Bu çalışma TU Delft, Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO), Maddenin üzerine Temel Araştırma Vakfı ve Avrupa Bilim Vakfı tarafından desteklenen oldu.

DNA 1. Numunenin. Hazırlanması ve Kuluçka <ol><li> Sırasıyla, 18 çoklu biotin ve digoksigenin gruplar ile işlevselleştirilmiş uçları (tipik olarak ≈ 600 bp DNA PCR fragmanlarının kullanılması) dubleks ligate edilir DNA yapıları hazırlayın. Başlangıç ​​olarak,&gt; 1, bir DNA bağlama ipi uzunluğu um, örneğin, burada kullanıldığı üzere ~ 2.7 um&#39;lik gerilmiş bir uzunluğa tekabül eden bir 7.9 kbp, kullanım kolaylığı için tavsiye edilir; özellikle de, benzer ya da topuk kısmı yarıçapından daha kısa olan bir DNA uzunluğu kullanarak nedeniyle MTT ve FOMT olarak bağlanma geometrisi nedeniyle sorunludur. DNA uzunluğu açısal etki geçici yanıtı etkiler nasıl bir açıklaması için Tartışma bakın. </li><li> Tek-molekül deneyler için akış hücreleri birleştirin. Akış hücreleri için, bir çift katmanlı Parafilm aralayıcı ile ayrılmış iki cam mikroskop lamelleri kullanın. Üst mikroskop lamel-ve sıvı hücreye satış için iki delik olmalıdır. Bu uygundurdelikler Kumlama kullanın. Alt lamel nitroselüloz (amil asetat içinde% 0.1 wt / vol) ile kaplanır. Alt slaytlar nitroselüloz kaplanmış tarafında Parafilm aralayıcıları yerleştirin ve temiz üst slaytlar ile üst kısmını kapatın. </li><li> Akış hücreleri Seal. Fiziksel cımbız kullanarak, yaklaşık 1 dakika boyunca 80-100 ° C&#39;ye ayarlanmış bir ısıtıcı plaka üzerine monte akış hücresi yerleştirin. Parafilm giriş ve çıkış ve cam slaytlar iyi hizalanmış olduğunu bağlanmak deliklerini kapatmak olmadığını, akış hücresi de mühürlü olmasına dikkat edin. Not: iyi bir sızdırmazlık sağlamak için, büyük bir pamuklu çubuk kullanarak strok dışarı Parafilm kabarcıkları tavsiye edilir. Akış Hücre daha sonra manyetik cımbız alet monte edilebilir. </li><li> Tamponlar hazırlamak. TE bağlama tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), ve 200 mM NaCI) hazırlayın. Alternatif olarak, bir (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM fosfat tamponu, pH 7.4) ile takviye edilmiş PBS w tampon kullanabilirith 100 ug / ml BSA, bağlama tamponu olarak% 0.1 Tween ve 5 mM sodyum azit (PBS +). Akış hücre içine gömme 2-3 hücre hacimleri TE bağlama tamponu. </li><li> ~ 30 dakika boyunca akış hücresi içinde 0,5 veya 1,5 um çapı manyetik olmayan bir lateks boncuk inkübe edin. Bu boncuklar bir (akış hücresi yani) objektif ve numune tutucu arasındaki sürüklenme etkisini en aza indirmek için izin manyetik cımbız ölçümleri sırasında referans boncuklar olarak hareket edecektir. TE bağlama tamponu 2-3 hücre hacimleri ile durulama bekâr olmayan manyetik boncuk yıkayın. </li><li> En az 1 saat boyunca PBS içerisinde 100 ug / ml anti-digoksijenin ile inkübasyon yoluyla akış hücresinin alt yüzeyi işlevselleştirilmesi (tercihen daha uzun; inkübasyon gece boyunca gerçekleştirilebilir), DNA bağlanması için elde edildi. TE bağlama tamponu 2-3 hücre hacimleri ile durulayın. Son olarak yüzey pasivasyonu için, 30 dakika boyunca birleştirme TE tamponu içinde 2 mg / ml sığır serum albümini (BSA) ile inkübe edin akış hücresi. </li><li> Bir kısım arasında alın2 ml streptavidin-kaplı süperparamanyetik myone boncukları (Malzemelerin Tartışma ve Tablo) ve 10 ml TE birleştirme tamponu ile seyreltin. 10 ml TE bağlama tamponu içinde bir manyetik parçacık yoğunlaştırıcı ve tekrar süspansiyon kullanılarak 10 ml TE birleştirme tamponu ile iki kere yıkayın. 30 dakika boyunca TE bağlama tamponu içerisinde kuluçkalama ile bu boncuklara DNA moleküllerinin (yaklaşık 1 ng) ~ 1 ml takın. </li><li> 90 ml TE tamponu ekleyerek birleştirme DNA-gergin süperparamanyetik boncuk on-kat çözeltisi ile seyreltilir. Son olarak, akış hücresi içine enjekte solüsyonu ve anti-digoksigenin kaplı yüzeye DNA tespit olmasına imkan vermek için yaklaşık 1 saat boyunca inkübe edilir. TE bağlama tamponu ile iyice akış hücresi yıkayın. DNA konstruktlarının halata inkübasyondan sonra, bağlı olmayan tüm tanelerin çıkarılması için (bu TE bağlama tamponu olabilir) deney tamponu ile yoğun yıkayın. </li><li> Manyetik boncuklara bağlı referans işareti boncuk gerektiren bir açısal izleme protokolünü kullanan ölçümleri için <sup&gt; 23 (Tartışma), en az 30 dakika süre ile TE tampon maddesi içinde birleştirme markör boncuk 1.000-kat seyreltilmiş stok ile akış hücresi inkübe ve iyice tamponu ile yıkayın. </li></ol> Geleneksel Manyetik Cımbız içinde tek bir DNA molekülü üzerinde 2. Ölçümler <ol><li> Akış hücresi içinde döner kısıtlanmış DNA molekülleri için arama, geleneksel bir MT (Tartışma) uygun alan yapılandırma ile (Şekil 1a) ve translasyon ve mıknatıs konumun dönme kontrolünü hem de kullanma. ≥ 1 PN çekme kuvvetleri de (manyetik cımbız Yürürlükteki kalibrasyon ile ilgili referanslar 4, 19, 20, 28, 29 bakınız), gergin boncuk kolayca odak onların farklı yükseklikleri ile alt sürgünün yüzeyine yapışmış boncuklar ayırt edilebilir . Bir DNA molekülü, döner kısıtlı olsun, 20-30 dönüş getirerek değerlendirilebilir≈ 0.25 pN bir kuvvette mıknatısların s: Burada, urgan uzunluğu 0,4-0,5 mikron ile düşmelidir. Not: Manyetik cımbız deneyler çalıştırmak için, görüntü işleme DNA gergin boncuk x, y, ve z konumunu belirlemek için kullanılır. Bu amaç için özel Labview yazılım istek üzerine yazarların edinilebilir. <ol><li> Boncuk tek bir DNA ip ile takılı olduğundan emin olun. Bu&gt; 1 pN (Şekil 2a) kuvvetleri pozitif ve negatif sarım altında davranışı karşılaştırılarak yapılabilir. Bir DNA bağlama elemanları, asimetrik bir yanıta neden olacaktır, oysa bu kuvvet rejimde, birden çok DNA iplerini varlığı, pozitif ve negatif döner sokulması üzerine uzantısında yaklaşık olarak simetrik bir azalmaya neden olacaktır. </li></ol></li><li> Uygun sabit boncuk kullanıcı ara referans boncuk olarak hizmet edebilir, ilgi konusu şeridin yakın alt yüzeyine yapışmış. </li><li> T uzunluğunu kalibre, DNA, l. Flowcell yüzeyinin pozisyonu (0,2 pN altında bir kuvvet ~ 60 dönüşümlü olarak döner mıknatıs ile, örneğin) yüzeyi ile temas halinde gergin boncuk getirerek belirlenebilir. Bu yüzey ile ilgili olarak gergin boncuk dikey konumda ölçümleri daha sonra l mutlak değeri hakkında rapor. Not: sürüklenme daha sonra etkilerini en aza indirmek için, yüzeye tespit edilmiş bir referans boncuk pozisyonuna l nisbetle ölçümleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. </li><li> Bir dönüş eğrisi ≈ 0.25 pN (Şekil 2a) bir germe kuvveti de (sarım sayısının bir fonksiyonu olarak DNA uzantısının yani ölçümü) kaydedin. <ol><li> Bu DNA molekülü burarak rahat hangi durumuna karşılık olarak uzatma, maksimum olduğu anda dönüşlerin sayısını belirleyin. Bunu yapmak için, bu merkezi positi belirlemek için bir parabolik ya da bir Gauss fonksiyonu ile yerel olarak dönme eğri uyması için yararlıdırüzerinde. &quot;Sıfır döner&quot; olarak bu noktayı tanımlayın. Not: Bu amaç için özel rutin yazılı talebi üzerine yazarların edinilebilir. </li></ol></li><li> ~ 20 mıknatıs pozisyonların bir dizi için, (&quot;sıfır döner&quot; de, yani adım 2.4.1 bakınız) burarak rahat molekülünün ortalama uzantısı belirlemek z-iz,. </li><li> Adım 2,5 her bir ölçüm noktası için, tam x veya y konuma 20, 28, 29 dalgalanmalardan germe kuvveti belirlemek ya da boncuk mıknatıslanma yerel alan gradyanı 4 bilgisini kullanarak, iyi bilinen da temin edilmektedir. Bir kuvvet-genişleme eğrisini ortalama uzantı sonuçlar karşı germe kuvveti çizimi (Şekil 2b). <ol><li> Bouchiat ark 30 tarafından polinom yaklaşımını kullanarak solucan benzeri zincir denklemine çıkan kuvvet-uzatma veri sığdırmak. </li></ol></li&gt; <li> Daha sonra FOMT ölçümleri için hazırlık (x, y) &#39;de manyetik boncuk gezi kayıt sırasında, yavaş yavaş mıknatıslar döndürün. Not: geleneksel MT yapılandırmada elde edilen halka yarıçapı ne kadar küçük olursa, o kadar yakından DNA molekülü daha yakın manyetik boncuk &quot;güney kutbu&quot; gergin edilir. Bir FOMT konfigürasyona geçer, bu tür bir DNA molekülü, (x, y) konumu (Tartışma) arasındaki dönme açısı, güvenilir izleme sağlayan manyetik boncuk &quot;ekvator&quot;, yakından gergin olacaktır. </li></ol> Serbestçe-yörüngedeki Manyetik Cımbız kullanarak DNA Twist 3. Ölçümleri <ol><li> El FOMT (Şekil 1b) için kullanılan bir silindir mıknatıs tarafından, geleneksel manyetik cımbız kare mıknatıslar değiştirin. Bu işlem, seçilen DNA ip görüş alanı içinde kalacağı bir şekilde yapılmalıdır. <ol&gt; <li> Bu sadece geleneksel cımbız yapılandırma için mıknatısları tutan tam mıknatıs baş sökerek ve FOMT için silindirik bir mıknatıs tutan bir mıknatıs kafa değiştirerek en az 1 dakika içinde gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> Tek bir dsDNA ile ip ile gergin bir manyetik boncuk (x, y) &#39;de gezi silindirik bir mıknatıs (Şekil 1b, Şekil 3a) eksenine göre şeridin pozisyonuna kuvvetle bağlıdır. Karakteristik dalgalanma desendeki en uygun konumu (Şekil 3a belirlemek amacıyla (x, y) gezi kaydedin Tartışma). </li><li> FOMT içinde mıknatısın kaba uyum gerçekleştirin. Bu, (x, y) için aşamaları kullanılarak akış hücresi üzerinde silindirik mıknatıs hareket ile elde edilebilir. (X, y) geziler bir yay izlerseniz, silindir mıknatıs düzgün hizalanmış ve hareket gerekiyor değilUygun yönünde (Şekil 3b). <ol><li> Kaba hizalama 7.9 kbp iplerini ile myone boncuk durumunda 15 dakika içinde gerçekleştirilir ve edilebilir tam zaman dairesel hareketlerle (Şekil 3b, merkezi) gözlem (x, y) geziler sonuçlarının ölçülmesi. Not: Kaba hizalama 21, 31 (Temsilcisi Sonuçlar, Şekil 5), rağmen eşlik eden iki boyutlu histogram onun sayıları olmayabilir FOMT yapılandırmada tethered tek DNA&#39;lar için bağlayıcı protein occasioned büküm değişiklikleri gözlemlemek için genellikle yeterlidir kesinlikle eşit dairesel halka (Şekil 3c) boyunca dağıtılmıştır. </li></ol></li><li> , Daha başka deneyler için gerekli olursa, FOMT ince hizalama yerine getirir. Bu yüzde için mıknatıs ya da akış hücresi taşımak için ya yüksek çözünürlüklü mikrometre vida ya da bir yüksek çözünürlüklü otomatik aşama kullanılarak elde edilebilirer ~ 10 um içindeki bir kordonun üzerine silindirik bir mıknatıs. Ince hizalama aşamada, mıknatıs dikkatle daire halka üzerindeki dalgalanmaların nedeniyle mıknatısa tam bir dönüşü için, enerji bariyeri k T B (Şekil 4) olduğu bir duruma karşılık gelen, yaklaşık olarak eşit olduğu şekilde konumlandırılmıştır. Not: Şekil 4 gibi bir histogram ya termogramında dalgalanmaları komplo için MATLAB komut istek üzerine yazarların edinilebilir. Not: İnce hizalama 7.9 kbp iplerini ile myone boncuk durumda 45 dakika içinde yapılabilir ve daha küçük boncuklar ve daha kısa iplerini azaltılmış üretildikten (Tartışma) istihdam edilmektedir. Not: İnce hizalama genellikle çıplak veya protein kaplı DNA burulma direnci ölçümleri (Temsilcisi Sonuçlar, Şekil 4) gerçekleştirmek için gereklidir. </li><li> Analiz için gerekli olursa, FOMT içindeki kuvveti kalibre edin. Bu i yapılabilirboncuğun mıknatıslanma Resim &lt;R 2&gt; (açılı parantez zaman ortalamasını ifade eder) birlikte bir video gösterilir ve Lipfert et al 21&#39;de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, ya da boncuk radyal dalgalanmalar kullanılarak MT na benzer bir şekilde, iyi bir yerel alan gradyan 21 bilgisini kullanarak, bilinir. </li></ol> 4.. Manyetik Tork Cımbız kullanarak DNA Tork Ölçümleri <ol><li> El ile silindirik bir mıknatıs artı MTT için bir yan (kalıcı) mıknatıs (Şekil 1c) tarafından FOMT için kullanılan silindirik mıknatıs değiştirin. Bu işlem, seçilen DNA ip görüş alanı içinde kalacağı bir şekilde yapılmalıdır. <ol><li> Bunu başarmak için en basit yolu el 1 dakika içinde yapılabilir onun doğru yerde yan mıknatıs, eklemektir. Başka bir yeniden düzenlenmesi gereklidir. Not: bir yan mıknatıs için alternatif bir kullanımı,32&#39;yi Elektromıknatıslar. </li></ol></li><li> Analiz için gerekli, yerel alan gradyanı 21 bilgisini kullanarak, boncuk X veya Y dalgalanmaları kullanarak, MT için benzer bir şekilde kuvvet kalibre, kordonun mıknatıslanma Resim iyi bilinmektedir. </li><li> Fiducial tabanlı bir izleme protokolü 23 ya da eşlik eden videoda gösterildiği gibi, (x, y)-pozisyonu (Tartışma) izleme dayalı açısal izleme protokolünü kullanarak zaman θ (t) bir fonksiyonu olarak açısal dalgalanmalar izleyebilirsiniz. İlk durumda, sonraki görüntü işleme için zamanın bir fonksiyonu olarak