Diese Forschung wurde durch das grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen (NRF-2014R1A1A2057527 und NRF-2016R1D1A1B03934418) unterstützt.

1. Vorbereitung der Durchgangsbohrung Array Aluminium-Platte und Magnet-array
<ol><li>Bereiten Sie zwei 50 mm x 50 mm (oder größer) Aluminium-Platten. Die Dicke jeder Platte war 300 µm, die Hälfte des Durchmessers Perle ist.</li>
	<li>Bilden Sie ein 30 x 30 Durchgangsbohrung Array auf einem Aluminium-Platten mit einer CNC-Dreh Stecher mit einem Φ550-µm Mikro Bohrer mit 30 mm/s Sprung und 8000 u/min der Spindeldrehzahl. Der Abstand zwischen jedem Loch (Mitte zu Mitte) war 1 mm (Abb. 1a und Figur 2a, ich).</li>
	<li>Bilden Sie ein 30 x 30-Array von Φ750-µm Durchgangsbohrungen auf andere Aluminium-Platte, mit dem gleichen Verfahren wie in 1.2 (Abbildung 1a und Figur 2a, Ii) beschrieben.</li>
	<li>Befestigen Sie den beiden Platten aufeinander mit einem Klebeband und bilden Sie Φ3 mm Achse Löcher an jeder der vier Ecken der beiden Aluminiumplatten.</li>
	<li>Genießen Sie die Aluminiumplatten in 15 % Schwefelsäure für 12 h zu ihren Oberflächen zu reinigen. Da die dünne Schicht aus Aluminiumoxid auf die Oberfläche des Aluminiums machen es korrosionsbeständig, werden der Lochdurchmesser und der Dicke der Platte durch diese Säurebehandlung nicht geändert.</li>
	<li>Bilden Sie eine 30 × 30 Array von 1 x 1 x 1 mm-Neodym-Magneten (mit einer Magnetfeldstärke von 0.363 N). Sicherstellen Sie, dass jeder Magnet entgegengesetzter Polarität zu seinen Nachbarn. Zur Vermeidung von Bruch oder Streuung des Arrays Magnet befestigen Sie eine 30 x 30 mm Alu-Platte an der Unterseite des Magnet-Arrays mit doppelseitigem Klebeband (Abb. 2a, Iii und Einschub in Abbildung 2).</li>
</ol>(2) Perle Trapping Prozess
<ol><li>Ausrichten und Stapeln zwei Aluminiumplatten (top-Platte: 750-µm-Lochscheibe, Bodenplatte: 550-µm-Lochplatte) mit den vorbereiteten Ausrichtung Löcher an den vier Ecken der jede Platte (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Sperren Sie die beiden Platten zusammen durch Einfügen von M3 Schrauben in die Löcher der Ausrichtung, und befestigen Sie die Schrauben mit Muttern (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Stapeln Sie die Aluminium Platte Versammlung auf dem vorbereiteten Magnet-Array (Abbildung 1 b, 2 bund 2 c). Das Array von Magneten und das Array von Durchgangsbohrungen in die Aluminiumplatte während des stacking-Prozesses ausrichten. Verwenden Sie ein Klebeband, um die Position des Magneten Arrays zu fixieren.</li>
	<li>Ort, eine ausreichende Anzahl von Φ600 mm SUJ2 Stahl Perlen auf der Platte-Versammlung und manipulieren die Perlen mit einem Acryl (oder nicht-metallischen) Platte so, dass eine Perle in jedes Loch (Abbildung 1 c, 1Dund 1e) während gleichzeitig gefangen wird Entfernen der überschüssigen Perlen, die nicht in die Löcher gestellt haben.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die obere Platte zur Vermeidung unerwünschter Streuung und Dislokation der eingeschlossenen Perlen (Abb. 1f).</li>
</ol>(3) konkav Microwell-Fertigung
<ol><li>Verschieben Sie die konkave Microwell Form, produziert in Schritte 2.1 bis 2.5, oben auf einer Petrischale.</li>
	<li>Polydimethylsiloxan (PDMS) Monomer und Härtemittel gemäß des Herstellers Anweisungen19 mit einem PDMS-Monomer mischen: Heilung von Agent-Verhältnis von 10:1.</li>
	<li>De-Gas die PDMS-Mischung mit einem Exsikkator und Vakuumpumpe, um gefangen in der PDMS-Mischung Bläschen zu entfernen.</li>
	<li>Die PDMS Mischung in die konkave Microwell-Form und de-Gas wieder mit dem gleichen Verfahren wie in 3.3 (Abb. 1f) beschrieben.</li>
	<li>Backen Sie die PDMS-Mischung auf einer Herdplatte bei 80 ° C für 2 h um eine Perle eingebettet PDMS Substrat (Abbildung 1 g) zu bilden.</li>
	<li>Entfernen Sie das ausgehärtete PDMS-Substrat aus der Form (Abbildung 1 g). Sprühen Sie entfernen dabei Methanol mit waschen Flasche PDMS Substrat aus der Form lösen.</li>
	<li>Mit einem Φ15 mm x 2 mm Magnet eingeschlossenen Stahlkügelchen von PDMS-Substrat (Abbildung 1 h) entfernen. Dabei kann jeder Magnet, die ausreichend stark, extrahieren Sie die Perlen aus dem PDMS-Substrat verwendet werden.</li>
