Mekanik Kuvvetlerin Manyetik Boncuklar Kullanılarak Manipüle Edilmesi

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Kalbindeki Mekanik Kuvvetlerin Manyetik Boncuklar Kullanılarak Manipüle Edilmesi