Bu çalışma, bir Kurtuluş Ödülü NIH Pathway (GM 099893 hibe) ve fakülte başlangıç ​​fonları SRB yanı sıra bir Araştırma Projesi Grant (GM 042219 hibe) tarafından kısmen finanse edildi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama veya yayın için çalışmalarını göndermek için karar hiçbir rolü olmuştur.

Tampon çözeltiler hazırlanması 1. <ol><li> fosfat tamponlu tuzlu su hazırlama, ultra saf ile 1x nihai bir konsantrasyona kadar 10 x PBS stok çözelti seyreltilerek (PBS, pH 7.4) (distile ve deiyonize) su. </li><li> 2 ml asetonitril içindeki, 2 ml metanol, ultra saf H2O 1 mL ve formik asit 19 uL (0.1 mM son konsantrasyon) birleştirerek söndürme çözeltisi hazırlayın. </li><li> LC-MS, aşırı saf su, formik asit (% 0.2 [hacim / hacim] nihai konsantrasyon) ilave etmek suretiyle, bir çözücü hazırlanır. </li><li> asetonitril, formik asit (% 0.2 [hacim / hacim] nihai konsantrasyon) eklenerek LC-MS solvent B hazırlayın. Not: Bütün çözeltiler yüksek saflıkta reaktifler elde edildi (genellikle, yüksek performanslı sıvı kromatografi sınıfı) kullanılarak hazırlanmalıdır. Çözümler her deneyden önce taze hazırlanmış ve kullanımdan önce buz üzerinde muhafaza edilmelidir. </li></ol> Kararlı hal S. aureus Büyüme 2. Kurulması <ol><li> Streak S. aureuBir dondurulmuş gliserol stokundan triptik agar (TSA) üzerinde izolasyonu için ilgi lar suşları. 16-24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> triptik soya suyu (TSB) ya da her bir suşun tek koloniler ile steril cam inkübasyon tüplerde başka bir uygun ortam içinde 4 mL inoküle. eğimli inkübe (~ 70 ° açı) 16-20 saat boyunca 37 ° C&#39;de dakika (rpm) 60 rotasyon dönme ile. Not: Hücresel fizyolojisini etkiler, burada aşama 2.2 tarif edilenler de dahil olmak üzere, standart yöntemler kullanıldığında, gece boyuncaki kültürleri oksijen gradyanlar yatkındır. Böylece, (bkz adımlar 2,4-3,2, aşağıda) biyolojik kararlı durum sağlamak için çoklu arka seyreltme stratejisini kullanır. </li><li> 600 nm (OD 600) de aşama 2.2 kültürlerin optik yoğunluğunun ölçülmesi için bir spektrofotometre kullanılır. bir optik referans (boş) olarak steril ortamı kullanın. Steril TSB ortamı 0.05 50 mL&#39;lik bir OD 600 bu hücrelerin seyreltin ayrı olarak, 250 mL DeLong şişelerinde (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış). </li><li> incukesmek 280 rpm&#39;de çalkalanarak, bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de kültür. </li><li> Her 30 dakika, 600 ölçüm OD almak; Optik yoğunluklar arttıkça, bunların spektrofotometrenin doğrusal nüfuz aralığında kalacak şekilde TSB kültürleri seyreltilmesi için gerekli olabilir. </li><li> Adım 2.5 kültürler ~ 0.8-1.0 OD 600 elde zaman, 0.01-0.05 OD&#39;ye 600-37 ° C TSB 50 mL içine alt-kültürü ve tekrar 2.4 ve 2.5 adımları tekrarlayın. </li></ol> 3. Numune Toplama Kur <ol><li> Uygun bir kap içinde ezilmiş kuru buz dolu bir yatak hazırlayın (örneğin, cam tabak, buz kovası veya soğuk). </li><li> kültürlerin optik yoğunlukları arzu edilen hasat noktası yaklaştıkça, ≥5 dakika boyunca 35 mm işlemden geçirilmemiş olan Petri çanağı ve kuru buz üzerinde ön-soğutma çözeltinin söndürülmesi 1 ml. NOT: &quot;İstenilen hasat noktası&quot; deneysel hedeflerine bağlı olarak değişecektir. Örneğin, tek bir m incelemek için olanetabolites aerobik büyüme sırasında, bu durumda ana göstergeleri asetat atılımı ve post-üstel gelişme fazı 32, 33 boyunca asetat yeniden asimilasyon bulunmaktadır. Genel olarak, bu noktada, özel bir gelişme aşamasında (örneğin, üstel faz) içinde olmalıdır. Bu aşamada ilişkili belirli OD600 değerleri farklı