</ol>4. Sphäroid Kultur
<ol><li>Schneiden Sie das konkave Microwell-gemusterten PDMS Substrat mithilfe einen Φ14-mm-Biopsie-Punch in 24-Well-Platte in dieser Studie eingesetzt werden.</li>
	<li>Das daraus resultierende Φ14 mm PDMS Substrat in einem Autoklav Sterilisator bei 121 ° C und 15 Psi zu sterilisieren.</li>
	<li>Legen Sie die sterilisierte PDMS-Substrat in einer 24-well-Platte.</li>
	<li>Bestreichen Sie das gesamte PDMS-Substrat mit 4 % (w/V) Pluronic F-127 Lösung über Nacht Zellhaftung an die Microwell-Oberfläche zu verhindern. Während des Beschichtungsprozesses entfernen Sie Luftblasen eingeschlossen in der konkaven Mikrovertiefungen durch Pipettieren oder mithilfe eines Ultraschall-Reinigers.</li>
	<li>Spülen Sie die F-127-Lösung dreimal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Samen Sie 1 mL der Lösung (enthält 2 x 106 Zellen) Zelle-Medium (Dulbeccos geändert Eagle Medium) auf dem PDMS-Substrat. Beachten Sie, dass die Aussaatdichte je nach Zielgröße Sphäroid und/oder Ziel-Handy-Typ geändert werden kann. Hier wurden Fettgewebe Stammzellen (ASC) verwendet.</li>
	<li>Aspirieren Sie 1 mL des Mediums mit einer 1000 µL Pipette, entfernen alle überschüssigen Zellen, die nicht gefangen wurden in Mikrovertiefungen (Abbildung 3).</li>
	<li>Inkubation der Zellen bei 36,5 ° C, Luftfeuchtigkeit von > 95 % und 5 % CO2 Zustand. Im Falle der ASC in unserer Studie verwendeten aggregieren die Zellen auf ein Sphäroid in 48 h.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy.">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li><li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes.">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li><li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brave+little+world:+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions.">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing.">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li><li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+micro+cartilage-like+tissue+formation+of+adipose-derived+stem+cell.">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver.">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel.">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-size+embryoid+body+formation+in+concave+microwell+arrays.">Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).</li><li>Hwang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clustering+of+pancreatic+islet+cells+using+concave+microwell+array.">Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array.</a> Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).</li><li>Wong, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model.">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li><li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model.">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li><li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+culturing+of+single+microalgae+cells,+and+retrieval+of+colonies+using+a+perforated+hemispherical+microwell+structure.">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li><li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+PDMS+microlens+array+by+digital+maskless+grayscale+lithography+and+replica+molding+technique.">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography.">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography.">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li><li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells.">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Die größte Herausforderung für dieses Herstellungsverfahren wurde die sichere Befestigung der Perlen in der Durchgangsbohrung-Array in der Aluminiumplatte. Um diese Herausforderung zu bewältigen, wurde Magnetkraft in Form eines Arrays von 30 x 30 Magnet verwendet, um die Perlen fest, wie in Abbildung 6 und 7zu beheben. Die magnetische Flussdichte des Magnet-Arrays, die entgegengesetzten Polarität hat, ist am stärksten in der Mitte der einzelnen Magnetoberfläche. Da die Stärke der...

