Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı, ICT ve Gelecek Planlama (NMK-2014R1A1A2057527 ve NATO Mukabele Gücü-2016R1D1A1B03934418) tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir.

1. delik aracılığıyla dizi alüminyum plaka ve mıknatıs dizi hazırlanması
<ol><li>İki 50 mm x 50 mm hazırlamak (veya büyük) alüminyum levha. Her plaka kalınlığı boncuk çapı yarısı 300 µm yapıldı.</li>
	<li>30 x 30 delik aracılığıyla dizi bir alüminyum levhalar üzerinde Φ550-µm mikro matkap Dalma oranı ve 8000 RPM iğ hızı ile 30 mm/s ile CNC döner engraver kullanarak oluşturur. Her deliğin (merkezi-Merkezi) arasındaki uzaklığı 1 mm (Şekil 1a ve şekil 2a, ben) yapıldı.</li>
	<li>1.2 (Şekil 1a ve şekil 2a, II) açıklanan olarak aynı yordam kullanılarak diğer alüminyum plaka üzerinde Φ750-µm delik aracılığıyla 30 x 30 dizisi oluşturur.</li>
	<li>İki tabak birbirlerine bir bant kullanarak eklemek ve Φ3 mm hizalama delik her iki alüminyum levha dört köşesine oluştururlar.</li>
	<li>Alüminyum levha % 15 sülfürik asit onların maksatlı 12 h için emmek. Alüminyum oksit alüminyum yüzeyinde ince bir tabaka yapmak beri bu korozyona dayanıklı, delik çapı ve plaka kalınlığı bu asit tedavisi tarafından değiştirilmez.</li>
	<li>1 x 1 x 1 mm neodymium mıknatıslar 30 × 30 dizi (ile 0.363 N bir manyetik gücü) oluşturur. Her mıknatıs komşusu için Ters polarite olduğundan emin olun. Kırılma veya mıknatıs dizi saçılma önlemek için çift taraflı bant (şekil 2a, III ve iç metin içinde Şekil 2) kullanarak mıknatıs dizi dibinde bir 30 x 30 mm alüminyum plaka ekleyin.</li>
</ol>2. boncuk yakalama işlemi
<ol><li>Hizalama ve iki alüminyum tabak yığını (top plaka: 750 µm delik plaka, alt plaka: 550 µm delik plaka) hazırlanan hizalama delik her plaka (Şekil 1b) dört köşesine kullanarak.</li>
	<li>İki tabak birlikte hizalama deliklere M3 cıvata ekleyerek kilit ve sonra fındık (Şekil 1b) ile cıvata güvenli.</li>
	<li>Alüminyum plaka derleme (Şekil 1b, 2bve 2 c) hazırlanan mıknatıs dizisinde yığını. Mıknatıslar dizi ve dizi alüminyum plaka deliklerden yığın işlemi sırasında hizalayın. O zaman bir yapışkan bant mıknatıs dizinin konumunu düzeltmek için kullanın.</li>
	<li>Φ600 mm SUJ2 çelik yeterli sayıda tabak derleme boncuk ve boncuk bir akrilik (veya metalik olmayan) kullanarak işlemek yere plaka böyle bir boncuk her deliğin (şekil 1 c, 1 dve 1e) aynı anda tuzak olur ki delikler açılmış değil aşırı boncuk kaldırılıyor.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde istenmeyen saçılma ve çıkık kapana kısılmış boncuk (şekil 1f) önlemek için üst plaka çıkarın.</li>
</ol>3. içbükey microwell imalat
<ol><li>Adımları 2.1 2.5, yukarıda, Petri kabına için üretilen içbükey microwell kalıp taşıyın.</li>
	<li>Bir PDMS monomer ile polydimethylsiloxane (PDMS) monomer ve üreticinin yönergeleri19 göre kür Ajan Mix: Ajan oranı 10:1 kür.</li>
	<li>PDMS karışımı de-gaz PDMS karışımı tuzağa kabarcıklar kaldırmak için bir desiccator ve vakum pompası kullanarak.</li>
	<li>Ve de-gaz tekrar 3.3 (şekil 1f) açıklanan olarak aynı yordam kullanılarak PDMS karışımı içbükey microwell kalıba dökün.</li>
	<li>PDMS karışımı bir ocağın bir boncuk gömülü PDMS substrat (şekil 1 g) oluşturmak 2 h için 80 ° C'de pişirin.</li>
	<li>Tedavi PDMS substrat kalıp (şekil 1 g) kaldırın. Kaldırma işleminde PDMS substrat kalıp üzerinden ayırmak için çamaşır şişe kullanarak metanol sprey.</li>
	<li>Bir Φ15 mm x 2 mm mıknatıs kullanarak, kapana kısılmış çelik boncuk PDMS substrat (şekil 1 h) kaldırın. Bu işlem için PDMS substrat boncukları çıkarmak için yeterince güçlü bir mıknatıs kullanılabilir.</li>
</ol>4. küresel kültür
<ol><li>İçbükey microwell desenli PDMS substrat Φ14 mm biyopsi yumruk kullanarak bu çalışmada 24-şey plaka takılabilir kesti.</li>
	<li>Elde edilen Φ14 mm PDMS substrat bir otoklav Sterilizatör 121 ° C ve 15 psi içinde sterilize.</li>
	<li>Steril PDMS substrat 24 iyi tabak yerleştirin.</li>
	<li>Hücre eki microwell yüzeye önlemek için %4 (w/v) pluronic F-127 solüsyonu ile gecede tüm PDMS substrat kat. Kaplama işlemi sırasında herhangi bir hava kabarcıkları içbükey microwells pipetting veya bir ultrasonik temizleyici kullanarak entrapped kaldırın.</li>