kordonun tam görüntü kaydetmek. Bu son durumda, bu aşamada da boncuk (x, y) dalgalanmaları kaydetmek için yeterlidir. Not: referans tabanlı bir izleme protokolünde, zamanın bir fonksiyonu olarak kordonun tam görüntülerden θ (t) saptanması için bir komut MATLAB biristek üzerine yazarlardan ULLANILABİLEN. <ol><li> Bu mıknatıslar (tipik olarak 0.1 Hz), birkaç tur döndürülür yavaş yavaş olan bir zaman iz kaydetmek için de tavsiye edilir (x, y)-pozisyonunun izlenmesi göre açısal izleme protokolü için, Tartışma tarif edildiği gibi. Bu bir doğru Tartışma denklemleri 3-5 kullanılarak polar koordinatlara (θ r) içine kartezyen koordinatlar (x, y) dönüştürmek için izin verecektir. Not: (x, y)-pozisyonu istek üzerine yazarların edinilebilir izleme dayalı açısal izleme komut dosyası için bir MATLAB komut dosyası. Not: ölçüm zaman istenen tork çözünürlük çoğunlukla bağlıdır. Ayrıntılı bir tartışma Lipfert et al 24 &#39;de verilmiştir. Myone boncuklar ve 30-100 saniye boyunca ölçme 8 kbp DNA bağlama elemanları, ~ 1 pN · nm aralığında bir tork kararı vermek için yeterli olmalıdır. </li></ol></li><li> Th burulma tuzak sertliğini belirlemekaçısal dalgalanmalar e varyans kullanılarak (σ radyan cinsinden, 2 θ): k θ = k B T / σ θ 2 (1) Not: MTT elde tipik dönme tuzak sertliği 10-1,000 pN · nm / rad, geleneksel manyetik cımbız için daha düşük bir aralık içindedir. </li><li> Buna ek olarak, kordonun z-konumunu kaydetmek ve (aynı zamanda bakınız 2,4-2,7 adım) olarak şeridin uzunluğu l belirlemek için kullanabilir. </li><li> Döndür N döner ve tekrar (t) ve l (t) θ kaydedebilirsiniz. Not: MT kıyasla MTT azaltılmış dönme tuzak sertliği tek bir molekül tork ölçümleri için uygun bir hale getirir, fakat tatbik edilebilecek maksimum tork azalır anlamına gelir. Bu MTT hızlı dönmesinden kaynaklanan yüksek çekme momentlerini dengelemek mümkün olmayabilir anlamına gelir. Bakım dolayısıyla maksimum hızı geçmeyecek şekilde alınmalıdır; typically 0.1 Hz yakın oranlarda döndürün. </li><li> N kullanarak kapandıktan sonra nükleik asit ipten biriken torku belirleyin: Γ = - k θ &lt;θ N - 0 θ&gt; (2) Burada &lt;...&gt; ortalama ve θ 0 ve θ N sıfır dönüşlerde açı (a torsiyonel olarak rahat bir ip için tekabül eden temsil eder, sırası ile, bkz. 2.3 adım ve N döner. </li><li> Tekrar tam olarak tek bir ölçüm vadede bir molekülün tork tepkisi (Örnek Sonuçlar, Şekil 6) tespit etmek için 4.5 ve gerektiğinde 4.6 adımları tekrarlayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+a+single+supercoiled+DNA+molecule.">The elasticity of a single supercoiled DNA molecule.</a> Science. 271, 1835-1837 (1996).</li><li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+tension:+single-molecule+DNA+mechanics.">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421, 423-427 (2003).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature methods. 5, 491-505 (2008).</li><li>Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+modeling+and+optimization+of+magnetic+tweezers.">Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers.</a> Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).</li><li>Ribeck, N., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+measurements+with+magnetic+tweezers.">Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers.</a> The Review of scientific instruments. 79, (2008).</li><li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+magnetic+tweezers+by+targeted+DNA+tethering.">Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering.</a> Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).</li><li>Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+for+regulating+DNA+supercoiling:+a+single-molecule+perspective.">Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective.</a> Cell. 142, 519-530 (2010).</li><li>Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+genomic+processes+at+the+single-molecule+level:+introducing+the+tools+and+applications.">Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications.</a> Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).</li><li>Ajjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+variation+in+the+C-terminal+region+of+the+fibrinogen+beta-chain:+effects+on+fibrin+structure,+fibrinolysis+and+clot+rigidity.">Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity.</a> Blood. 111, 643-650 (2008).</li><li>Mierke, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-coupling+and+regulation+of+contractility+by+the+vinculin+tail+domain.">Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain.</a> Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).</li><li>Shang, H., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers+measurement+of+the+bond+lifetime-force+behavior+of+the+IgG-protein+A+specific+molecular+interaction.">Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).</li><li>Shang, H. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+magnetic+force+differentiation+for+the+measurement+of+the+affinity+of+peptide+libraries.">The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries.</a> J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).</li><li>Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+force+differentiation+in+the+immunoassay.">Implementation of force differentiation in the immunoassay.</a> Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).</li><li>Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-induced+growth+of+adhesion+domains+is+controlled+by+receptor+mobility.">Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).</li><li>Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+manipulation+of+chromatin+using+magnetic+nanoparticles.">Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).</li><li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers+in+cell+biology.">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).</li><li>Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+viscoelasticity+and+forces+in+living+cells+by+magnetic+tweezers.">Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers.</a> Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).</li><li>Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+magnetic+tweezers+studies+of+type+IB+topoisomerases.">Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases.</a> Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).</li><li>Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H., Hinterdorder, P., van Oijen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Single-Molecule Biophysics. , (2009).</li><li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers:+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level.">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).</li><li>Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freely+orbiting+magnetic+tweezers+to+directly+monitor+changes+in+the+twist+of+nucleic+acids.">Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids.</a> Nature communications. 2, 439 (2011).</li><li>Celedon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers+measurement+of+single+molecule+torque.">Magnetic tweezers measurement of single molecule torque.</a> Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).</li><li>Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+track+rotational+motion+for+use+in+single-molecule+biophysics.">A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics.</a> The Review of scientific instruments. 82, (2011).</li><li>Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+torque+tweezers:+measuring+torsional+stiffness+in+DNA+and+RecA-DNA+filaments.">Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments.</a> Nature. 7, 977-980 (2010).</li><li>Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+torque+on+a+single+stretched+and+twisted+DNA+using+magnetic+tweezers.">Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers.</a> Physical review letters. , 102 (2009).</li><li>Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+magnetic+tweezers:+A+proof+of+principle.">Soft magnetic tweezers: A proof of principle.</a> Review of Scientific Instruments. 82 (12), (2011).</li><li>Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mechanical+measurements+reveal+the+material+properties+of+three-dimensional+DNA+origami.">Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami.</a> Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).</li><li>Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Guidelines+for+Force+Calibration+through+Spectral+Analysis+of+Magnetic+Tweezers+Data.">Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data.</a> Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).</li><li>Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+spectrum+and+Allan+variance+methods+for+calibrating+single-molecule+video-tracking+instruments.">Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments.</a> The Review of scientific instruments. 83, (2012).</li><li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements.">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).</li><li>Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+torsional+properties+of+the+RAD51-dsDNA+nucleoprotein+filament.">Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament.</a> Nucleic acids research. 41, (2013).</li><li>Janssen, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+torque+tweezers:+a+versatile+approach+for+measurement+of+single-molecule+twist+and+torque.">Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque.</a> Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).</li><li>Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+effects+on+the+elasticity+of+single+DNA+molecules.">Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).</li><li>Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freely+orbiting+magnetic+tweezers+to+directly+monitor+changes+in+the+twist+of+nucleic+acids.">Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids.</a> Nat Commun. 2, 439 (2011).</li><li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles.">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).</li><li>Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+kinesin-driven+movements+with+nanometre-scale+precision.">Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision.</a> Nature. 331, 450-453 (1988).</li><li>Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-bias-limited+tracking+of+spherical+particles,+enabling+nanometer+resolution+at+low+magnification.">Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification.</a> Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).</li><li>Kim, K., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+magnetic+tweezer+for+single-molecule+measurements.">A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements.</a> Nucleic acids research. 37, 136 (2009).</li><li>Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofabricated+quartz+cylinders+for+angular+trapping:+DNA+supercoiling+torque+detection.">Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection.</a> Nature methods. 4, 223-225 (2007).</li><li>Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+beam+fabrication+of+birefringent+microcylinders.">Electron beam fabrication of birefringent microcylinders.</a> ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).</li><li>La Porta, A., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+torque+wrench:+angular+trapping,+rotation,+and+torque+detection+of+quartz+microparticles.">Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles.</a> Physical review letters. 92, (2004).</li><li>Gore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+overwinds+when+stretched.">DNA overwinds when stretched.</a> Nature. 442, 836-839 (2006).</li><li>Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+single-molecule+DNA+mechanics.">Recent developments in single-molecule DNA mechanics.</a> Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).</li><li>Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torque+measurements+reveal+sequence-specific+cooperative+transitions+in+supercoiled+DNA.">Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).</li><li>Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torque+measurement+at+the+single-molecule+level.">Torque measurement at the single-molecule level.</a> Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).</li></ol>