Zellen in einem Sphäroid Form gewachsen sind vergleichbar mit echten Gewebe im Körper als eine zweidimensionale planare Kultur1. Angesichts dieser Vorteil, ist die Verwendung von Sphäroide angenommen worden, um die Untersuchung von Zelle zu Zelle Interaktion2,3, immun-Aktivierung4, Drogen-screening-5und Differenzierung6zu verbessern. Darüber hinaus wurden Sphäroide Einbeziehung mehrerer Zelltypen vor kurzem auf Organellen (in der Nähe von physiologischen dreidimensionale (3D) Gewebe) angewendet, die sehr nützlich für das Studium der menschlichen Entwicklung und Krankheit7sind. Verschiedene Methoden wurden zur Sphäroide zu produzieren. Die einfachste Methode beinhaltet die Verwendung einer nicht klebenden Oberfläche, so dass die Zellen untereinander und Form Sphäroide aggregieren. Eine Petrischale können mit Rinderserumalbumin, Pluronic F-127 oder eine hydrophobe Polymer (z.B. Poly-2-Hydroxyethl-Methacrylat) zu seiner Oberfläche nicht klebend89behandelt werden. Die Spinner-Kolben-Methode ist eine weitere bekannte Mittel zur Herstellung großer Mengen an Sphäroide10,11. Bei dieser Methode werden Zellen von rühren zu verhindern, dass sie immer auf dem Untergrund befestigt in der Schwebe gehalten. Stattdessen, den schwimmenden Zellen Aggregat Form Sphäroide. Sowohl der nicht klebenden Oberfläche Methode und Spinner Kolben produzieren große Mengen an Sphäroide. Sie unterliegen jedoch Einschränkungen einschließlich Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Sphäroid-Größe sowie die Verfolgung und Überwachung der einzelnen Sphäroid. Als Heilmittel für solche Probleme, eine andere Sphäroid Produktionsmethode, nämlich die hängenden drop-Methode beschäftigt12sein können. Dies beinhaltet Hinterlegung Zelle Suspension Tropfen auf der Unterseite des Deckels einer Kulturschale. Diese Tropfen sind in der Regel 15 bis 30 µL in Größe und enthalten ca. 300 bis 3000 Zellen13. Wenn der Deckel umgekehrt wird, werden die Tropfen durch Oberflächenspannung gehalten. Der Schwerelosigkeit in jedem Tropfen konzentriert sich die Zellen, die bilden dann einzelne Sphäroide an der freien Flüssigkeit-Luft-Schnittstelle. Die Vorteile des Behangs Drop-Methode sind, dass es eine gut kontrollierte Größenverteilung bietet, während es ist leicht zu verfolgen und überwachen jede Sphäroid, bezogen auf die nicht klebende Oberfläche und Spinner Kolben Methoden. Jedoch verursacht diese Methode einen Nachteil, dass die massive Produktion von Sphäroide und des Produktionsprozesses selbst übermäßig Labor ist intensiver.
Ein Microwell-Array ist eine flache Platte mit vielen Mikro-Größe Brunnen, jeweils mit einem Durchmesser von 100 bis 1000 µm. Das Sphäroid Herstellungsprinzip Mikrovertiefungen Verwendung ist ähnlich dem der nicht klebenden Oberfläche Methode. Vorteile sind die Tatsache, dass die Mikrovertiefungen bieten Räume zwischen Mikrovertiefungen zur Abtrennung der Zellen oder Sphäroide, so dass es leicht zu Steuern der Sphäroid-Größe und gleichzeitig soll es einfach, jede einzelne Sphäroid zu überwachen. Mit einer großen Anzahl von Mikrovertiefungen ist Hochdurchsatz-Sphäroid Produktion auch möglich. Ein weiterer Vorteil des Mikroschälchen besteht die Möglichkeit, Form-Brunnen in verschiedenen Formen (hexaedrischen, zylindrisch, trigonal prismatisch) abhängig von den Benutzern einzigartige experimentelle Zwecke. In der Regel jedoch eine dreidimensionale (3D) konkave (oder halbkugelförmige) Form gilt als am besten geeignet für die Herstellung von einzelnen Sphäroide Uniform-Größe. Deshalb die Nützlichkeit der konkaven Mikrovertiefungen berichtet für viele Zelle Biologie Studien wie die Prüfung der Cardiomyocyte Differenzierung von embryonalen Stammzellen14, die Insulinsekretion von Inselzelle Cluster15, die enzymatische Aktivität von Hepatozyten16und die Resistenz des Tumors Sphäroide17.
Leider erfordert die Herstellung von Mikrovertiefungen oft spezialisierten Micropatterning Einrichtungen; konventionellen Fotolithografie basierenden Methoden erfordern Belichtung und Entwicklung Einrichtungen während reaktive Ionen-Ätzen-basierte Methoden Plasma und Ionenstrahl-Ausrüstung benötigen. Solcher Geräte ist kostspielig, die zusammen mit der komplizierten Fertigung eine hohe Eintrittsbarriere für Biologen präsentiert, die keinen Zugang zu Mikrotechnik. Um diese Probleme zu überwinden, andere kostengünstige Methoden wie z. B. Eis Lithografie18 (mit gefrorenen Wassertropfen) und der flexiblen Membran Methode14 (mit einer Membran, Durchgangsbohrung Substrat und ein Vakuum) vorgeschlagen worden. Diese Methoden entstehen jedoch auch gravierende Nachteile wie es schwierig, die Muster-Größen, die Erreichung der hohen Seitenverhältnisse und die Produktion von größeren Bereich Mikrovertiefungen zu kontrollieren.
Um die oben genannten Probleme zu überwinden, schlagen wir eine neuartige konkave Microwell Herstellungsverfahren unter Verwendung einer Durchgangsbohrung Substrat, Stahlkügelchen und ein Magnet-Array. Mit dieser Methode können Hunderte von konkaven sphärischen Mikrovertiefungen hergestellt werden, unter Ausnutzung des Mechanismus der magnetischen Kraft unterstützt Selbsthemmung metallischen Perlen (Abbildung 1). Der Produktionsprozess beinhaltet die Verwendung von sehr wenige teure und komplizierte Einrichtungen und verlangt nicht viele fortgeschrittene Fähigkeiten. Als solche können auch ungelernte Personen dieses Herstellungsverfahren leicht durchführen. Um die vorgeschlagene Methode zu demonstrieren, wurden menschliche Fettgewebe-Stammzellen in konkaven Mikrovertiefungen Sphäroide produzieren kultiviert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CNC rotary engraver</td>
			<td style="width:111px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:119px;">EGX-350</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro drill bit</td>
			<td style="width:111px;">HAM Pr&#228;zision</td>
			<td style="width:119px;">30-1301 TA</td>
			<td>&#934; 0.55 and 0.75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sulfuric acid 98%</td>
			<td style="width:111px;">Daejung</td>
			<td style="width:119px;">7683-4100</td>
			<td style="width:167px;">For cleaning aluminum plate. 
			Dilute with distilled water with 15% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:111px;">Supermagnete</td>
			<td>W-01-N</td>
			<td>1 x 1 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bearing ball</td>
			<td style="width:111px;">Agami Modeling</td>
			<td style="width:119px;">SUJ2</td>
			<td>&#934; 600 &#956;m steel bead</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:111px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">p2443</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

