Yazarlar Disiplinlerarası İnovasyon Girişimi Programı, Illinois Üniversitesi kabul etmek istiyorum, 12.035 hibe. SK Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Hibe dan UIUC finanse edildi 0965918 IGERT: Hücresel ve Moleküler Mekaniği ve Biyonanoteknoloji içinde Araştırmacıları Nesil eğitilmesi.

Imalatı ve hücre kültürü yüzeye yakın fluoresan gömülü mikrosferler ile katılıkları değişen PA jeller fonksiyonalize. 1. Üst cam kapak slipleri işlevselleştirici <ol><li> Temiz cam kapak slipleri (# 1.0, 12 mm çap.) Sabun ve su ile, ardından da etanol ile yabancı tozunu alın. </li><li> Yer cam kapak onlar lamelleri ile etkileşim kolaylığı kolaylaştırmak için değmiyor böyle bir rendelenmiş yüzey (yani pipet tutucu) üzerinde kayıyor. </li><li> Kat, kapağın tüm yüzey poli-D-Lizin 1 saat (Şekil 1A) (0.1 mg / ml) ile kayar. </li><li> Bu süre sırasında, 1 gerçekleştirmek: 0.1 um çaplı kolloid solüsyonu 10,000 seyreltme, deiyonize (Dİ) su ile mikro-kırmızı flöresanlı jel yüzeyi üzerinde 20 mikron 2 başına yaklaşık 1 mikro-partikül yoğunluğu elde edildi. Çeşitli dilüsyonları sonuçları için Şekil 2&#39;ye bakınız. Bu dilution Özel deneylerin ihtiyacını karşılamak üzere değiştirilebilir. </li><li> 30 dakika boyunca ultrasonik su banyosu içinde seyreltilmiş çözelti yerleştirin. </li><li> 1 saat sonra, dikkatle her kapak kayma kaldırın ve hava ile kuru darbe için cımbız kullanın. Rendelenmiş yüzeye kuru bir örtü fişleri dönün. </li><li> Her kapak kayma üzerine ultrasonik banyo ve pipetle 150 ul gelen seyreltilmiş kolloid çözüm çıkarın. 10 dakika (Şekil 1B) için bırakın. </li><li> Dikkatle her kapak kayma kaldırın ve hava ile kuru darbe için cımbız kullanın. Kullanıma hazır olana kadar kuru bir örtü karanlıkta rendelenmiş yüzey ve mağaza fişleri dönün. </li></ol> Doğrudan Glass Bottom Petri Yemekleri PA Jel hazırlanması 2. <ol><li> 100 ° C&#39;ye kadar ön ısıtma ocak gözü. </li><li> Cam alt Petri yemekleri istenilen sayıda yatırın (14 mm ile 35 mm çanak mikro-iyi, # 1.0), bir kimyasal davlumbaz düz bir yüzeye yerleştirin. </li><li> % 97 3-aminopropil-trimethoxys her Petri kabı, mikro oyuk cam bölümünü kapsarliane kimyasal aktivasyon için 7 dakika boyunca (3-APTES&#39;le). Polistiren zarar görmesini önlemek için bir Petri kabındaki plastik yüzeyine 3-APTES yersiz damlamasını önlemek için dikkat ediniz. </li><li> 7 dakika sonra, DI su ile Petri doldurmak ve atık kabı içine atın. </li><li> Daha sonra tekrarlayın için her yemeğin adım 2.4 3x ve ekstra su çıkarmak için Petri kabı sallayın. Cam kısım kuruyana kadar sıcak bir plaka üzerinde Petri kapları yerleştirin. </li><li> Sıcak plakadan Petri kapları çıkarın ve kimyasal bir davlumbaz olarak düz bir yüzeye döner. </li><li> Kimyasal bir davlumbaz olarak,% 0.5 glutaraldehid ile bir çözelti yapmak ve de 30 dakika için çözelti ile her bir Petri kabı cam bölümünü kapsar. Plastik zarar görmesini önlemek için bir Petri kabındaki plastik yüzeyine glutaraldehit yersiz damlamasını önlemek için dikkat ediniz. </li><li> 30 dakika sonra, DI su ile Petri doldurmak ve durulayın atık kabına atın ve glutarald çıkarınehyde. </li><li> Daha sonra tekrarlayın için her yemeğin adım 2.4 3x ve ekstra su çıkarmak için Petri kabı sallayın. Cam kısım kuruyana kadar sıcak bir plaka üzerinde Petri kapları yerleştirin. </li><li> PA jel solüsyonunun bileşenlerin karıştırılması önce, cam alt ile jel hızlı sandviçlenmesine yönelik sağlayan, kolaylıkla ulaşılabilir olacak şekilde kimyasal bir davlumbaz içine fonksiyonalize cam slaytlar hareket jel çözelti karıştırıldıktan sonra Petri kapları. </li><li> 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü, Tablo 1 de listelenen konsantrasyonlarda hemen arka arkaya% 40 bisakrilamid, 2% akrilamid ve akrilik asit karışımı, istenen matris esnekliğini elde etmek için (10 yayınlanan bir protokolün uyarlanmıştır). </li><li> Jel tamamlamak üzere solüsyon arzu edilen matris elastiklik tekabül eden Tablo 1&#39;de belirtilen miktarlarda, 100 mM HEPES,% 10 amonyum persülfat ve TEMED ilave edin. </li><li> Hemen cam kısmın merkezi üzerine jel solüsyonu 15 ul pipetpetri kutularının. </li><li> Hemen cımbız ile bir fonksiyonlaşmış cam kapak kayma pick up. <ol><li> Floresan boncuk jel çözeltisi ile yan yapma temas olduğu gibi üzerinde cam kapak kayma çevirin. </li><li> Yavaşça fonksiyonalize yan jel (Şekil 1C) ile temas içinde olduğu şekilde, artık sıvı PA jelinin üzerine kapak kayma yerleştirin. Not: En iyi sonuçlar için, ikinci bir kişi birden fazla Petri kapları üzerine sıvı Pensilvanya jel çözüm pipetleme ise kısmi polimerizasyon olasılığını önlemek için kapak kayma ekleme rolü için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> PA