Bu işle ilgili bir patent başvurusu PCT/NL2011/050446 altında açılmıştır.

MTT veya FOMT kullanarak deneyler çalıştırırken, seçimler bir numarası vb boncuk, mıknatıs, izleme protokolleri, yapılacak en iyi seçenek ilgi deney bağlıdır konusunda yapılması gerekmektedir. Aşağıda, belirli bir deney için seçimi kolaylaştırmak gereken, farklı seçimler eşlik dengeler açıklar. Sonra, MTT ve FOMT deneylerin uyum ve çalışan eşlik çeşitli kritik adımları anlatacağız. Son olarak, biz mevcut yöntemlere göre hem de gelecekteki uygulamaları ile MTT ve FOMT önemini tartışmak. Önceki MTT ve FOMT Deneylerin Başlat Hususlar Herhangi bir deneme kullanımı için manyetik boncuk bir türünü seçmek için birini gerektirir. Bir kaç piyasada bulunan streptavidin kaplı süperparamanyetik boncuklar, örneğin, 0.25 mikron yarıçapı boncuk, 0.5 mikron yarıçapı boncuk, veya 1.4 mikron yarıçapı boncuklar (ler arasında seçim yapabilirsiniz) malzemeleri tablo ee. Daha büyük taneleri (yaklaşık hacim olarak ölçekleme) daha küçük boncuklar ile karşılaştırıldığında, artan bir manyetik an olacaktır ve bu nedenle bunların kullanımı, daha yüksek kuvvetlerinin uygulanmasını kolaylaştıracak (eden araçlar sağlanmıştır tipik kuvvetleri için Tablo 1 &#39;e bakınız). Işaretleyici boncuklar kullanılarak açısal izleme istendiği zaman, tipik olarak 1.4 mikron çapa sahip çalışma ve (karşılık gelen bağlanma protokolü için paragraf 1.9) işaret boncuklar olarak 0,5 um çapı manyetik olmayan bir biyotinile boncuk kullanır. Küçük boncuk kullanımı özellikle boncuk rotasyon τ için karakteristik zaman ölçeği olarak C gerçekten yay sabiti γ / k θ üzerinden sistemin sürükle oranına eşittir, FOMT için tavsiye edilir; önemlisi, ~ R boncuk 3, yani yarıçapının üçüncü gücü gibi açısal ölçüm zamanı gam hakkında dönme sürükleme katsayısı için (bkz. Tablo 2karakteristik zaman birkaç FOMT boncuk-DNA kombinasyonları ve MTT ölçümler) için ölçekler. Uygulanabilecek maksimum kuvvete eşlik eden azalmalar silindirik mıknatıslar 27 ters çevrilmiş bir yığın kullanılarak ele alınabilir. Bununla birlikte, FOMT ölçümlerde bazen en iyi elde zamansal çözünürlük ve maksimum uygulanan kuvvet arasında uyum sağlamak için gerekli olabilir. Buna ek olarak, bir deney bir mıknatıs konfigürasyonun seçimi gerektirir. , Geleneksel manyetik cımbız konfigürasyonu (Şekil 1a) olarak, tipik olarak, 4 mıknatıslar arasında bir 0.5 veya 1 mm bir boşluk ile dikey olarak 5x5x5 mm kübik bir çift mıknatıs kullanın. Mıknatıslar x (y) ekseni boyunca aralanmıştır, bu esas olarak x (y) ekseni boyunca yönlendirilen bir manyetik alan oluşur. FOMT deneyler için, silindir şeklinde bir mıknatıs kimin merkez manyetik alan esas yöneliktir seçilirz ekseni boyunca (Şekil 1b). Uygulamada, 6 mm toplam kalınlık için, bu tür üç silindirik şekilli mıknatıslar, 6 mm çapında ve 2 mm çaplı bir merkezi deliği olan, her bir yığın kullanın. Daha yüksek çekme kuvvetleri arzu edildiği zaman, alt mıknatıs karşı manyetizasyon ile istiflenmiş edildiği bir &quot;ters çevrilmiş yığın&quot; mıknatıs konfigürasyonu tercih edilir. MTT konfigürasyonu (Şekil 1c) elde etmek için, biz, FOMT yapılandırma, 4 mm çaplı ve 7 mm yükseklikte tipik olarak, bir katı silindirin ana mıknatıs yığının tarafına ek bir mıknatıs ilave edin. Bizim araçların elde maksimal kuvvetleri mıknatıs yapılandırmaya bağlı görmek bkz. Tablo 1 için. MTT ve FOMT Deneylerin Hizalama Manyetik boncuklar (yaklaşık olarak) eşit işlevselleştirilmiş yüzeye sahip olduğu için (tipik olarak streptavidin) ile fonksiyonelleştirilmiş n her ikisinin de bağlanması bu yanaucleic asit bağlama elemanları, ve işaretleyici boncuk (durumda markör boncuk esaslı açısal izleme kullanılır) bağlayıcı ve / veya manyetik işaretleyici boncuk boncuk takmak burada çözelti içinde basit bir kuluçkalama ile, tek bir kontrol etmez oluşur. Manyetik boncuklar dış alanın yönü boyunca hizalamak eğilimi tercih edilen bir mıknatıslanma eksene sahiptir. Biz tercih mıknatıslanma ekseni kuzey ve güney kutupları olarak boncuk yüzeyini kesen kredi ifade, daha sonra DNA-bağlama ipi ekvatora yakın bağlı olduğu boncuklar yakın ya da hafif daha büyük bir çapa sahip dairesel bir halkaya üzerinden yazacaktır FOMT boncuk yarıçapı; aksine, güney kutbuna yakın bağlı boncuk Denklem 3-5 kullanılarak dairenin uydurma engel, hangi FOMT çok küçük yarıçaplı dairesel bir halkanın üzerinde dalgalanma olacaktır. Biz basit küresel geometri ile, ekvatora yakın bağlama olasılığı tam kutuplarda bir eki çok daha büyük olduğuna dikkat; Bu nedenle, en bEADS gergin olacak (x, y) dayalı açısal izleme başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir şekildedir. Benzer bir tartışma referans işaretçi göre açısal takibi için markör boncukların bağlanması için de geçerlidir. Işaretleyici boncuk açısı izlemeyi sağlayan manyetik boncuk görüntüde bir asimetri oluşturmak için kullanılır. Işaretleyici boncuk boncuk (yani doğrudan üstünde veya altında) kuzey ya da güney kutbunda tam bağlıysa, çıkan görüntü yine rotasyona simetrik ve açısal izleme protokol başarısız olur. Ancak, aynı küresel geometri argüman tarafından, bir işaretleyici boncuk kutuplarından birinde doğrudan eklemek için şans nispeten küçük; pratikte en işaretleyici boncuk açısal izlemeyi etkinleştirmek için yeterli bir asimetri vermek bulabilirsiniz. Son olarak, geleneksel manyetik cımbız alan yönünde (x, y)-düzleminde olduğuna dikkat ediniz; bu nedenle, kordonun tercih edilen bir mıknatıslanma eksen th hizalanacaktıre (x, y)-düzlemi ve kuzey ve güney kutupları, yukarıda tanımlandığı gibi, kordonun kenarlarında olması muhtemel kutuplar üst ve alt kısmında FOMT veya MTT, durum. olacak FOMT deneylerde, önemli bir adım, radyal manyetik alan boncuk yakınlık ihmal edilebilir olduğu şekilde silindirik mıknatısın hizalamasıdır. Bu uyum, bir seferde tek bir boncuk için yapılır. FOMT boncuk hareket eşit bir dairesel halkanın üzerinde dağıtılmış olup olmadığını yargıç için, ölçüm süresi 20 · τ C&#39;yi aşmamalıdır. Τ C 8 kbp DNA ve 0.5 mm çapında boncuk için ~ 45 sn eşit olarak, ölçüm süresi uyum son aşamalarında ~ 900 sn. 1.9 kbp DNA karşılaştırılması, kullanımı ve 0.25 mm çapında boncuklar için τ C yirmi katlık bir ~ 2 saniye (ayrıca tablo 2&#39;yi görünüz) azaltır. F sırasında Takip için Kritik Adımlar ve DüşüncelerOMT ve MTT Deneyleri Boncuk düzlem dalgalanmaları izlemek için, onun (x, y)-konumunda, yani, daha sonra biz zaman aralıkları 35, 36 bir boncuk tarafından görüntülenen yoğunluk profilleri bir çapraz-bağıntı analizi kullanılabilir. Bu birkaç nanometre 20 bir doğruluk alt-piksel çözünürlükte yapılabilir. Z boncuk hareketi izlemek için, tipik olarak, nükleik asit, 20 bağlı olan boncuk kırılma halkaları görüntüleme sırasında amacı, odak düzlemi (OFP) doğru dikey yönde kaydırılır, burada ilk olarak, Gosse ve Kroket tarafından tasarlanan bir yöntem kullanınız . Bu şekilde, bir kalibrasyon profil çubuk ile OFP 19 arasındaki mesafeye