	<li>F-127 çözüm üç kez fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) kullanarak floş.</li>
	<li>1 mL (2 x 106 hücreler içeren) hücre-orta (Dulbecco'nın modifiye kartal orta) çözeltisi PDMS substrat üzerine tohum. Not tohumlama yoğunluğu hedef küresel boyutu ve/veya hedef hücre tipi göre değiştirilebilir. Burada, yağ kaynaklı kök hücreleri (ASC) kullanılmıştır.</li>
	<li>1 mL microwells (şekil 3), değil hapsolmuş aşırı hücreler kaldırmak için 1000 µL pipet kullanarak orta Aspire edin.</li>
	<li>Hücreleri 36.5 ° c, nem oranı, kuluçkaya > % 95 ve % 5 CO2 durumu. Bizim çalışmada kullanılan ASCs söz konusu olduğunda, bir küresel 48 h için hücreleri toplamak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy.">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li><li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes.">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li><li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brave+little+world:+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions.">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing.">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li><li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+micro+cartilage-like+tissue+formation+of+adipose-derived+stem+cell.">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids.">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).</li><li>Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medium+composition+on+the+morphology+and+function+of+rat+hepatocytes+cultured+as+spheroids+and+monolayers.">Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).</li><li>Nyberg, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver.">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel.">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Choi, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-size+embryoid+body+formation+in+concave+microwell+arrays.">Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).</li><li>Hwang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clustering+of+pancreatic+islet+cells+using+concave+microwell+array.">Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array.</a> Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).</li><li>Wong, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model.">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li><li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model.">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li><li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-lithographic+fabrication+of+concave+microwells+and+a+microfluidic+network.">Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.</a> Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).</li><li>Corning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).</li><li>Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+cavities+in+polydimethylsiloxane+using+DRIE+silicon+molds.">Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).</li><li>Choi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+culturing+of+single+microalgae+cells,+and+retrieval+of+colonies+using+a+perforated+hemispherical+microwell+structure.">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li><li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+PDMS+microlens+array+by+digital+maskless+grayscale+lithography+and+replica+molding+technique.">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography.">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography.">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li><li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells.">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu imalat yöntemi önündeki büyük sorunu alüminyum plaka delik aracılığıyla dizideki boncuk güvenli sabitleme yapıldı. Bu sorunu çözmek için manyetik kuvvet 30 x 30 mıknatıs dizi şeklinde boncuklar güvenli, rakamlar 6 ve 7gösterildiği gibi düzeltmek için kullanıldı. Manyetik akı yoğunluğu Ters polarite vardır, mıknatıs dizinin her mıknatıs yüzey merkezinde en güçlü olduğu. Manyetik kuvvet gücünü akı yoğunluğu üzerinde bağlıdır çünkü bonc...

