מחקר זה נתמך על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד (ה-NRF-2014R1A1A2057527 ו- NRF-2016R1D1A1B03934418).

1. הכנת מערך דרך חור אלומיניום פלייט, מגנט מערך
<ol><li>להכין שני 50 מ"מ x 50 מ"מ (או גדול) פלטות אלומיניום. העובי של כל צלחת היה מיקרומטר 300 זה ממחצית הקוטר חרוז.</li>
	<li>טופס מערך דרך חור 30 x 30 על אחד הלוחות אלומיניום באמצעות חרט סיבוביים CNC עם Φ550-מיקרומטר מיקרו מקדחה עם 30 מ מ/s של 8000 סל"ד של פלך מהירות וקצב מים עמוקים. המרחק בין כל חור (מרכז למרכז) היה 1 מ מ (איור 1a ו- איור 2a, אני).</li>
	<li>טופס מערך 30 x 30 מיקרומטר Φ750 דרך חורים על אחרים הצלחת אלומיניום, באמצעות ההליך אותו כמו זה שמתואר 1.2 (איור 1a , איור 2a, ii).</li>
	<li>לצרף שתי צלחות אחד את השני באמצעות סרט דביק ויוצרים Φ3 מ"מ יישור חורים בכל אחד בארבע הפינות של שתי פלטות אלומיניום.</li>
	<li>לטבול הלוחות אלומיניום 15% חומצה גופרתית במשך 12 שעות לניקוי משטחים שלהם. מאז שכבה דקה של אלומיניום אוקסיד על פני השטח של האלומיניום להפוך עמידים בפני קורוזיה, קוטר חור ואת עובי הלוח אינם משתנים על ידי טיפול החומצה הזו.</li>
	<li>טופס מערך 30 × 30 1 x 1 x 1 מ מ נאודימיום מגנטים (עם כוח מגנטי של 0.363 N). ודא כי כל מגנט הקוטביות הפוכה לשכן שלו. כדי למנוע את שבירת או פיזור של המערך מגנט, לצרף צלחת 30 x 30 מ מ אלומיניום התחתון של המערך מגנט באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי (איור 2 א, השלישי, שיבוץ ב איור 2).</li>
</ol>2. חרוז השמנה תהליך
<ol><li>ליישר, לערום את שני לוחות אלומיניום (top צלחת: 750-מיקרומטר-חור צלחת, צלחת התחתון: 550-מיקרומטר-חור צלחת) באמצעות החורים יישור מוכן בארבע פינות של כל צלחת (איור 1b).</li>
	<li>לנעול את שתי צלחות יחד על-ידי הוספת M3 ברגים לתוך החורים יישור ולאחר מכן לאבטח את המנעולים עם אגוזים (איור 1b).</li>
	<li>מחסנית מכלול לוחית אלומיניום במערך מגנט מוכן (איור 1b, 2bו- 2 c). יישר את המערך של מגנטים, המערך של דרך חורים לוח אלומיניום במהלך תהליך הערימה. לאחר מכן להשתמש סרט דביק כדי לתקן את המיקום של המערך מגנט.</li>
	<li>המקום מספר מספיק של Φ600 מ"מ SUJ2 פלדה חרוזים על מכלול צלחת ולטפל החרוזים באמצעות אקריל (או מתכתיים) צלחת כזו חרוז. הופך להיות לכוד בתוך כל חור (איור 1 ג, 1 דו 1e) בזמן בו זמנית הסרת את החרוזים עודף אשר לא הגישו החורים.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפלטה כדי למנוע פיזור לא רצויים פריקה של חרוזים לכודה (איור 1f).</li>
</ol>3. קעורה microwell ייצור
<ol><li>להעביר כייר קעורה microwell, מיוצר בשלבים 2.1-2.5, לעיל, צלחת פטרי.</li>
	<li>מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) מונומר והסוכן ריפוי על-פי הוראות היצרן19 עם מונומר PDMS: אשפרה הסוכן יחס של 10:1.</li>
	<li>גז מבטל את התערובת PDMS באמצעות desiccator וחדר משאבת ואקום כדי להסיר את כל הבועות לכוד בתוך התערובת PDMS.</li>
	<li>שופכים את התערובת PDMS לתבנית microwell קעורה וגז והתבקשתי שוב באמצעות אותו הנוהל כמו זה שמתואר 3.3 (איור 1f).</li>
	<li>אופים את התערובת PDMS על גזייה ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ליצור מצע PDMS חרוז-מוטבע (איור 1 g).</li>
	<li>הסר את המצע PDMS נרפא התבנית (איור 1 g). בתהליך הסרת, תרסיס מתנול באמצעות בקבוק כביסה כדי לנתק PDMS המצע של העובש.</li>
	<li>שימוש של Φ15 מ מ x 2 מ מ מגנט, הסר את החרוזים פלדה לכוד המצע PDMS (איור 1 h). במשך תהליך זה, כל מגנט חזקה דיה כדי לחלץ את החרוזים של המצע PDMS יכול לשמש.</li>
</ol>4. ספרואיד תרבות
<ol><li>חותכים המצע PDMS קעורה בדוגמת microwell באמצעות אגרוף ביופסיה מ מ Φ14 כדי להיות מצויד בצלחת 24-ובכן במחקר זה.</li>
	<li>לעקר את המצע PDMS מ"מ Φ14 שנוצר במעקר אוטוקלב 121 מעלות צלזיוס ו 15 psi.</li>
	<li>מקם את המצע PDMS סטיריליים לצלחת 24. טוב.</li>
	<li>מעיל המצע PDMS שלם עם 4% (w/v) pluronic F-127 פתרון בן לילה כדי למנוע התא מצורף אל פני השטח microwell. במהלך תהליך ציפוי, להסיר את כל בועות האוויר בפח של microwells קעורה באמצעות pipetting או באמצעות שימוש של ניקוי אולטראסוניות.</li>