jel düşük seviyelerine polimerleştirerek floresan nano partiküller yerçekimi etkileri kaçınarak yardımcı olmak için tüm Petri kapları ters çevirin. </li><li> PA jel stok çözelti görsel olarak santrifüj tüpü içinde polimerize en az 35 dakika boyunca, ya da kadar bekleyin. </li><li> Üzerinde geri Petri yemekleri Flip ve kapak kayma kaldırılması ile yardımcı olmak için PBS ile onları doldurmak. </li><li> Dikkatle kapak kayma çevresini kazımak için cımbız kullanarak, Petri kabı cam kısmı ve kapak kayma hatları ile temas. Kapak kayma yerinden kadar birkaç çevrimi gerçekleştirin. Kapak kayma çıkarın ve uygun bir kavuz çöp bidonuna atın. </li><li> Tüm kapak slipi üzerinde ayrılmasından sonra, floresan boncuk jel (Şekil 1D) transfer olacaktır. Tamamen PBS ile PA jeller Kapak her yemeğin Petri kabı kapağı yerleştirin ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Fibronektin PA jel işlevselleştirilmesi <ol><li> Kurulu bir protokol 11&#39;de tarif edildiği gibi, aşağıdaki önceden hazırlanmış solüsyon hazırlayın: solüsyonu ıslatın (137 mM NaCI,% 5 (h / h) gliserol) ile karıştırılır ve 2 x konjugasyon tamponu (0.2 M 2-(N-morfolino) etansülfonik asit (MES), 10 % (h / h) gliserol, pH 4.5). </li><li> PA jelleri içeren cam-alt yemekler tüm PBS kaldırmak için biyolojik bir ocak içinde bir vakum pompası kullanılır. </li><li> Pipetleyinte jel tamamen daldırılır şekilde, her jeli üzerine çözelti ıslatın. En az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Sıcak 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC) ve oda sıcaklığında N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) içerir. </li><li> EDC 10x çözeltileri (150 mM deiyonize suda 19 mg / ml) ve NHS (250 mM deiyonize suda 29 mg / ml) ile karıştırın. </li><li> 1 bölümü 10x EDC, 1 kısım 10x NHS, 3 parça DI su ve 5 parça 2x konjugasyon tampon karıştırın. </li><li> Emmek çözeltinin çıkarılması için biyolojik bir ocak içinde bir vakum pompası kullanılır. Tüm akışkan jel yüzeyden emin olun. </li><li> Jel yüzeyini kaplayan ve Petri kabına (150-250 ul) cam alt kuyu doldurmak için yeterli NHS / EDC çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında erimeye fibronektin. Çözüldükten sonra, 50 ug / ml fibronektin çözüm oluşturmak için steril distile su karıştırın. </li><li> NHS / EDC Solu kaldırmak için biyolojik bir ocak içinde bir vakum pompası kullanınyon. Tüm akışkan jel yüzeyden emin olun. </li><li> Her jel için fibronektin çözeltisi 150 ul ilave edin. Fibronektin bağlanmasına olanak sağlamak için 35 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 35 dakika sonra, 2 haftaya kadar 4 ° C &#39;de her bir Petri kabı ve saklamak için PBS ekleyin. </li></ol> 4. Çekiş Kuvveti Deneyleri <ol><li> Bir su banyosunda ılık bir ortam hücre PBS ve 37 ° C tripsin. </li><li> Jeller durular arasında PBS aspire, steril PBS ile 5 kata, ve kaputun kaplı bırakın durulayın. </li><li> Şişe içeren hücrelere 1 ml tripsin 2 cm başına 25 ekleyin. Hücreler şişe kaldırdı sonra, hücre medya ile tripsin sulandırmak ve hücreleri saymak. Jel yüzey alanına bağlı olarak, / cm2 3000 hücrelerinin bir nihai hücre yoğunluğu için tohumlama jel başına gerekli olan hücre sayısının belirlenmesi. Seyreltik veya hücreye ortam karışımından 150 ul hücre, bu sayı içerir şekilde süspansiyon konsantre edilir. Hücre Suspens alikosu 150 ulHer jel üzerine iyon. </li><li> 30 dakika için bir kuluçka makinesi içinde hücreleri içeren Petri kapları yerleştirin. Daha sonra dikkatli bir şekilde Petri kapları kaldırmak ve çanak şeklinde ve yüzeyleri tamamen batırılır ortam (yaklaşık 2 mi) ile Petri kabı kalan doldurun. </li><li> Görüntü alımı kadar inkübatör Petri kapları geri yerleştirin. </li><li> , Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) prizma takın, 40x suya daldırma hedefi eklemek mCherry veya eşdeğer floresan filtreyi seçin ve çevre odasında açın: görüntüleme için mikroskop ve veri toplama sistemi hazırlayın. </li><li> Görüntüleme için hazırlandığı zaman, inkübatör bir Petri kabı çıkarın ve mikroskop sahnede yavaşça yerleştirin. DIC görüntüleme için Petri kabı kapağını çıkarın. </li><li> Tek bir hücre bulmak ve DIC hücrenin tek bir hareketsiz görüntü yakalamak. </li><li> Mikroskop sahne hareket ettirmeden, floresan görüntüleme moduna geçiş. Floresan-küreler ve rec odaklanmaMikro-kürelerin, bir görüntü Kat. </li><li> Dikkatlice bir pipet ile Petri kabı, hücre ortamını çıkarın ve% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. </li><li> Görüntü sonra hücreler hücre altında mikro-müstakil. </li><li> ImageJ 12 Kullanım parçacık görüntü velosimetri (PIV) analizi nedeniyle hücresel kuvvetleri deplasman alanını hesaplamak için. </li></ol>