göre boncuğun kırılma motifi arasında ilişki üretilir. Bu kalibrasyon profili interpolasyon zaman, boncuk, dikey yer değiştirmeler de birkaç nm, 20 kadar bir hassasiyetle ölçülebilir.Biz daha rafine izleme algoritmaları 37, 38 yanı sıra birden fazla boncuk 5, 6, 37 izleme paralel uygulamalarını açıklayan ek başvurular okuyucu bakın. Açısal koordinatlara (x, y)-pozisyonların dönüşüm dayanır açısal izlemeyi kullanırken, biz şöyle devam tavsiye. Boncuk kullanmak, dairesel bir halkasını dışarı izleri hangi bir zaman izlemesi (x i, y i) pozisyonları (ben nerede sonraki ölçüm noktaları gösterir indeks) daire merkezini (x 0, y 0) ve yarıçapı R daire sığacak en aza indirerek (Şekil 2a): <img src="/files/ftp_upload/51503/51503eq3.jpg" width="320" fo:content-width="3.2in" /> (3) toplamı tüm veri noktaları üzerinde çalışır nerede. Fitti sonrang x 0, y 0 ve R daire kullanarak zaman iz her veri noktasının kutupsal koordinatları (r i, θ i) belirler: <img src="/files/ftp_upload/51503/51503eq4.jpg" width="200" fo:content-width="2in" /> (4) <img src="/files/ftp_upload/51503/51503eq5.jpg" width="120" fo:content-width="1.2in" /> (5) Bir fazlı ± bir atlayış π uygun durumlarda eklemek için, yani açı θ &quot;açmak&quot; için bakmak gerektiğini unutmayın. (R, θ) koordinatları (x, y) montaj ve dönüşüm için özel yazılmış kod istek üzerine yazarların edinilebilir. FOMT olarak, boncuk bir dairevi çark üzerinden izler iz hangi bir zaman hizalama kaba (bakınız adım 3.3) sağlanması ve boncuk termal dalgalanmaları kayıt ile elde edilebilir. MTT, termal olarak fluctuations dairevi çark dışarı iz yetersiz; Bunun yerine, Denklemler 3-5 kullanarak daire sığacak şekilde birkaç tur döndürülür mıknatıslar (genellikle 0.1 Hz) yavaş yavaş olan bir zaman iz kullanın. Biz, (MTT için, bu açısal izleme işaretleyici (Şekil 1 c, Şekil 1d, Şekil 3a) ile veya açısal koordinatları halinde (x, y)-pozisyonların dönüşüm yoluyla, yani uygun bir açısal izleme yaklaşımı, seçim için önemli olduğuna dikkat Şekil 1d, Şekil 2b). Tipik olarak (x, y)-pozisyonları ve işaretleyici boncuk kullanımından açısal izleme doğruluk karşılaştırılabilir iken, tarif edildiği gibi bu çapraz-karışma, (x, y) ve açısında bir boncuk dalgalanmalar arasında meydana gerçekleştirmek için önemlidir Janssen ve diğerleri 32: Bu şekilde, (x, y)-pozisyonlarından açısal izleme Resim geçerli olduğu (x Brownian dalgalanmalar, Y) koordinat açısal belirsizlik ve (x, y) izleme yan mıknatısın konumunun ayarlanması ile dönme tuzak sertliğinin ayarlama gerektirebilir onun doğru kullanımı için sadece önemsiz ölçüde katkıda bulunur. Tipik olarak, daha yüksek sertlik tuzak kullanılmasıdır işaretleyici boncuklar kullanılarak açısal takip kullanımını gerektirir. Işaretleyici boncuk kullanılması (aşama 1.9 &#39;de bağlanma protokolü) kullanılabilir iplerini sayısını azaltabilir bir başka ek bir adım gerektirir. Işaretleyici boncuk-tabanlı izleme kullanırken, bir işaretleyici boncuk iyi sonuçlar için ekvatora yakın bağlı olan manyetik boncuk seçmek önemlidir. FOMT ve MTT Önemi Mevcut Yöntemleri ve Uygulamaları karşılaştırıldığında Yaklaşımlar Yukarıda, kolaylıkla MTT veya FOMT içine aleti dönüştürmek için mıknatıs yapılandırmaları ve değişiklikler, bir geleneksel MT başlangıç ​​nasıl göstermiştir. Bu basit modification, bir açısal izleme marker kullanımı istenen açısal izleme giriş eşlik edilebilir, bu bağlı olarak, tork uygulamak tork ölçmek veya büküm ölçmek için kullanıcıya izin verir gibi, her iki yapılandırmaları derhal bir güçlü noktası eldeki deneme. Giriş kısmında belirtildiği gibi, FOMT ve aynı zamanda paralel ölçümler 5 yeteneği yararlanan özellikle de MTT ile, özellikle sadeliği, MT mevcut güçlü birçok ikinci MTT yarar her ikisi de 6 (verilen bu kadar kolay FOMT elde değildir silindirik mıknatısın merkezi ile ilgili olarak şeridin hizalanma gerekliliği). Özellikle, MTT ve FOMT diğer tekniklerle, özel olarak imal edilmiş nano-parçacıklar 22, 39, 40, karmaşık bir optik tasarım 41, ya da gergin içinde ek boncuk tanıtımı (DNA) molekülü, 42 aksine, gerektirmez. O Bu türorada teknikler de bu tür daha yüksek zamansal çözünürlüğü 27, 43, 44 gibi başka avantajlar sağlayabilir. DNA moleküler motorların davranışı hem de etkilenir ve yerel büküm ve tork için sonuçlara sahip olarak FOMT MTT ve her ikisi de, genom işleme çalışmaya gelecek uygulamalar bulmak gerekmektedir. Ek uygulamalar DNA nanoteknoloji 27 çıkan alanında veya biyolojik işleme 7, 45 aktif döner motorların daha geniş bir alan bulunabilir. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> M270 (R boncuk = 1.4 um) </td><td> Myone (R boncuk = 0.5 um) </td><td> ADEMTECH (R boncuk = 0.25 um) </td></tr><tr><td> Konvansiyonel MT (kübik 5 x 5 x 5 mm 3 mıknatıs çifti, 1 mm boşluk, dikey hizalama) </td><td> 70 pN </td><td> 8 pN </td><td> 1.6 pN</td></tr><tr><td> FOMT veya MTT * (üç silindirik mıknatıslar yığını, 6 mm çaplı, 2 mm çaplı boşluk) </td><td> 9 pN </td><td> 1 pN </td><td> 0.2 pN </td></tr><tr><td> FOMT veya MTT * (üç silindirik mıknatıslar yığını, 6 mm çapında, 1 mm çaplı boşluk) </td><td> 18 pN </td><td> 2 pN </td><td> 0.4 pN </td></tr><tr><td> FOMT veya MTT * (sonuncusu üç silindirik mıknatıslar yığını saygısız, çapı 1 mm boşluk) </td><td> ~ 50 pN </td><td> 9 pN </td><td> 1.8 pN </td></tr></tbody></table> * MTT küçük yan mıknatısın varlığı germe kuvveti üzerinde önemsiz bir etkiye sahip Tablo 1. Maksimum kuvvetler tipik olarak farklı mıknatıs konfigürasyonları ve boncuk türleri için elde etti. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> R boncuk = 1.4 um </td><td> R boncuk = 0.5 um </td><td> R boncuk =0.25 mikron </td></tr><tr><td> Sürtünme katsayısı * </td><td> 120 pN · nm · sn </td><td> 5.5 pN · nm · sn </td><td> 0.7 pN · nm · sn </td></tr><tr><td> Karakteristik zaman ölçeği: FOMT, 10 kbp&#39;lik DNA ** </td><td> 1200 san </td><td> 55 sn </td><td> 7 sn </td></tr><tr><td> Karakteristik zaman ölçeği: FOMT, 1 kbp&#39;lik DNA </td><td> 120 sn </td><td> 5.5 sn </td><td> 0.7 sn </td></tr><tr><td> Karakteristik zaman ölçeği: MTT, k, q = 100 pN · nm / rad </td><td> 1.2 sn </td><td> 0.06 sn </td><td> 0.007 sn </td></tr><tr><td> Karakteristik zaman ölçeği: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad </td><td> 0.12 sn </td><td> 0.006 sn = 6 milisaniye </td><td> 0.0007 s = 0.7 msn </td></tr></tbody></table> * &quot;Ekvator&quot; aracılığıyla bir eksen etrafında dönmek için sürtünme katsayısı (Şekil 1b de gösterildiği gibi bir durum, yani), 14 ile verilen p · · s · s tampon viskozitesidir R boncuk 3,. ** FOMT olarak, dönme tuzak sertlik DNA burulma sertliği, k, q ile verilir, DNA = C · C, etkin burulma kalıcılık uzunluğudur k B T / L C, (burada 80 nm olduğu varsayılmıştır bir ara kuvvet rejimi, F ~ 1 pN edilmiş) ve L C karakteristik olan DNA, baz çifti başına 0.34 nm kontur uzunluğudur. Tablo 2.. Sürtünme katsayıları ve karakteristik zaman FOMT ve MTT için ölçekler.