Eine Sphäroid-Kultur ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der zellulären Verhalten, dass es eine in Vivobietet-wie dreidimensionalen Umgebung. Verschiedenen Sphäroid Produktionsmethoden stammen wie z. B. in Studien der Zell-Zell-Interaktion, immun-Aktivierung, Drogen-screening, nicht klebende Oberflächen, Spinner Fläschchen und hängenden Tropfen Mikrovertiefungen verwendet wurden Zelldifferenzierung und organoide Generation. Unter diesen Verfahren haben Mikrovertiefungen mit einer dreidimensionalen konkave Geometrie gewann die Aufmerksamkeit der Wissenschaftler und Ingenieure, die aufgrund ihrer Vorteile Sphäroid Uniform mittlere Generation und die Leichtigkeit, mit der die Reaktionen der einzelnen Sphäroide werden kann überwacht. Obwohl kostengünstige Methoden wie der Einsatz von flexiblen Membranen und Eis Lithographie vorgeschlagen wurden, entstehen diese Verfahren gravierende Nachteile wie Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Muster-Größen und Erreichung der hohen Seitenverhältnisse und Produktion von größere Bereiche der Mikrovertiefungen. Um diese Probleme zu überwinden, schlagen wir eine robuste Methode zur Herstellung von konkaver Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Diese Methode nutzt eine 30 x 30 Durchgangsbohrung Array, mehrere hundert Mikrometer-Bestellung Stahl Perlen und Magnetkraft, 900 Mikrovertiefungen in einem 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat zu fabrizieren. Um die Anwendbarkeit der unsere Methode, um Anwendungen in der Zelle Biologie demonstrieren, wir Fettgewebe Stammzellen für 3 Tage kultiviert und Sphäroide Nutzung unserer Microwell-Plattform erfolgreich produziert. Darüber hinaus führten wir eine magnetostatischen Simulation, um den Mechanismus zu untersuchen, wobei Magnetkraft Stahlkügelchen in die Durchgangsbohrungen auffangen verwendet wurde. Wir glauben, dass die vorgeschlagenen Microwell Herstellungsverfahren auf viele Sphäroid-basierten zellulären Studien wie Drogen-Screening, Geweberegeneration, Stammzelldifferenzierung und Krebsmetastasen angewandt werden könnte.