<ol>
	<li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Complaint+Matrices+for+Quantifying+Cellular+Contraction.">Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction.</a> JoVE. , (2010).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+Hydrogels+for+Cell+Mechanics:+Steps+Toward+Optimization+and+Alternative+Uses.">Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses.</a> Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li><li>Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+throughput+traction+microscopy+reveals+pivotal+role+for+matrix+stiffness+in+fibroblast+contractility+and+TGF-&#946;+responsiveness.">Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-&#946; responsiveness.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).</li><li>Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micropatterning+and+image+processing+approach+to+simplify+measurement+of+cellular+traction+forces.">A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces.</a> Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties.">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).</li><li>Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Patterning+Polyacrylamide+Substrates+Functionalized+with+N-Hydroxysuccinimide.">Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide.</a> Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).</li><li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell&#8211;cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell&#8211;cell junction positioning.</a> PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular-matrix+tethering+regulates+stem-cell+fate.">Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate.</a> Nature Materials. 11, 642-649 (2012).</li><li>Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+chemistry,+topography,+and+mechanics+at+the+cell-biomaterial+interface:+Issues+and+challenges+for+assessing+the+role+of+substrate+mechanics+on+cell+response.">Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response.</a> Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).</li><li>Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinkovic&#769;, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiwell+Platform+for+Studying+Stiffness-Dependent+Cell+Biology.">A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology.</a> PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).</li><li>Butler, J. P., Tolic&#769;-N&#248;rrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).</li><li>Tolic&#769;-N&#248;rrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells.">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).</li><li>Atanackovic, T., Guran, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bu teknik kullanıldığında, bu çözelti, uygun şekilde seyreltilmiş boncuk ve tanecikler arzu edilen çapına göre seçilir esastır, Pensilvanya jel tabaka sertliği ve arzu edilen deneyde incelenmektedir fenomenlerin boyut ölçeği. Üst cam kapak slipi üzerinde karıştırılmıştır fonksiyonalize önce boncuk seyreltilmesi zaman dikkatli alınmalıdır. Jel yüzeyinde halkalar arasında aralık koloit çözelti seyreltme faktörü değiştirerek değiştirilebilir. Çok fazla ...