Son yıllarda, tek bir molekül teknikleri kinetiği ve temel Mekanokimya fikir verecek, ilerleyici motor proteinlerinin ve diğer enzimlerin çalışmada, geniş uygulanabilirliği kanıtlamıştır. Kuvvet spektroskopisi bağlamında önemli katkılar atomik kuvvet mikroskobu germe akışı, optik ve manyetik cımbız tarafından yapılmıştır. Optik ve manyetik cımbız (MT) özellikle yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip molekül manipülasyon açısından büyük esneklik birleştirerek başardılar. Burada, bir yüzey ve süperparamanyetik boncuk 1-3 arasında gergin biyolojik moleküllerin hem germe kuvvetleri ve momentleri uygulayabileceğiniz, MT odaklanmak. Manyetik cımbız (MT, Şekil 1a), mekanik, nükleik asitlerin özellikleri yanı sıra, proteinler ile etkileşimleri hem de izlemek için kullanılan bir çok ilginç bir tek moleküllü bir tekniktir. MT çok gücügenel basitlik ve sağlamlık deneysel uygulama, tork uyduruk uygulama, doğal çalışma ve sabit kuvvet modunda 4 basit kalibrasyon, ölçümleri 5, 6 paralel uzantısı ve numune ısıtma ve fotohasar yokluğu da dahil olmak üzere s. Diğer tek-molekül yaklaşımlar karşılaştırıldığında, MT ≈ 10 FN gibi düşük güçlerine güç-bağımlılık ölçümleri gerçekleştirmek ve sade bir dille süperburulma derecesini kontrol etmek yeteneğine sahip bir yol sağlar. MTS ağırlıklı olarak nükleik asitleri 7, 8 içeren biyolojik süreçleri araştırmak için deneysel araç olarak kullanılmış olsa da, aynı zamanda protein 9-13 ya da hücreler 10, 14-17 mekanik özelliklerinin çalışmalarda uygulama bulmuşlardır. Çok sayıda yararlı referanslar MT 4, 18-20 oluşturmak ve çalıştırmak için nasıl açıklamak olduğunu mevcuttur. However, geleneksel MT onlar tork uygulamak iken, doğrudan tork ölçmek değil, doğrudan dönme hareketi izlemek ve yok. Buna ek olarak, nükleik asit şeridin serbest dönmesini sınırlamak. Burada, biz mıknatıs cımbız iki uzantıları mevcut. İlk olarak adlandırılan serbest yörüngeli manyetik cımbız (FOMT, Şekil 1b) 21 sağlar, ip ekseni etrafında dönme hareketini kısıtlayıcı olmayan denge açısı dalgalanmalar ve bağlı nükleik asit moleküllerinin büküm değişikliklerin ölçümleri. İkinci, manyetik tork cımbız tek biyomoleküllere 22-27 hem kuvvet ve tork uygulamak ve doğrudan ölçmek için yeteneğine sahiptir (MTT, Şekil 1c), olarak adlandırılan. Aşağıdaki protokol, okuyucu onun / onu elden bir &#39;geleneksel&#39; MT enstrüman anda sahip olduğunu tahmin. Biz oluşturmak ve çalıştırmak kurmak MT, hem de nasıl başvuruları için Tartışma okuyucu bakın consideManyetik boncuklar, mıknatıslar, ve izleme rutinleri seçiminde dikkate alınmalıdır oranlarını gösterir. Buna ek olarak, bölümler 1 ve Protokol Metin 2 biz genellikle hazırlamak ve MT kullanılmaya yönelik bir DNA örneği yanı sıra, geleneksel MT tek bir DNA üzerinde gerçekleştirilebilir, ön ölçümler inkübe açıklanmıştır. Protokol Metin Bölüm 3 ve 4 bir MT enstrüman kolayca adapte FOMT ve MTT ölçümler için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="702">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Sandblaster</td>
			<td style="width:123px;">Great Lake Orthodontics</td>
			<td style="width:119px;">190-070 Microetcher II</td>
			<td style="width:209px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Nitrocellulose</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnetic particle concentrator</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Non-magnetic latex beads (0.5 &#956;m radius)</td>
			<td style="width:123px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Non-magnetic latex beads (1.5 &#956;m radius)</td>
			<td style="width:123px;">Sanbio</td>
			<td style="width:119px;">PV05N/2179&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Antidigoxigenin</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 214 667 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 &#956;m radius)</td>
			<td style="width:123px;">Ademtech</td>
			<td style="width:119px;">3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 &#956;m radius, &#8220;MyOne&#8221;)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">650.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 &#956;m radius, &#8220;M270&#8221;)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">653.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Biotin-coated latex beads (0.5 &#956;m radius)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">F-8768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Cubic magnets for conventional tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Supermagnete</td>
			<td style="width:119px;">W-05-N50-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Cylindrical magnet for MTT and FOMT</td>
			<td style="width:123px;">Supermagnete</td>
			<td style="width:119px;">R-06-02-02G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Side magnet for MTT</td>
			<td style="width:123px;">Supermagnete</td>
			<td style="width:119px;">S-04-07-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Linear stage</td>
			<td style="width:123px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:119px;">M-126.PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Rotary stage</td>
			<td style="width:123px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:119px;">C-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">High-resolution automated sample stage</td>
			<td style="width:123px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:119px;">P-733.2D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Software for coding analysis routines</td>
			<td style="width:123px;">&#160;The Mathworks</td>
			<td style="width:119px;">Matlab</td>
			<td style="width:209px;">custom-written routines are available from the authors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic tweezers for the measurement of twist and torque