bakteriyel suşlara ve büyüme ortamı arasında değişebilir. </li><li> Bir kauçuk tıpa içinde (-20 ° C&#39;ye kadar önceden soğutulmuş) bir paslanmaz çelik filtre hamuru yerleştirin ve bir ev tipi vakum veya vakum pompasına bağlı bir vakum şişesi üstüne yerleştirin. </li><li> vakum uygulayın ve üstüne bir karışık selüloz ester zarı (0.22 um gözenek boyutu) yerleştirin. NOT: frit eşit bir çapa sahip olan bir filtre kullanımı ve uygun örnek bir filtreden yerine kenar üzerine çekilir emin olmak için bu filtre merkezi kritiktir. Buz soğukluğunda steril H membran ıslatma 2 O yardımcı olabilirbir membran yerleştirmek ile. </li></ol> 4. Örnek Hasat <ol><li> OD 600 ~ 0.4-0.5 &#39;de, şişeye kültüre 13 mL kaldırmak için serolojik bir pipet kullanın ve filtreye örnek uygulamak. </li><li> Numunenin tamamı, filtre edildikten sonra, hemen orta ilişkili metabolitleri yıkamak için buz soğukluğunda PBS ≥5 mL ile filtre yıkayın. </li><li> vakum ayırın ve frit filtreyi kaldırmak için steril bir cımbız kullanın. Önceden soğutulmuş söndürme çözeltisi içine filtre (hücre tarafı aşağı) ters çevirin. Sıvı metabolik aktiviteyi kontrol altına alınması, hücrelerin hızlı söndürme sağlamak için kaldırılmıştır kısa sürede (saniye içinde, örneğin) hızlı bir şekilde yukarıdaki adımları gerçekleştirmek için önemlidir ve: NOT. </li><li> ≥20 dakika boyunca kuru buz üzerinde soğutma çözelti içinde filtre inkübe edin. </li><li> Petri kabındaki filtre (hücre tarafı yukarıda) tersine ve t ve hücreler durulama için bir mikropipet kullanarak steril cımbız kullanarako söndürme çözeltisi içine membrana. </li><li> ve söndürme çözeltisi içinde hücreler süspansiyon haline yeniden daha sonra 0.1 mm silis boncuklar ~ 100 uL içeren steril 2 ml darbeye dayanıklı tüp hücre süspansiyonu aktarın. kuru buz üzerinde ya da -80 ° C&#39;de bu saklayın. </li></ol> 5. metabolit Ekstraksiyon <ol><li> ıslak buz üzerinde çözülme örnekler ve döngüler arasındaki kuru buz üzerinde 2 dakika soğutma süreleri ile, 6,000 rpm&#39;de dört 30 s açılışları olan bir homojenleştiricide hücreleri parçalamak. </li><li> Maksimum hızda önceden soğutulmuş, soğuk mikrosantrifüj içinde 15 dakika için lizatları netleştirmek (yani ≤4 ° C&#39;de 18.213 x g&#39;de). </li><li> Temiz bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın. </li><li> Mikropipet kullanılarak, adım 6&#39;da kalıntı peptit içeriğinin miktarının belirlenmesi için bir mikrosantrifüj tüpüne numunenin çok küçük bir kısmını aktarmak; -80 ° C&#39;de kalan saklayın. Not: yedek numune hacmi aşama 6.1&#39;de kullanılan BCA bağlı olarak değişir. BuNumune derhal analiz için ıslak buz üzerinde saklanır ya da -80 ° C&#39;de donduruldu olmalıdır. </li></ol> 6. Bikinkoninik asit (BCA) deneyi <ol><li> Her bir örnek için kalıntı peptit konsantrasyonunu belirlemek için aşama 5.4 numuneleri kullanılarak, bu kit, üretici tarafından tavsiye edildiği gibi bir BCA deneyi gerçekleştirmek. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> LC-MS çözücü B 75 uL, 75 uL S. aureus özü, aşama 1.4&#39;te hazırlanan karıştırın. </li><li> Girdap 5 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de karıştırın ve sıkma için. </li><li> bir sıvı kromatografisi (LC) şişenin içine yüzer maddelerinden 100 uL yerleştirin ve kapağı. hiçbir hava kabarcığı numunede sıkışıp emin olun. </li><li> LC-MS otomatik numune alıcı üzerine LC şişeleri yükleyin ve yazılımda çalışan listesini düzenlemek &quot;Çevrimdışı Çalışma Listesi Editör.