Yerel çevre ile yaşayan hücrenin mekanik etkileşim yaygın Pensilvanya jeller kullanılarak incelenmiştir. Bu alt-tabakalar, bu alt-tabakaların en önemli avantajlarından 1. Biri 1997 yılında Dembo ve Wang tarafından kurulan basit, iyi karakterize edilmiş protokolüne dayanan kendi sertliği jel solüsyonunun özel bileşenlerin konsantrasyonlarını değiştirerek ayarlanabilir olmasıdır. Bu, farklı katılıklarla ortamlarda hücrelerin etkileşimi incelemek için bir arzu platform sağlar. PA jeller, hücre dışı matris (ECM), proteinleri ile kaplanmış olduğunu zaman, hücreler kuvveti oluşturarak, bunlara yapışır. Hücre kuvvetin sonucu olarak, jel elastik bir gövde olarak deforme eder. Bu deformasyon, hücrelerin ve jelin elastik özellikleri tarafından uygulanan kuvvetin büyüklüğüne bağlıdır. Çeşitli çalışmalarda hücresel çekiş kuvvetleri araştırmak PA jelleri istihdam var. PA jel imalat Bir varyasyonda, floresan mikrosferler (boncuk) t gömülürfarklı bükülmezliklerde 2 jelleri üzerinde çekme kuvvetlerinin hücre miktarını belirlemek için jel hroughout. Hücre kuvvet başvuru üzerine, boncuk jel izleyen deformasyon onların ilk konumdan yerinden. Deformasyon alan tek tek kordonların ölçülür. Bu deformasyon alan esneklik teorisi ile çekme kuvvetlerinin hesaplanması için jelin elastik özellikleri kullanılmaktadır. Bu ölçümler hücreler mekanik duygusu ve kendi yerel mikroçevresinin 3 ile etkileşim olarak nasıl fikir verir. Yaygın olarak kullanılan bir çok Pensilvanya jel üretim protokolleri, haplar, sıvı, polimerize edilmemiş halde PA, jel boyunca birbirine karıştırılır. Tam polimerleştirilmiş jel, Pensilvanya hacmi boyunca flüoresan boncuklar içerir. Hücre çekme kuvvetlerinin işlem olduğunda, jel yüzeyi (hücre alt-tabaka arayüzü) yakınındaki en boncuklar izlenir. Bu tür boncukların değiştirmeler kuvvet calculatio basitlik için hücre kültürü yüzeyinde meydana varsayılmaktadırn. Jelin derinliğinde boncukların gerçek konumu göz ardı edilir. Bununla birlikte, elastik bir ortamda (örneğin, Pensilvanya jel gibi), bir kuvvet tatbiki bir noktaya yakın bir kordon daha uzak bir noktadan bir boncuk daha hareket eder. Böylece, hücresel traksiyonların düşük hesaplanmasına yüzey sonuçlara edilene yüzeyden uzak (boncuk yerde) bir noktanın yer değiştirmesi muamele edilmesini içerir. Hatanın derecesi yüzeyinden kordonun uzaklığa bağlıdır. Hata kordonun konumu bilgisi olmadan tahmin edilemez. Çok hücre kültürü yüzeye yakın boncuk sınırlandırmak için basit bir yönteme ihtiyaç birkaç teknikleri ile ele alınmıştır. Araçlardan biri, çok yüzeye yakın hareketini ölçmek için üst odak düzlemi boncuk yeterli sayıda olacak şekilde bütün jel boyunca boncuk yoğunluğunu artırmaktır. Bir başka teknik, ışık o canlı hücre görüntüleme için bir konfokal görüntüleme odası inşa içerirüst en odak düzlemi sadece boncuk 4 toplanır. Farklı bir yöntem taneleri 5 olmayan bir önceden polimerize edilmiş jelinin üzerine boncuklar içeren PA jel son derece ince bir katmanı üzerinde içerir. Bu tekniklerin bir dezavantajı, her birinin, jel içindeki boncukların hassas konum bilinmemektedir olmasıdır. Bu boncuklar yer değiştirme alanı ve bu yüzden, hücre kuvvetlerin hesaplanması hesaplamaya dahil hata olarak yansır. Bir başka teknik, Sülfo-SANPAH 6 kullanılarak hali hazırda polimerize PA jel üst yüzeyine boncuk konjugasyon içerir. Bu teknik, tek taneler PA jel üzerinde gerçekten de sağlar, fakat jelin derinlikte gömülü ne ölçüde bilinmemektedir. Önce iş hücreleri gücü birkaç mikron uzaklıkta 7 hissedebiliyorum önerdi gibi bu potansiyel, hücre davranışını değiştirebilir hücreler, bir yerel topografya oluşturabilirsiniz. Son zamanlarda, 1 mikron çaplı f PA jeller desenlendirme için bir tekniktirdüzenlilestirilmis dizi luorescent fibronektin nokta belirteçler 8 kurulmuştur. Bu durumda, flüoresan işaretler derinliği bilinir ve fibronektin model dolaylı jel yüzey üzerine baskı gibi, esas olarak sıfırdır. Bununla birlikte, bu yöntem, ECM protein 1 mikron çaplı noktalar, olduğu gibi hücreler, ekleyebilir üzerinde sürekli bir ortam sağlamaz. Tamamen yüzeye çok yakın bilinen bir konuma Pensilvanya jeller içinde izci boncuk entegre ve hapsedilmesini için bir yöntem henüz kurulamamıştır. Burada, biz çok Pensilvanya jel içindeki hücre kültürü yüzeye yakın bir odak düzlemine mikron çaplı floresan boncuk alt-mikron sınırlamak için bir yöntem geliştirmek. Bir jel, genellikle, iki cam levha arasında polimerize edilmemiş sıvı jel çözeltisi sandöviç muamele edilmektedir. Jel şiddetle bağlıdır, böylece plakaların bir işlevlendirilmektedir. Diğer fonksiyonelleştirilmemiş ve jel sertleşmeden sonra çıkartılır. Biz bu çıkarılabilir cam su değiştirmekboncuklar bir tabaka ile kaplamak suretiyle rface. Fonksiyonalize ve boncuk kaplı cam yüzeyi arasındaki sıvı jel sandviçleyerek sonra, jel boncukları transfer işleminin sertleştirme sırasında. Bu yüzey 1.6 um olan jel içine Tanelerin entegrasyon mesafeyi sınırlar. Cam alt Petri kapları jel tedavi edildiği yapışık yüzeyi olarak kullanılır. Polimerizasyon sırasında düz bir üst yüzey jel oluşturmak için, bir dairesel cam lamel sandviç etmek için, cam alt-Petri kabı ile jel kullanılır. Jel üretiminden önce, üst cam kapak kayma bir yüzey yükü, sonuçta poli-D-lisin (PDL) ile kaplanır. PDL basınçlı hava ile üflenerek uzaklaştırıldı edilir ve su içinde boncuk çözeltisi kapak slipleri üzerinde bırakılır. Bu, negatif bir yük taşıyan karboksile floresan, mikro-boncuklar, uygulanması ve PDL ile işlenerek oluşturulan pozitif yüklü yüzey ile etkileşime girer. Basınçlı hava, tek bir tabaka ile lamel kapalı boncuk çözeltisi üfleme sonraboncuklar elektrostatik kuru kapak kayma birleştiğinde kalır. Cam slaytlar, hasarsız ve tamamen sağlam PA jelden çıkarıldı olarak PDL kaplama, jel yüzeyine camın yapışkanlığını etkilemez. Cam alt Petri kutuları 97% 3-aminopropil-trimethoxysliane ve% 0.5 glutaraldehid ile işlenerek yapışkan yapılır. İstenen katılıklarının Pensilvanya jeller standart bir prosedür ile 9 bisakrilamid akrilamid uygun konsantrasyonlarda karıştırılmasıyla oluşturulur. Jel çözeltisinin bir damlacık cam alt Petri kabı üzerine pipetlenir. Boncuklar ihtiva eden bir cam kapak kılıfı sandviç etmek için Petri kabı ile jel kullanılır. Jel tedavi edildiğinde, üst kapak kayma yüzeyinden 1.6 um olan PA jel gömülü boncuk bırakarak kaldırılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">70% Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>111-30-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1M HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">2% Bisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fibronectin, Human, 1mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0700</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Acrylic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>147230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-14-1-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glass cover slips, 12 mm diam.</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy

Pensilvanya jeller uzun imalat ve nağme elastik özelliklerini yeteneği kolaylığı nedeniyle hücre çekiş kuvvetleri incelemek için bir platform olarak kullanılmıştır. Alt-tabaka, bir hücre dışı matris proteini ile kaplanmıştır zaman hücreler, jele yapışmayan ve jel deforme neden kuvvetler uygulanır. Bu deformasyon, hücre çekiş ve jelin elastik özelliklerine bağlıdır. Yüzeyinin deformasyonu alanı biliniyorsa, yüzey çekme esnekliği teorisi kullanılarak hesaplanabilir. Jel deformasyon genellikle homojen jel içine fluoresan işaretleyici boncuklar içine gömülmesiyle ölçülür. Jel deforme olarak probları değiştirmesine neden olmaktadır. Jel yüzeyine yakın sondalar izlenir. Bu problar tarafından bildirilen değiştirmeler yüzey değiştirmeler olarak kabul edilir. Yüzeyden Bunların derinlikleri göz ardı edilir. Bu varsayım çekiş kuvveti değerlendirmelerde hata tanıtır. Boncukların yer bilinmesi için hücre güçlerinin hassas ölçümü için, bu önemlidir. Biz geliştirdikyüzeyinin 1.6 um olan PA jellerinde, floresan markörü boncuklar, çapı 0.1 ile 1 um sınırlandırmak için basit kimyası kullanan bir teknik sunmaktır. Bu kat, poli-D-lisin (PDL) flüoresan boncuklar ile bir lamel. PA jel çözeltisi, sonra da lamel ve yapışkan bir yüzeyi arasında yer alır. Floresan boncuk kür sırasında jel çözeltisine transfer. Polimerizasyondan sonra, PA jel jel yüzeyine yakın bir düzlem üzerinde floresan boncuklar içerir.