Tek moleküllü teknikleri mümkün gerçek zamanlı olarak çözelti içinde tek tek biyolojik moleküllerin davranışını incelemek için tercih. Bu teknikler atomik kuvvet mikroskobu olarak adlandırılan kuvvet spektroskopisi yaklaşımları, optik cımbız, germe, akış ve manyetik cımbız bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar arasında, manyetik cımbız sabit bir germe kuvveti muhafaza ederken, tork uygulamak için kabiliyetleri ile kendilerini seçkin. Burada, bu görüntülenmiştir örneğin, bir &quot;geleneksel&quot; manyetik cımbız deneysel yapılandırma, enine alanın büyüklüğünü en aza indirmek için alan konfigürasyonun basit tadilatı yoluyla, biyolojik bir molekül içinde bükümü derecesini ölçmek için adapte edilebilir. Edilen yapılandırma özgürce yörüngedeki manyetik cımbız denir. Buna ek olarak, bu alan konfigürasyonun başka değişiklik ve içinde arasında ara bir değeri olan bir enine alanı elde nasıl gösterilmektedir8220; geleneksel &quot;manyetik cımbız ve mümkün doğrudan biyolojik molekül saklanan torkunu ölçmek için yapar özgürce yörüngesindeki manyetik cımbız,. Bu yapılandırma, manyetik momenti cımbız adlandırılır. Ekteki video özgürce yörüngesindeki manyetik cımbız ve manyetik tork cımbız içine konvansiyonel manyetik cımbız dönüşüm yapılabilir nasıl ayrıntılı olarak açıklar ve bu tekniklerin kullanımını gösterir. Büyük ölçüde bu güçlü aracın çok yönlülüğünü genişletilmesi sırasında bu uyarlamalar konvansiyonel manyetik cımbız tüm gücünü korumak.