Küresel forma yetiştirilen hücrelerin bir iki boyutlu düzlemsel kültür1' den daha gerçek vücut dokularında benzer. Bu avantaj göz önüne alındığında, pulcuklarının kullanımı çalışma hücre-hücre etkileşim2,3, bağışıklık-harekete geçirmek4,5ve farklılaşma6eleme ilaç geliştirmek için kabul edilmiştir. Ayrıca, birden çok hücre tipleri birleşmeyle pulcuklarının son zamanlarda insan geliştirme ve hastalık7eğitim için çok yararlı olan organoids (yakın-fizyolojik üç boyutlu (3D) doku) uygulanmış olan. Pulcuklarının üretmek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Öyle ki birbirimizi ve form pulcuklarının hücreleri toplamak en basit yöntem bir yapışkan olmayan yüzey kullanımını içerir. Petri kabına sığır serum albümin, pluronic F-127 veya onun yüzey yapıştırıcı89yapmak bir hidrofobik polimer (örneğin Poli 2-hydroxyethl metakrilat) ile tedavi edilebilir. Değer değişimi-flask yöntemi pulcuklarının10,11büyük miktarda üreten başka bir iyi bilinen yoludur. Bu yöntemde, hücre süspansiyon onları belgili tanımlık substrate bağlı olma önlemek için karıştırma tarafından tutulur. Bunun yerine, kayan toplamak için form pulcuklarının hücreleri. Yapışkan olmayan yüzey yöntemi ve spinner şişesi yöntemi pulcuklarının büyük miktarda üretebilir. Ancak, küresel boyutu yanı sıra izleme kontrol ve her küresel izleme zorlukları da dahil olmak üzere sınırlamalara tabi bunlar. Böyle bir sorun, başka bir küresel üretim yöntemi, için bir ilaç olarak yani, asılı bırak yöntemi istihdam12olabilir. Bu hücre süspansiyon damla kültür çanak kapağı alt üzerine yatırma içerir. Bu damlalar genellikle 15 ila 30 µL boyutunda ve yaklaşık 300-3000 hücreleri13içerir. Kapağı ters zaman damla yüzey gerilimi tarafından yerinde tutulur. Mikrogravite ortamı içinde her damla tek pulcuklarının ücretsiz sıvı-hava arabirim oluşturan hücreler, yoğunlaşmaktadır. İdam faydaları bırakma yöntem vardır izlemek ve her küresel olmayan yapışkan yüzeyi ve spinner şişesi yöntemleri göre izlemek kolay iken iyi kontrollü boyutu dağıtım sunar. Büyük üretim pulcuklarının ve üretim süreci aşırı emek olmasıdır Ancak, bu yöntem bir dezavantaj maruz kalırsa yoğun.