Konfokal görüntüleme boncuklar, jel yüzeyinin altına gerçekten olduğunu tespit etmek ve jel derinliği içindeki tam yerini belirlemek için kullanıldı. Jelin içindeki edilenlerden daha farklı bir dalga boyunda floresan taneler yüzeyinde yerleşmeye bırakıldı ve gömülü floresan, nanopartiküller ve yüzeyi üzerinde bu arasındaki mesafenin bir ağırlık merkezi tanıma algoritması kullanılarak hesaplanmıştır. Jel yüzeyi üzerindeki kordonun konumu jel-hücrelerinin yüzeyine yapışması üzeri...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy at JoVE.com

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Floresan probları içeren poliakrilamid (PA) jelleri imal edilmesi için geleneksel teknikler yapışkan bir yüzeyi ve bir cam kayar arasında sandviç tarzı bir jel barındırır. Burada, poli-D-lisin (PDL) ve fluoresan problar, bu slayt kaplama jel yüzeyinden 1.6 um olan probları lokalize olduğunu göstermektedir.

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

a-novel-method-for-localizing-reporter-fluorescent-beads-near-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K Görüntüleme.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Floresan probları içeren poliakrilamid (PA) jelleri imal edilmesi için geleneksel teknikler yapışkan bir yüzeyi ve bir cam kayar arasında sandviç tarzı bir jel barındırır. Burada, poli-D-lisin (PDL) ve fluoresan problar, bu slayt kaplama jel yüzeyinden 1.6 um olan probları lokalize olduğunu göstermektedir. 

Video: A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Biyomühendislik

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

B Lenfosit Aktivasyonunu Incelemek Için Çekiş Kuvveti Mikroskobu

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Erken Osteoartrit tespit etmek için Atomik Kuvvet Mikroskobu Uygulaması

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...