	<li>לרוקן את הפתרון F-127 שלוש פעמים על-ידי שימוש באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>זרע 1 מ"ל של התא-בינוני (של Dulbecco ששינה נשר בינוני) פתרון (המכיל 2 x 106 תאים) על המצע PDMS. שימו לב כי ניתן לשנות את צפיפות זריעה לפי גודל ספרואיד היעד ו/או סוג תא היעד. . הנה, נגזר שומן בתאי גזע (ASC) שימשו.</li>
	<li>האחות של 1 מ"ל של מדיום באמצעות פיפטה µL של 1000 כדי להסיר תאים עודף זה לא נלכדו microwells (איור 3).</li>
	<li>דגירה התאים ב- 36.5 ° C, לחות של > 95% ו- 5% CO2 תנאי. במקרה של השיקופיים השתמשו במחקר שלנו, התאים צבירה כדי ספרואיד 48 שעות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy.">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li><li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes.">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li><li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brave+little+world:+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions.">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing.">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li><li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+micro+cartilage-like+tissue+formation+of+adipose-derived+stem+cell.">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids.">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).</li><li>Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medium+composition+on+the+morphology+and+function+of+rat+hepatocytes+cultured+as+spheroids+and+monolayers.">Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).</li><li>Nyberg, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver.">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel.">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Choi, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-size+embryoid+body+formation+in+concave+microwell+arrays.">Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).</li><li>Hwang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clustering+of+pancreatic+islet+cells+using+concave+microwell+array.">Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array.</a> Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).</li><li>Wong, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model.">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li><li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model.">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li><li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-lithographic+fabrication+of+concave+microwells+and+a+microfluidic+network.">Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.</a> Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).</li><li>Corning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).</li><li>Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+cavities+in+polydimethylsiloxane+using+DRIE+silicon+molds.">Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).</li><li>Choi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+culturing+of+single+microalgae+cells,+and+retrieval+of+colonies+using+a+perforated+hemispherical+microwell+structure.">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li><li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+PDMS+microlens+array+by+digital+maskless+grayscale+lithography+and+replica+molding+technique.">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography.">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography.">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li><li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells.">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