Bir düz microwell dizidir plaka birçok mikro büyüklükteki wells ile her 100 1000 µm arasında değişen bir çapa sahip. Microwells kullanırken küresel üretim ilkesi olmayan yapışkan yüzey yöntemi için benzer. Microwells öyle ki bu da her tek küresel izlemek kolaylaştırırken küresel boyutunu kontrol etmek kolaydır hücreleri veya pulcuklarının, ayırmak için microwells arasında boşluk sağlamak gerçek yararları. Microwells büyük bir sayı ile yüksek üretilen iş küresel üretim de mümkündür. Form wells seçeneğine farklı şekiller microwells başka bir avantajdır (lokma somun, silindirik, trigonal Prizmatik) bağlı olarak kullanıcıların benzersiz deneysel amaçlar. Genellikle, ancak, üç boyutlu (3D) içbükey (veya hemisferik) şekli tek pulcuklarının üniforma ölçekli üretim için en uygun olarak kabul edilir. Bu nedenle, içbükey microwells kullanışlılığı bu embriyonik kök hücre14, cardiomyocyte farklılaşma incelenmesi gibi birçok hücre biyolojisi Etütler adacık hücre insülin salgılanmasını kümeleri15, bildirilmiştir enzimatik aktivite tetkikine16ve ilaç direnci tümör pulcuklarının17.
Ne yazık ki, sık sık microwells imalatı özel micropatterning İmkanları gerektirir; Plazma ve iyon-kiriş ekipmanları reaktif iyon-gravür tabanlı yöntemleri gerekir klasik fotolitografi tabanlı yöntemler maruz kalma ve gelişmekte olan özellikleri gerektirir. Bu tür ekipman hangi, karmaşık üretim süreci ile birlikte mikroteknoloji erişimi değil biyologlar için giriş yüksek bir engel sunar maliyetlidir. Bu sorunların üstesinden gelmek için düşük maliyetli diğer yöntemler gibi (donmuş su damlacıkları kullanarak) litografi18 buz ve (bir membran, delik aracılığıyla substrat ve bir vakum kullanarak) esnek zar yöntemi14 önerdi. Ancak, bu yöntemler de desen boyutları, yüksek boy oranları kazanma ve daha büyük alan microwells üretimini denetlemek zor olduğu gibi ciddi sakıncaları uğramak.
Yukarıdaki sorunları aşmak için bir delik aracılığıyla substrat, çelik boncuk ve bir mıknatıs dizi roman içbükey microwell imalat yöntemi önerilmektedir. Bu yöntemi kullanarak, içbükey küresel microwells yüzlerce Manyetik kuvvet yoluyla kendi kendine kilitlenen metalik boncuk (şekil 1) mekanizmasının yararlanarak fabrikasyon. İmalat süreci çok az pahalı ve karmaşık özellikleri kullanımını gerektirir ve birçok gelişmiş beceriler talep etmez. Bu nedenle, hatta vasıfsız kişilerin kolayca bu imalat yöntemi üstlenebilir. Önerilen yöntem göstermek için insan yağ elde edilen kök hücre pulcuklarının üretmek için içbükey microwells içinde kültürlü.