MT (Şekil 1a) gelen Örnek sonuçlar Şekil 2&#39;de gösterilmektedir. Şekil 2a, F alındığı bir 7.9 kb DNA = 0.25, 0.5, ve 2.0 pN için dönme uzantısı eğrilerini göstermektedir. Dönüş için tek DNA yanıt pozitif veya negatif plectonemic sarımları oluşumunun bir sonucu olarak azalan DNA uzantısı ile en düşük güçler (0.25 pN) seviyesinde simetrik olmalıdır. Başlangıçta bir dönel kısıtlı DNA sabrının (2.1 adım) ararken, bu tepkinin niceliksel bilgi yararlıdır. Şeridin ek kontrol, tek bir DNA molekülü içerir doğrulamak için gerekli olduğunu Not: Burada, 0.5 PN aşan kuvvetlerine rotasyona tek bir DNA yanıt birden fazla asimetrik DNA&#39;lar (aşama 2.1.1) ayırmak için yardımcı olur. Bu doğrulandıktan sonra, bir döner mıknatıs tam sayısını belirlemek için 0.25 pN de dönme tepki döner hangi tek bir DNA ibir Şekil 2 b benzemesi gerektiğini bir kuvvet-uzatma eğrisi, nereye götürürse, burarak rahat s. Bu özel ölçüm için, solucan benzeri zincir modeli (düz çizgi) için bir veri uygun donanımlı bir kontur uzunluğu L C = 2.71 mikron ve bükme kalıcı uzunluğu L P = 45 nm vermiştir. DsDNA için, kalıcılık uzunluğunun monte değerleri, tampon koşulları 33 bağlı olarak, aralık 40-55 nm bulunmalıydı ve monte kontur uzunlukta DNA yapısı için beklenen değere yakın bir (tipik haliyle% 10 içerisinde) olması gerektiğini ilişki L DNA = 0.34 nm / bp · baz çifti sayısı kullanarak ölçümleri kullanılır. Şekil 3, FOMT prosedürleri ve hizalama sonuçlarını (Şekil 1b) göstermektedir. Adım 3.2 &#39;de kaydedilen ilk (x, y) geziler bir işlev olarak o dalgalanmaların genel görünümüne göre olabilirf FOMT düzenlenen mıknatıs ve DNA-gergin kordonu arasında daha sonra nispi yer değiştirmeyi yol göstermek için kullanılabilecek bir &quot;vorteks&quot; modelini göstermektedir Şekil 3a&#39;da gösterildiği enine mıknatıs konumu. Takip eden kaba ayar tamamlandığında da Şekil 3b&#39;de siyah iz ile gösterildiği gibi, boncuk (x, y)-dalgalanmaları, dairesel yörünge dışarı iz. Bu noktada, z-ekseni etrafında mıknatıslardan tork termal dalgalanmaların bağlantı noktası etrafında döndürmek için boncuk yeterli olduğu noktaya kadar azaltılır. Çıkan dairesel halkadan (monte daire kırmızı gösterilir) ve yarıçapı R daire DNA bağlanma noktası ve boncuk merkezine (Şekil 1b) arasındaki radyal mesafeyi temsil eder. Şekil 3c&#39;de gösterildiği gibi, ancak, Şekil 3b&#39;de verilerin bir histogram kaba hizalama yeknesak bir şekilde kaplanmasını garanti etmez göstermektedirdairesel annulus boyunca tüm olası pozisyonları. Termal dalgalanmalar çember üzerindeki bütün rotasyonlar açısını keşfetmek için yeterli olsa da, serbest rotasyona (termal enerji k B T düzeni), küçük bir enerji engeli orada kalır. Ince hizalama FOMT (adım 3.4) de gerçekleştirildiği zaman, alet DNA bükülme modülüne (Şekil 4) tespit için de kullanılabilir. İlk olarak, numunenin ince hizalama olan iki boyutlu histogram hemen (Şekil 4b) yeknesak bir şekilde kaplanmasını göstermelidir dairesel hareket (Şekil 4a) elde etmek için kullanılır. ((X, y)-pozisyonlar dönüşümünden elde edilen, aşağıya bakınız) açısal dalgalanmalar gelen zaman iz q (t) hiçbir dönemsellik 360 ˚ (Resim 4c) tekabül gösterir ve birkaç tam dönüşler tekabül büyük geziler (Şekil ortaya 4d). Ima enerji manzara&gt; 1000 ˚ (Şekil 4e) bir aralığı üzerinde harmonik. Dalgalanmalar standart sapması k bir açısal tuzak sertlik karşılık, σ θ = 223 ° θ = k B T / σ θ 2 = 0.27 pN · sırayla etkili burulma sebat uzunluğunda bir tahmin verir nm / rad, ölçülen kuvvetinde C = C L / σ θ 2 ~ 76 nm (bu ölçümünde kullanılan 3.4 kbp DNA L C = 1.150 nm) eşit DNA. FOMT proteinlerin 31 bağlanması ile gergin DNA molekülüne bağlı büküm değişikliği ölçmek için nasıl kullanılabileceğini bir örnek, 34, Şekil 5&#39;te gösterilmektedir. Burada, çift için RAD51 proteininin takip adresSarmallı DNA; RAD51 Uzatmak hem bilinen ve bir Nukleoprotein filaman 31 formları olarak DNA gevşeyin edilir. Akış-hücre içine Rad51 basması üzerine, biz boncuk FOMT (Şekil 5a) bir sarmal yörünge uğradığını görüyoruz. Yukarıda tarif edildiği gibi q (t) için, zamanın bir fonksiyonu olarak (x, y) hareket dönüştürme iz, biz RAD51 DNA bağlama ipi uzunluğu ve sökülme derecesinin üzerinde sahip olduğu etkiyi-Plot birlikte (Şekil 5b, c) . DNA burulma özelliklerini ölçmek için alternatif bir yaklaşım, MTT (Şekil 1C, Şekil 6) bulunmaktadır. Şekil 6A&#39;da şematik ölçüm ilkesini göstermektedir: aşırı dönme sonra (ya da underwinding) N ile DNA ip döner DNA θ N-0 θ arasındaki denge açısal pozisyonunda bir değişikliğe yol açar tane üzerinde bir geri dönüş torku uygular. MTT manyetik alanın enine bileşen hala boncuk rotasyon (Şekil 1) izin verecek şekilde bu tür açısal kaymaların ölçümü kolaylaştırır MT ile karşılaştırıldığında azalır. N = 45 uygulandıktan sonra ölçülen açısal kaymasının büyüklüğü 7.9 kbp DNA döner Şekil 6b&#39;de gösterilmiştir. MTT ölçüm protokolü ve DNA için dönüş eğrisi bir tork elde edilen sonucu tam sekansı, Şekil 6c-f olarak gösterilmektedir. Burada, koordinat açısal standart sapma (Şekil 6c) ve ortalama (Şekil 6d) ölçümleri, standart sapma açısal tuzak sertlik (Denklem 1) ile ters orantılı olmak üzere, aşırı ve underwinding bir fonksiyonu olarak gösterilmektedir. Birlikte ele alındığında, bu miktarlar merkezli bir lineer tepki bölge göstermelidir DNA dönüş eğrisi (Şekil 6f), karşı bir tork oluşturmak için izin yaklaşık 0 a dönüşürnd iki plato, bu pozitif ve negatif olarak dönüş moment doymuş, sırasıyla. Rotasyon eğrisi böyle bir tork böylece DNA&#39;nın çökertme ve denatürasyonunu eşlik geçişleri miktarının, rotasyon eğrisi (Şekil 6e) karşı bir uzantısı bilgileri tamamlar. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1.. Konvansiyonel manyetik cımbız Şeması (MT), serbestçe yörüngesindeki manyetik cımbız (FOMT), manyetik tork cımbız (MTT) ve dönme açısı izleme için iki strateji. (A) manyetik cımbız her üç yürütmesinde, manyetik boncuk işlevselleştirilmiş makromoleküllerin bir akış hücresi yüzeyine gergin olan, örneğin, iki-şeritli DNA molekülleri, şematik olarak gösterilmiştir. Referans boncuk akış hücre yüzeyine bağlı ve Drif için izlenirt düzeltme. Her üç MT set-up, bu nedenle, DNA urgan manyetik boncuk üzerinde yukarı yönlü bir germe kuvveti uygulamak için mıknatıslar kullanır ve. MT Geleneksel olarak, mıknatıs bir çift sıkıca DNA-ip ekseni etrafında dönmesini sınırlayıcı kordonun enine ip eksenine göre yönlendirilmiş bir manyetik alan uygular. FOMT olarak, silindir şeklinde bir mıknatıs ip doğrultu boyunca yönlendirilmiş bir manyetik alan sağlar. Ip silindir şeklindeki mıknatıs merkezine hizalandığında, kalan enine alanları MTT olarak ip ekseni etrafında serbest dönüşünü sağlayan, en aza indirilir, bir yandan mıknatıs sağlamak amacıyla FOMT kullanılan silindir şeklindeki mıknatıs ilave edilir (MT göre büyüklük olarak azaltılmış) küçük bir enine alan. Bu küçük alan enine torkun uygulanmasını yanı sıra ölçüm sağlar. (B) DNA-bağlama ipi ekseni manyetik boncuk dönme açısını ölçmek için iki strateji gösterilmiştir. 1): Bir işaretleyici boncuk (Green) manyetik boncuk (kahverengi) bağlı analizler hayal izleme açısını sağlayan asimetrik bir görüntü verir. 0.5-mikron yarıçaplı fiducial işaretleyici ile 1.4-mikron yarıçaplı manyetik boncuk iki CCD görüntüleri odak ve out-of-odak, gösterilmektedir. 2): DNA uzak boncuğa güney kutbu bir pozisyonda manyetik boncuk gergin olduğu zaman, kordonun merkezi olan merkezi bir açısal konumunu tanımlayan bir yay boyunca değişiklik gösterir. Ip burarak böylece tek bir molekül tork ölçümleri sağlayan, (sağda izleri) gergin olarak iki strateji dönüş açısı izlemek için ve açı konumunda vardiya izlemek için kullanılabilir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig2highres.jpg" width="500" /> Geleneksel MT Şekil 2,. DNA kalibrasyon ölçümleri. F = 0 alındığı bir 7.9 kb DNA için (a) Dönüş-uzatma eğrisi.25, 0.5, ve 2.0 pN. Bir çift sarmallı DNA iplerini pozitif ve negatif döner dönme altında, asimetrik yanıt ip bağlanma için uygun bir test olarak kullanılabilir. Birlikte bir uyum ile bir 7.9 kb DNA için (b), kuvvet-uzatma eğrisi, solucan- Bir monte kontur uzunluğu L C elde zinciri modeli (düz çizgi) gibi = 2.71 mikron ve bükme kalıcı uzunluğu L P = 45 nm. Tüm ölçümler PBS tampon maddesi içinde gerçekleştirildi. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig3highres.jpg" width="500" /> FOMT Şekil 3.. Hizalama. (A) (x, y) mıknatıs konumunun bir fonksiyonu olarak FOMT düzenlenen DNA-gergin kordonun dalgalanmaları. Silindirik mıknatısın konumu x 250 um &#39;lik adımlarla akış hücre yüzeyi üzerinde 3 mm&#39;lik sabit bir yükseklikte taranır ve daha <em&gt; Y ve dış arsa eksende gösterilir. Mıknatısın her (x, y)-pozisyonunda, aynı DNA-gergin boncuk dalgalanmalar kaydedildi ve küçük koordinat sistemleri (sağ alt ölçek çubuğu tüm alt koordinat sistemleri için geçerlidir) çizilmiştir. Boncuk (x, y) konumu mıknatıs bir siklon ya da girdap benzeyen dalgalanma örüntüsü, sistematik varyasyonlar görülür. Bu, &quot;vorteks&quot; model hizalama elde etmek için x ve y (büyük oklar ile gösterilmektedir) (sabit mıknatısı tutarken ya da alternatif olarak şeridin) mıknatısın deplasman yönlendirmek için kullanılabilir. Kaba hizalama tamamlandığında, boncuk (x, y)-dalgalanmaları dairesel bir yörünge (arsa merkezinde mavi iz) dışarı iz. Bu izleme merkezindeki, daha küçük bir adımda mıknatıslar hale getirilmesi ve bu arsa gösterim için gösterilir sonra ayrı bir deneyde kaydedilmiştir. T düzenlenen bir DNA-gergin kordonun (b) (x, y)-dalgalanmalarıo mıknatıs (siyah iz) başarılı iri uyum sonra FOMT. Dalgalanmalar dairesel anulusunda yalan ve termal dalgalanmalar çemberin üzerinde açıları tüm rotasyonlar keşfetmek için yeterlidir. Takılmış daire kırmızı gösterilir. (C) bir histogram kaba hizalama dairesel halka boyunca tüm olası pozisyonları yeknesak bir şekilde kaplanmasını garanti etmediğini gösteren, (b) &#39;de verilerine karşılık gelen. Termal dalgalanmalar çember üzerindeki bütün rotasyonlar açısını keşfetmek için yeterli olsa da, serbest rotasyona (termal enerji k B T düzenin üzerinde) bir enerji engeli orada kalır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4,. FOMT kullanılarak DNA burulma sertliğinin ölçülmesi. (X, y)-yörünge (a) ve histogram (b) bir DNA-tethFOMT göreli mıknatıs-halata konumunun ince uyum sonra boncuk dalgalanmaları uzanırlar. Bu koşullar altında, histogram daire üzerine pozisyonların esasen homojen kaplama ortaya koymaktadır. (X, y)-konumları. (D) dönme dalgalanmaların Histogram saptanan kordonun (c) Dönme dalgalanmaları. Kırmızı çizgi σ θ = 223 ° ile bir Gauss uyum olduğunu. (E) dönme dalgalanma (c) dan yoğunluğu ve (d) ima enerji manzara. Dönel değişimlerinden ima enerji manzara ve (k θ = k B T / σ θ 2 = 0.27 pN-nm/rad) ile bir harmonik yaklaşım arasındaki fark, birkaç tur fazla termal enerji k B T çok daha küçüktür. Veri böyle netlik için ofset olması 0 = 0 θ. Genişliğidalgalanmalar, DNA&#39;nın burulma sertliğini belirlemek ana metni görmek için kullanılabilir. Ölçüm ~ 1 pN bir germe kuvveti de PBS tamponu içinde gerçekleştirildi. Veri Lipfert et al 21 uyarlanmıştır. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. DNA&#39;ya RAD51 protein bağlanma FOMT kullanılarak ölçülmüştür. (A) gergin 7.9 kpb&#39;lik dsDNA&#39;nın üzerine RAD51 protein Meclisi 3.5 pN izlenmektedir. (X, y, z) meclisin ilk 200 sn boyunca manyetik boncuk (çap 1.0 mm) tarafından yürütülen-yörünge süresi maviden kırmızıya renk kodlu ile gösterilmektedir. (B) dsDNA&#39;nın uzantısı çıkarılabilir çıkarsanan dsDNA ip ekseni (a), zamanın bir fonksiyonu olarak. (c) dönme açısı içinde, topuk kısmı yörünge z-bileşeninden, x, zamanın bir fonksiyonu olarak, (a) &#39;de boncuk yörünge y bileşenleri. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig6highres.jpg" width="500" /> MTT tek bir DNA ip Şekil 6. Tork ölçümleri. (A) şematik tork ölçüm prensibini gösteren. (Altı-ya da fazla) N, DNA bağlama ipi döner sarma sonra, DNA θ N-0 θ arasındaki denge açısal pozisyonunda bir değişikliğe yol açar tane üzerinde bir geri dönüş torku uygulamaktadır. Kullanılan açı izlerinin (b) Örnek torkunu ölçmek için:. bir st düzenlenen PBS tamponunda 7.9 kbp&#39;lik DNA molekülü üzerinde (mavi) ve 40 dönüşleri (koyu kırmızı) tanıttıktan sonra bir burarak rahat 7.9 kbp&#39;lik DNA molekülüne gergin bir boncuk açısal dalgalanmalar (cf) Tork ölçümüfiducial işaretleyici boncuk tabanlı açısal izleme protokolü kullanılarak ~ 3 pN kuvveti öğürme. Açısal dalgalanmalar (b) uygulanan dönüş sayısının bir fonksiyonu olarak kaydedildi. (C) açısal dalgalanmalar standart sapması uygulanan döner bir fonksiyonu olarak gösterildiği gibi. Dalgalanmaların genişliği sabit bir açısal tuzak sertlik gösteren, yaklaşık olarak sabittir. (D) uygulanan döner bir fonksiyonu olarak ortalama dönüş açısındaki değişim. Aşırı ve underwinding üzerine ortalama açı sistematik değişimleri görülür. (E) uygulanan döner bir fonksiyonu olarak aynı anda kontrol DNA bağlama ipi uzatma. (F) (d) &#39;de gösterilen ortalama açıdan belirlenen DNA şeridin tarafından uygulanan tork , ana metni görürsünüz. Aşırı ve sıfır etrafında döner underwinding doğrusal bir tork vs doğurur (~ 7 etkili burulma kalıcılık uzunluğunu belirlemek için kullanılan DNA-halata (takılı gri yamaçlar iyon (d) ve (f)) tepkisini dönerBu veri seti boyunca 7 nm). Daha fazla burkulma ve (şematik ilavelerde gösterilmiştir) plectonemic sarımları oluşumu, (~ 26 pN · nm&#39;de (f) pozitif dönüşlerde siyah çizgi) bir tork ve plato sayısı ile halata uzantısının bir doğrusal azalmaya karşılık gelen yol aşırı dönme sarım () e (siyah eğim). Doğrusal rejimin ötesinde Sağılma ((f) de ~ -11 pN · nm olumsuz dönüşlerde siyah çizgi) erime tork eşit bir tork plato ile işaretlenmiş, (soldaki ilavelerde gösterilen) yerel eritmek için DNA olur.