האתגר של מרכזי בשיטה זו פבריקציה נוספת היה מתקן מאובטח של החרוזים במערך דרך חור בצלחת אלומיניום. כדי לפתור את האתגר הזה, כוח מגנטי בצורה של מערך מגנט 30 x 30 שימש כדי לתקן את החרוזים בצורה מאובטחת, כפי שמוצג דמויות 6 ו -7. צפיפות השטף המגנטי של המערך מגנט, הכולל את הקוטביות הפוכ...

התאים גדלו לתוך טופס ספרואיד דומים יותר אמיתי רקמות בגוף מאשר תרבות מישורי דו-ממדי1. בהתחשב יתרון זה, השימוש spheroids אומץ כדי לשפר את המחקר של אינטראקציה לתא2,3, ההפעלה החיסונית4, סמים הקרנת5וכן בידול6. בנוסף, spheroids שילוב סוגי תאים מרובים לאחרונה הוחלו על organoids (ליד-פיזיולוגיים תלת מימדי (3D) רקמות), אשר מאוד שימושי עבור לימוד ופיתוח המחלה האנושית7. מספר שיטות השתמשו כדי לייצר spheroids. השיטה הפשוטה ביותר כרוך הניצול של משטח ללא דבק, כך התאים צבירה עם כל טופס spheroids. צלחת פטרי יכולים להיות מטופלים עם אלבומין שור, pluronic F-127 או פולימר הידרופובי (למשל פולי 2-hydroxyethl methacrylate) כדי להפוך את השטח ללא דבק89. השיטה ספינר-הבקבוק הוא אמצעים ידועים אחרים לייצר כמויות גדולות של spheroids10,11. בשיטה זו, תאים מוחזקים השעיה על-ידי ערבוב כדי למנוע מהם להפוך למצע. במקום זאת, הצפים תאים צבירה כדי טופס spheroids. שיטת משטח ללא דבק והן טווה את הבקבוק שיטה לייצר כמויות גדולות של spheroids. עם זאת, הם כפופים למגבלות לרבות קשיים שליטה בגודל ספרואיד, כמו גם את המעקב וניטור של כל ספרואיד. כתרופה בעיות כאלה, שיטה אחרת ספרואיד הייצור, כלומר, התליה זרוק שיטה יכול להיות מועסקים12. פעולה זו כרוכה הפקדת תא טיפות השעיה על החלק התחתון של המכסה לצלחת תרבות. טיפות אלה הם בדרך כלל 15 אל 30 µL בגודל ומכילים כ 300 עד 3000 תאים13. כאשר המכסה היא הפוכה, הטיפות מתקיימים במקום על ידי מתח. הסביבה microgravity כל טיפה מרכזת את התאים, המהווים ואז spheroids יחיד-הממשק נוזלי-אוויר חופשי. היתרונות של התליה טיפה שיטה הם שהיא מציעה התפלגות גודל ומבוקרות היטב, בעוד קל לאתר ולעקוב אחר כל ספרואיד, יחסית ללא דבק השטח, טווה את הבקבוק השיטות. עם זאת, שיטה זו כרוך חיסרון אחד בייצור מאסיבי של spheroids תהליך הייצור עצמה היא מוגזמת עבודה אינטנסיבית.