<table><tbody><tr><td>CNC rotary engraver</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Micro drill bit</td><td>HAM Pr&amp;auml;zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&amp;Phi; 0.55 and 0.75 mm</td></tr><tr><td>Sulfuric acid 98%</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>For cleaning aluminum plate.&lt;br/&gt; Dilute with distilled water with 15% solution</td></tr><tr><td>Neodymium magnet</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 mm</td></tr><tr><td>Bearing ball</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&amp;Phi; 600 &amp;mu;m steel bead</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle&#039;s medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Adipose-derived mesenchymal stem cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

Bir küresel kültür bir in vivosağlar hücresel davranış anlamak için yararlı bir araçtır-üç boyutlu ortamda gibi. Yapışkan olmayan yüzeyleri, değer değiştirici şişeler, asılı damla ve microwells hücre hücre etkileşim, bağışıklık-harekete geçirmek, eleme, uyuşturucu çalışmalarda kullanılan gibi çeşitli küresel üretim yöntemleri kök hücre farklılaşması ve organoid üretimi. Bu yöntemler arasında microwells üç boyutlu bir içbükey geometri ile bilim adamları ve mühendisleri üniforma ölçekli küresel üretimi ve hangi ile bireysel pulcuklarının yanıt olabilir kolaylığı kendi avantajları göz önüne alındığında, dikkatini kazanmıştır sınıf başkanı. Esnek membranlar ve litografi buz kullanımı gibi düşük maliyetli yöntemler teklif etmiş olsa bile, bu tekniklerin desen boyutlarını kontrol zorluk başarı yüksek boy oranları ve üretim gibi ciddi sakıncaları uğramak microwells daha geniş alanları. Bu sorunların üstesinden gelmek için karmaşık yüksek maliyetli İmkanları için gerek kalmadan içbükey microwells imalatı için sağlam bir yöntem öneriyorum. Bu yöntem bir 30 x 30 delik aracılığıyla dizi, birkaç yüz mikrometre-sipariş çelik kullanır boncuk ve Manyetik kuvvet 900 microwells 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat olarak imal etmek. Hücre biyolojik uygulamalar için bizim yöntem uygulanabilirliği göstermek için biz yağ kök hücreleri 3 gün boyunca kültürlü ve başarıyla pulcuklarının bizim microwell platformu kullanarak üretti. Buna ek olarak, biz bir tertibatla simülasyon sayede Manyetik kuvvet yoluyla deliklere çelik boncuk tuzağa düşürmek için kullanılan mekanizma, araştırmak için gerçekleştirilen. Biz uyuşturucu tarama, doku yenilenmesi, kök hücre farklılaşma ve kanser metastaz gibi birçok küresel tabanlı hücresel çalışma için önerilen microwell imalat yöntemi uygulanan olabilir inanıyoruz.

Bir dışbükey kalıp ve microwell desen başarıyla aşağıdaki adımlarla 2.1-3.7 fabrikasyon. (Şekil 4). Ticari çelik boncuk 30 x 30 delik aracılığıyla dizisinde kapana kısıldın. Boncuk boncuk ve karşılık gelen aracılığıyla-delikleri (şekil 4a) arasında herhangi bir boşluk olmayan sıkı bir şekilde yapıldı. Fabrikasyon içbükey microwell şeklinde olduğunu içbükey yarımküresel, 600 µm, çapında...

Watch this Scientific Journal Video about A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries at JoVE.com

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Bu el yazması karmaşık yüksek maliyetli İmkanları için gerek kalmadan içbükey microwells imalatı, sağlam bir yöntem sunar. Manyetik kuvvet, çelik boncuk ve bir delik aracılığıyla dizi kullanarak, birkaç yüz microwells 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat kuruldu.

Eşleştirilmiş boncuk ve mıknatıs dizi Microwells değişken içbükey geometrileri ile kalıplama için

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

a-paired-bead-magnet-array-for-molding-microwells-with-variable

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Magnetic Forces and Fields

SCIENTISTS IN ACTION

8.6K Görüntüleme.  Chung-Ang University. Bu el yazması karmaşık yüksek maliyetli İmkanları için gerek kalmadan içbükey microwells imalatı, sağlam bir yöntem sunar. Manyetik kuvvet, çelik boncuk ve bir delik aracılığıyla dizi kullanarak, birkaç yüz microwells 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat kuruldu.

Video: A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is particularly useful for separations applications. Porous polydimethylsiloxane (PDMS) beads can be produced by heat-curing such an emulsion, allowing the interface between the aqueous and aliphatic phases to mold the morphology of the polymer. In the procedures described here, both polymer and crosslinker (triethoxysilane) are sonicated together in a cold-bath sonicator. Following a period of cross-linking, emulsions are added dropwise to a hot surfactant solution, allowing the aqueous phase of the emulsion to separate, and forming porous polymer beads. We demonstrate that this method can be tuned, and the SAV ratio optimized, by adjusting the electrolyte content of the aqueous phase in the emulsion. Beads produced in this way are imaged with scanning electron microscopy, and representative SAV ratios are determined using Brunauer&#8211;Emmett&#8211;Teller (BET) analysis. Considerable variability with the electrolyte identity is observed, but the general trend is consistent: there is a maximum in SAV obtained at a specific concentration, after which porosity decreases markedly.

Procedures used to generate microstructured concave-porosity polydimethylsiloxane beads are presented. Effects of electrolyte concentration and identity within the aqueous phase are particularly emphasized.