Eine konvexe Form und Microwell Muster wurden erfolgreich von folgenden Schritte 2.1 bis 3.7 hergestellt. (Abbildung 4). Die kommerzielle Stahlkügelchen wurden in 30 x 30 Durchgangsbohrung Array gefangen. Die Perlen waren dicht ohne Lücken zwischen den Perlen und den entsprechenden Durchgangsbohrungen (Abb. 4a) statt. Die Form des vorgefertigten konkave Microwell ist konkav halbkugelförmigen, mit einem Durchmesser von 600 µm,...

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A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Dieses Manuskript stellt eine robuste Methode zur Herstellung von konkaven Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Mit Magnetkraft, Stahlkügelchen und einer Durchgangsbohrung Array, bildeten sich mehrere hundert Mikrovertiefungen in ein 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat.

Eine gekoppelte Wulst und Magnet-Array zum Formen von Mikroschälchen mit variabler konkave Geometrie

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

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8.6K Aufrufe.  Chung-Ang University. Dieses Manuskript stellt eine robuste Methode zur Herstellung von konkaven Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Mit Magnetkraft, Stahlkügelchen und einer Durchgangsbohrung Array, bildeten sich mehrere hundert Mikrovertiefungen in ein 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat.

Serie: A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Forschung

Biotechnik

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Schnelle und Low-Cost-Prototyping für Medizinische Geräte mit 3D Printed Formen für Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Mehrstufige Höhenverstellbarem Lithografie für Valved Mehrschichtige Mikrofluidiksysteme

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...