מערך microwell הוא שטוח צלחת עם בארות רבות בגודל מיקרו, שלכל אחד מהם בקוטר הנע בין 100 מיקרומטר 1000. העיקרון ייצור ספרואיד בעת שימוש microwells דומה לזה של שיטת משטח ללא דבק. היתרונות כוללים את העובדה כי microwells לספק רווחים בין microwells להפריד את התאים או spheroids, כך קל לשלוט על גודל ספרואיד, תוך כדי גם מה שהופך אותו קל לעקוב אחר כל ספרואיד יחיד. עם מספר גדול של microwells, ייצור תפוקה גבוהה ספרואיד אפשרי גם כן. יתרון נוסף של microwells הוא האפשרות טופס בארות של צורות שונות (מסגרות, גלילי, הטריגונלית מנסרתיים) בהתאם למטרות ניסוי ייחודי של המשתמשים. בדרך כלל, עם זאת, תלת מימדי (3D) קעורה (או המיספרי) צורה כמטוס המתאימים ביותר להפקת spheroids יחיד בגודל אחיד. לכן, התועלת של microwells קעורה דווחה ללימודי ביולוגיה תא רבים כגון אלה לבחון את הבידול cardiomyocyte של תאי גזע עובריים14, הפרשת אינסולין תא איון אשכולות15, פעילות אנזימטי של hepatocytes16, וההתנגדות סמים של גידול spheroids17.
לצערי, הזיוף של microwells לעיתים קרובות דורשת מתקנים מיוחדים micropatterning; שיטות קונבנציונליות מבוססי פוטוליתוגרפיה דורשות חשיפה ומתקני המתפתח בעוד שיטות המבוססות על יון-איכול תגובתי צריך ציוד פלזמה ויון-קרן. ציוד כזה הוא יקר, יחד עם תהליך ייצור מורכב, שמציג מחסום כניסה גבוה לביולוגים שאין להם גישה מיקרוטכנולוגיה. כדי להתגבר על בעיות אלה, חסכונית בשיטות אחרות כגון קרח ליתוגרפיה18 (באמצעות טיפות מים קפואים), שיטת הממברנה הגמישה14 (באמצעות קרום, דרך חור המצע ואקום) שהוצעו. עם זאת, שיטות אלה כרוכים גם החסרונות רציני כמו שזה היה קשה לשלוט את גודל דוגמת המילוי, הפרי של יחסי גודל גבוה, ואת הייצור של אזור גדול יותר microwells.
כדי להתגבר על הבעיות הנ ל, מה שאנו מציעים שיטת ייצור חדשניים microwell קעורה ניצול מצע דרך חור פלדה חרוזים, מערך מגנט. באמצעות שיטה זו, מאות קעורה microwells כדורית יכול להיות מפוברק על ידי ניצול של המנגנון של מגנטי כוח-בסיוע עצמית נעילה מתכתי חרוזים (איור 1). תהליך ייצור כרוכה בשימוש במתקני מעט מאוד יקר ומסובך, אינה דורשת מיומנויות מתקדמות רבות. ככזה, אנשים אפילו מיומנים יכולים בקלות מתחייבים בשיטה זו פבריקציה נוספת. כדי להדגים את השיטה המוצעת, נגזר על האדם-שומן בתאי גזע היו תרבותי ב microwells קעורה כדי לייצר spheroids.