Konkav-gözenek PDMS Boncuk mikro-Fabrikasyon

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Kimya

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious approach of pipetting an arbitrary number of cells into well plates. The interactions between the stem cells forced into close proximity of one another promotes the generation of the EBs. Because the media in each of the wells has to be manually exchanged every day, this approach is manually intensive.
Moreover, because environmental parameters including cell-cell, cell-soluble factor interactions, pH, and oxygen availability can be functions of EB size, cell populations obtained from traditional hanging drops can vary dramatically even when cultured under identical conditions. Recent studies have indeed shown that the initial number of cells forming the aggregate can have significant effects on stem cell differentiation. We have developed a simple, rapid, and scalable culture method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development. Finally, these cells are easily accessible for further analysis and experimentation. This method is amenable to any lab and requires no dedicated equipment. We demonstrate this method by creating embryoid bodies using a red fluorescent mouse cell line (129S6B6-F1).

We show a simple and rapid method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development.

Damlalar Asma Shrinky Dink: embriyoid Organları Formu ve Kültür Basit Yolu

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

Biyoloji

Creating Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions in PDMS Microfluidic Chip via Self-Assembly Process of Colloidal Particles

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its transparency. Due to the softness of the PDMS material, however, it is challenging to use PDMS for building nanochannels. The channels tend to collapse easily during plasma bonding. In this paper, we present an evaporation-driven self-assembly method of silica colloidal nanoparticles to create nanofluidic junctions with sub-50 nm pores between two microchannels. The pore size as well as the surface charge of the nanofluidic junction is tunable simply by changing the colloidal silica bead size and surface functionalization outside of the assembled microfluidic device in a vial before the self-assembly process. Using the self-assembly of nanoparticles with a bead size of 300 nm, 500 nm, and 900 nm, it was possible to fabricate a porous membrane with a pore size of ~45 nm, ~75 nm and ~135 nm, respectively. Under electrical potential, this nanoporous membrane initiated ion concentration polarization (ICP) acting as a cation-selective membrane to concentrate DNA by ~1,700 times within 15 min. This non-lithographic nanofabrication process opens up a new opportunity to build a tunable nanofluidic junction for the study of nanoscale transport processes of ions and molecules inside a PDMS microfluidic chip.

We propose a simple self-assembly technique of silica colloidal nanoparticles to create a nanofluidic junction between two microchannels in polydimethylsiloxane (PDMS). Using this technique, a nanoporous bead membrane with a pore size down to ~45 nm was built inside a microchannel and applied to electrokinetic preconcentration of DNA samples.

Kolloidal Parçacıkların Öz-Montaj Süreci yoluyla PDMS mikroakışkan Chip Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions oluşturma

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its ...

Mühendislik

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Biyomühendislik

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Biyokimya

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or complicated equipment, making fabrication costly and incompatible with mass production, which is one of the most important preconditions for point-of-care tests (POCT) to be adopted in low-resource settings. This work describes the fabrication process of an acrylic (polymethylmethacrylate, PMMA) device for nanoparticle-conjugated enzymatic immunoassay testing using the computer numerical control (CNC) micromilling technique. The functioning of the microfluidic device is shown by performing an immunoassay to detect a commercial antibody using lysozyme as a model antigen conjugated to 100 nm magnetic nanoparticles. This device integrates a physical staggered restriction of only 5 &#181;m in height, used to capture magnetic microparticles that make up a magnetic trap by placing an external magnet. In this way, the magnetic force on the immunosupport of conjugated nanoparticles is enough to capture them and resist flow drag. This microfluidic device is particularly suitable for low-cost mass production without the loss of precision for immunoassay performance.

Microfluidics is a powerful tool for the development of diagnostic tests. However, expensive equipment and materials, as well as laborious fabrication and handling techniques, are often required. Here, we detail the fabrication protocol of an acrylic microfluidic device for magnetic micro- and nanoparticle-based immunoassays in a low-cost and simple-to-use setting.

Manyetik Nanopartikül Bazlı İmmünoassaylar için Kademeli Bir Kısıtlama ile Mikroakışkan Akrilik Cihazın Bilgisayar Sayısal Kontrol Mikrofrezelenmesi

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...