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque at JoVE.com

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Manyetik cımbız, güçlü bir tek moleküllü manipülasyon teknikleri, biyolojik makromoleküllerin (manyetik bir tork cımbız olarak adlandırılan bir konfigürasyonu kullanılarak) ve tork (manyetik cımbız serbestçe yörüngeli adı konfigürasyonu kullanılarak) bükümün doğrudan ölçümleri için uyarlanabilir. Bu tür ölçümler yapmak için rehber DNA ve ilgili nükleotid protein filamanların çalışma uygulamaları da dahil olmak üzere verilmiştir.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

magnetic-tweezers-for-the-measurement-of-twist-and-torque

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Mechanical Engineering

Bioengineering

Unit 1

Force System Resultants

3-Dimensional Kinetics of a Rigid Body

Newton's Laws of Motion

SCIENTISTS IN ACTION

23.1K Görüntüleme.  Delft University of Technology.  Manyetik cımbız, güçlü bir tek moleküllü manipülasyon teknikleri, biyolojik makromoleküllerin (manyetik bir tork cımbız olarak adlandırılan bir konfigürasyonu kullanılarak) ve tork (manyetik cımbız serbestçe yörüngeli adı konfigürasyonu kullanılarak) bükümün doğrudan ölçümleri için uyarlanabilir. Bu tür ölçümler yapmak için rehber DNA ve ilgili nükleotid protein filamanların çalışma uygulamaları da dahil olmak üzere verilmiştir...

Video: Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Biyomühendislik

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Doku Değerlendirilmesinde Manyetik Rezonans Elastography Metodoloji Construct Büyüme Tasarlandı

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Su Örneklerinde Eser Metal Analizi için Dipol destekli Katı Faz Ekstraksiyon Microchip Fabrikasyon

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

En iyi duruma getirilmiş kurulum ve manyetik etki alanı görüntüleme ile Situ histeresis ölçüm için iletişim kuralı

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various factors affect the relaxation rates, such as buffer composition, solution pH, temperature, and magnetic field. In this last regard, the spin-lattice relaxation time can be measured at clinical field strengths, but at lower fields, where these compounds are dispensed from the polarizer and transported to the MRI, the relaxation is even faster and difficult to measure. To have a better understanding of the amount of magnetization lost during transport, we used fast field-cycling relaxometry, with magnetic resonance detection of 13C nuclei at ~0.75 T, to measure the nuclear magnetic resonance dispersion of the spin-lattice relaxation time of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Dissolution dynamic nuclear polarization was used to produce hyperpolarized samples of pyruvate at a concentration of 80 mmol/L and physiological pH (~7.8). These solutions were rapidly transferred to a fast field-cycling relaxometer so that relaxation of the sample magnetization could be measured as a function of time using a calibrated small flip angle (3&#176;-5&#176;). To map the T1 dispersion of the C-1 of pyruvate, we recorded data for different relaxation fields ranging between 0.237 mT and 0.705 T. With this information, we determined an empirical equation to estimate the spin-lattice relaxation of the hyperpolarized substrate within the mentioned range of magnetic fields. These results can be used to predict the amount of magnetization lost during transport and to improve experimental designs to minimize signal loss.

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

We present a protocol to measure the magnetic field dependence of the spin-lattice relaxation time of 13C-enriched compounds, hyperpolarized by means of dynamic nuclear polarization, using fast field-cycled relaxometry. Specifically, we have demonstrated this with [1-13C]pyruvate, but the protocol could be extended to other hyperpolarized substrates.

Hiperpolarize Spin-Kafes Gevşeme manyetik alan bağımlılığının ölçülmesi [1-13C]pirüuvat

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has been challenged. Here, we fabricate iron oxide nanoparticle shelled microbubbles (NSMs) through self-assembly, synergizing magnetic, acoustic, and optical responsiveness in one nanotherapeutic platform. Iron oxide nanoparticles serve as both magnetic and photothermal agents. Once intravenously injected, NSMs can be magnetically guided to the tumor site. Ultrasound triggers the release of iron oxide nanoparticles, facilitating the penetration of nanoparticles deep into the tumor due to the cavitation effect of microbubbles. Thereafter, magnetic hyperthermia and photothermal therapy can be performed on the tumor for combinational cancer therapy, a solution for cancer resistance due to the tumor heterogeneity. In this protocol, the synthesis and characterization of NSMs including structural, chemical, magnetic and acoustic properties were performed. In addition, the anti-cancer efficacy by thermal therapy was investigated using in vitro cell cultures. The proposed delivery strategy and combination therapy holds great promise in cancer treatment to improve both delivery and anticancer efficacies.

Presented here is a protocol for the fabrication of iron oxide nanoparticle-shelled microbubbles (NSMs) through self-assembly, synergizing magnetic, acoustic, and optical responsiveness in one nanotherapeutic platform for magnetic hyperthermia and photothermal combination cancer therapy.

Manyetik Hipertermi ve Pothototermal Kombinasyon Kanser Tedavisi için Manyetik, Akustik ve Optik-Üçlü Duyarlı Mikrobubbles

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting agents is a crucial aspect to enhance their efficacy in diagnostics and treatments while minimizing the side effects. The benefit of magnetic nanomaterials compared to non-magnetic ones is their ability to respond to magnetic fields in a contact-free manner and over large distances. This allows to guide or accumulate them, while they can also be monitored. Recently, magnetic nanowires (NWs) with unique features were developed for biomedical applications. The large magnetic moment of these NWs enables a more efficient remote control of their movement by a magnetic field. This has been utilized with great success in cancer treatment, drug delivery, cell tracing, stem cell differentiation or magnetic resonance imaging. In addition, the NW fabrication by template-assisted electrochemical deposition provides a versatile method with tight control over the NW properties. Especially iron NWs and iron-iron oxide (core-shell) NWs are suitable for biomedical applications, due to their high magnetization and low toxicity.
In this work, we provide a method to biofunctionalize iron/iron oxide NWs with specific antibodies directed against a specific cell surface marker that is overexpressed in a large number of cancer cells. Since the method utilizes the properties of the iron oxide surface, it is also applicable to superparamagnetic iron oxide nanoparticles. The NWs are first coated with 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) acting as a linker, which the antibodies are covalently attached to. The APTES coating and the antibody biofunctionalization are proven by electron energy loss spectroscopy (EELS) and zeta potential measurements. In addition, the antigenicity of the antibodies on the NWs is tested by using immunoprecipitation and western blot. The specific targeting of the biofunctionalized NWs and their biocompatibility are studied by confocal microscopy and a cell viability assay.

In this work, we provide a protocol to biofunctionalize magnetic nanomaterials with antibodies for specific cell targeting. As examples, we utilize iron nanowires to target cancer cells.

Manyetik Nanomalzemelerin Biyofonksiyonelleştirilmesi

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...