<table><tbody><tr><td>CNC rotary engraver</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Micro drill bit</td><td>HAM Pr&amp;auml;zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&amp;Phi; 0.55 and 0.75 mm</td></tr><tr><td>Sulfuric acid 98%</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>For cleaning aluminum plate.&lt;br/&gt; Dilute with distilled water with 15% solution</td></tr><tr><td>Neodymium magnet</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 mm</td></tr><tr><td>Bearing ball</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&amp;Phi; 600 &amp;mu;m steel bead</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle&#039;s medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Adipose-derived mesenchymal stem cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

תרבות ספרואיד הוא כלי שימושי להבנת התנהגות הסלולר בכך שהוא מספק של ויוו-כמו סביבה תלת-ממדי. שיטות הייצור ספרואיד שונים כגון משטחים ללא דבק, טווה מבחנות, טיפות באוויר, microwells השתמשו במחקרים של אינטראקציה לתא, ההפעלה החיסונית, סמים הקרנה, גזע תאית התמיינות, ויצירת תא צורב. בין השיטות, microwells עם גאומטריה קעורה תלת מימדי השיגו את תשומת הלב של מדענים ומהנדסים, בהתחשב יתרונם של דור ספרואיד בגודל אחיד ואת הקלות שבה ניתן התגובות של spheroids בודדים פיקוח. אף-על-פי שיטות חסכוניים כגון השימוש של ממברנות גמיש, ליתוגרפיה קרח הוצעו, טכניקות אלו כרוכות חסרונות רציניים כגון קושי בשליטה על גודל התבנית, ההישג של יחסי גודל גבוהה והייצור של אזורים גדולים של microwells. כדי להתגבר על בעיות אלה, אנו מציעים שיטה חזקה בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. שיטה זו משתמשת מערך דרך חור 30 x 30, פלדה מיקרומטר מאה-הזמנה מספר חרוזים, כוח מגנטי כדי לבדות 900 microwells על מצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ. כדי להדגים את הישימות של השיטה שלנו ליישומים ביולוגית התא, אנחנו תרבותי תאי גזע אדיפוז 3 ימים והפיק בהצלחה spheroids באמצעות הפלטפורמה שלנו microwell. בנוסף, נוכל לבצע סימולציה magnetostatic לחקור את המנגנון, לפיה כוח מגנטי שימש כדי ללכוד את החרוזים פלדה החורים דרך. אנו מאמינים כי שיטת ייצור microwell המוצע יכול להיות מיושם מבוססי ספרואיד הסלולר מחקרים רבים כגון והתרופות הקרנה, התחדשות רקמות, התמיינות תאי סרטן גרורות.

Microwell דפוס ולעצב קמורה זוייפו בהצלחה על-ידי ביצוע שלבים 2.1 ל 3.7. (איור 4). החרוזים פלדה מסחרי נלכדו במערך דרך חור 30 x 30. החרוזים התקיימו בחוזקה ללא פערים בין החרוזים המתאים דרך-החורים (איור 4a). צורת microwell קעורה מפוברק קעור המיספרי, בקוטר של 600 מיק?...

Watch this Scientific Journal Video about A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries at JoVE.com

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

כתב יד זה מציג שיטה חזקה של בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. באמצעות כוח מגנטי, חרוזים פלדה מערך דרך חור, מספר מאות microwells נוצרו במצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ.

חרוז לזווג עם מגנט במערך צורניים Microwells עם משתנה גיאומטריות קעורה

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

a-paired-bead-magnet-array-for-molding-microwells-with-variable

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Magnetic Forces and Fields

SCIENTISTS IN ACTION

8.6K Views.  Chung-Ang University. כתב יד זה מציג שיטה חזקה של בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. באמצעות כוח מגנטי, חרוזים פלדה מערך דרך חור, מספר מאות microwells נוצרו במצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ.

Video: A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is particularly useful for separations applications. Porous polydimethylsiloxane (PDMS) beads can be produced by heat-curing such an emulsion, allowing the interface between the aqueous and aliphatic phases to mold the morphology of the polymer. In the procedures described here, both polymer and crosslinker (triethoxysilane) are sonicated together in a cold-bath sonicator. Following a period of cross-linking, emulsions are added dropwise to a hot surfactant solution, allowing the aqueous phase of the emulsion to separate, and forming porous polymer beads. We demonstrate that this method can be tuned, and the SAV ratio optimized, by adjusting the electrolyte content of the aqueous phase in the emulsion. Beads produced in this way are imaged with scanning electron microscopy, and representative SAV ratios are determined using Brunauer&#8211;Emmett&#8211;Teller (BET) analysis. Considerable variability with the electrolyte identity is observed, but the general trend is consistent: there is a maximum in SAV obtained at a specific concentration, after which porosity decreases markedly.

Procedures used to generate microstructured concave-porosity polydimethylsiloxane beads are presented. Effects of electrolyte concentration and identity within the aqueous phase are particularly emphasized.

ייצור Microbubble של חרוזים PDMS קעור-נקבוביות

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Chemistry

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious approach of pipetting an arbitrary number of cells into well plates. The interactions between the stem cells forced into close proximity of one another promotes the generation of the EBs. Because the media in each of the wells has to be manually exchanged every day, this approach is manually intensive.
Moreover, because environmental parameters including cell-cell, cell-soluble factor interactions, pH, and oxygen availability can be functions of EB size, cell populations obtained from traditional hanging drops can vary dramatically even when cultured under identical conditions. Recent studies have indeed shown that the initial number of cells forming the aggregate can have significant effects on stem cell differentiation. We have developed a simple, rapid, and scalable culture method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development. Finally, these cells are easily accessible for further analysis and experimentation. This method is amenable to any lab and requires no dedicated equipment. We demonstrate this method by creating embryoid bodies using a red fluorescent mouse cell line (129S6B6-F1).

We show a simple and rapid method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development.

טיפולית נידחת תלוי טיפות: דרך פשוטה טופס ותרבות גופים Embryoid

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

Biology

Creating Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions in PDMS Microfluidic Chip via Self-Assembly Process of Colloidal Particles

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its transparency. Due to the softness of the PDMS material, however, it is challenging to use PDMS for building nanochannels. The channels tend to collapse easily during plasma bonding. In this paper, we present an evaporation-driven self-assembly method of silica colloidal nanoparticles to create nanofluidic junctions with sub-50 nm pores between two microchannels. The pore size as well as the surface charge of the nanofluidic junction is tunable simply by changing the colloidal silica bead size and surface functionalization outside of the assembled microfluidic device in a vial before the self-assembly process. Using the self-assembly of nanoparticles with a bead size of 300 nm, 500 nm, and 900 nm, it was possible to fabricate a porous membrane with a pore size of ~45 nm, ~75 nm and ~135 nm, respectively. Under electrical potential, this nanoporous membrane initiated ion concentration polarization (ICP) acting as a cation-selective membrane to concentrate DNA by ~1,700 times within 15 min. This non-lithographic nanofabrication process opens up a new opportunity to build a tunable nanofluidic junction for the study of nanoscale transport processes of ions and molecules inside a PDMS microfluidic chip.

We propose a simple self-assembly technique of silica colloidal nanoparticles to create a nanofluidic junction between two microchannels in polydimethylsiloxane (PDMS). Using this technique, a nanoporous bead membrane with a pore size down to ~45 nm was built inside a microchannel and applied to electrokinetic preconcentration of DNA samples.

יצירת צומת תת-50 ננומטר ננו-נוזלי ב PDMS Microfluidic שבב באמצעות תהליך ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואיד

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its ...

Engineering

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

ייצור מערך microneedle פולימרית יתוגרפיה

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or complicated equipment, making fabrication costly and incompatible with mass production, which is one of the most important preconditions for point-of-care tests (POCT) to be adopted in low-resource settings. This work describes the fabrication process of an acrylic (polymethylmethacrylate, PMMA) device for nanoparticle-conjugated enzymatic immunoassay testing using the computer numerical control (CNC) micromilling technique. The functioning of the microfluidic device is shown by performing an immunoassay to detect a commercial antibody using lysozyme as a model antigen conjugated to 100 nm magnetic nanoparticles. This device integrates a physical staggered restriction of only 5 &#181;m in height, used to capture magnetic microparticles that make up a magnetic trap by placing an external magnet. In this way, the magnetic force on the immunosupport of conjugated nanoparticles is enough to capture them and resist flow drag. This microfluidic device is particularly suitable for low-cost mass production without the loss of precision for immunoassay performance.

Microfluidics is a powerful tool for the development of diagnostic tests. However, expensive equipment and materials, as well as laborious fabrication and handling techniques, are often required. Here, we detail the fabrication protocol of an acrylic microfluidic device for magnetic micro- and nanoparticle-based immunoassays in a low-cost and simple-to-use setting.

מיקרומילינג בקרה נומרי ממוחשב של מכשיר אקרילי מיקרופלואידי עם הגבלה מדורגת עבור בדיקות חיסוניות מבוססות ננו-חלקיקים מגנטיים

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Biochemistry

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...