&quot; <ol><li> &quot;Örnek Adı&quot; doldurun (örn vahşi tip-1), &quot;Örnek pozisyonu&quot; (örneğin, P1-A1), &quot;Yöntem&quot; (örneğin, Formik Acid-Negatif Yöntem) ve &quot;Veri Dosyası&quot; (örneğin, vahşi tip-1) sütun. düğmesi &quot;Kaydet Çalışma Listesi&quot; butonuna tıklayın. &quot;Kütle Spektrometresi Veri Toplama İş İstasyonu&quot; yazılım ve giriş önceden kaydedilmiş Çalışma listesi açın. Sürekli LC-MS ölçümü başlatmak için &quot;Başlat Çalışma Listesi Çalıştır&quot; butonuna tıklayın. </li></ol></li><li> LC sistemi ile TOF spektrometre, bir sütun üzerinde örnekleri Ayrı bir uçuş (TOF) spektrometrenin bir zamana sütun bağlantı ve çift. aşağıdaki gibi, bir mobil faz gradyanı kullanın: 0-2 dak% 85 solvent B; 3-5 dakika, 80% solvent B; 6-7 dk,% 75 çözücü B; 8-9 dk,% 70 çözücü B; 10-11,1 dakika,% 50 çözücü B; 11,1-14 dakika,% 20 çözücü B; ve 14,1-24 dakika,% 5 solvent B; % 85 Çözücü B 10 dakika yeniden dengeleme süresi ve 0.4 ml min-1 bir akış oranı ile sona erer. </li><li> Izokratik pompa kullanılarak, aynı anda toplu eksen kalibrasyonu olanak sağlamak için çalışma ile bir referans kütlesi çözeltisi aşılamak. NOT: Bu adımStandart TOF spektrometresi kılavuzunda dayanmaktadır. <ol><li> asetik asit D4 ve heksakis (1H, 1H, 3H-tetrafloropropoksi) referans kütlesi çözeltisi olarak phosphazine gerçek zamanlı kalibrasyonu gerçekleştirmek için karışımını kullanarak. 2.5 ml dak akış hızı ile izokratik pompa -1 infüzyon için kullanılır. </li></ol></li></ol> İyon sayar 8. Toplu düzeltme <ol><li> (1 çoğaltmak, örneğin, vahşi tip) bir toplu düzeltme için bir referans örnek olarak hizmet etmek için herhangi bir örnek belirtin. </li><li> Referans numune içindeki tüm metabolitler için iyon sayımı toplamını hesaplar. Tüm numuneler için bu hesaplamayı tekrarlayın. </li><li> oranı oluşturmak için, referans numunenin toplam iyon sayımı ile her bir numunenin toplam iyon sayısı bölün. </li><li> Her bir metabolit için bir toplu düzeltilmiş iyon sayımı elde etmek için örnek / referans oranı ile bir numune içinde her bir metabolitin iyon sayısı bölün. </li></ol> 9. Peptid Normalleştirme <ol><li> DHer bir metabolit için normalleştirilmiş bir değer elde etmek için aşama 6&#39;da BCA analizi peptit konsantrasyonu ile adım 8&#39;de elde edilen her bir numune için seri düzeltilmiş iyon sayım değerlerinin ivide. Not: Aşama 9.1&#39;de elde edilen her bir metabolit için normalleştirilmiş, toplu toplu düzeltilmiş iyon sayısı ile doğrudan suşları arasında karşılaştırıldı ve istatistiksel analizi (-test örneğin, bir Mann-Whitney U) tabi tutulabilir. Seçenek olarak ise, bilinen bir metabolit değişmeden ya tedavisi veya genetik arka tarafından ayrışma metabolit nedeniyle değişiklikleri tespit etmek için bir değer olarak kullanılabilir olması. Ekstraksiyon tamponu L-norvalinyl veya gluraric asit, bilinen bir miktarının sisteme duhul edilmesi Örnek işleme 34 boyunca kaybını düzeltmek için kullanılabilir. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Tüm küçük moleküllü metabolitleri merkez metabolik yollardaki ortak kökenli aracılığıyla birbirine bağlanır. üstel büyüme sırasında, bakteriyel hücreler, belirli koşullar altında, fizyolojik durumunun bir görüntü sağlar, biyolojik ve metabolik kararlı halde bulunmaktadır. Cody ilv ve GTP yanıt vererek besin yeterliliğini izler. Ilv ve GTP havuzları damla olarak, Cody aktivitesi büyük olasılıkla artan besin tüketme 30 artan uyum, hedef genlerin ekspresyonunu ayar...

Bakteriyel patojenler konak ortamında birçok zorluklarla uğraşmak zorundadır. Bağışıklık hücreleri tarafından doğrudan saldırısına ek olarak, ev sahibi de, bakterinin yaşamda kalması ve çoğaltma üreten beslenme bağışıklık 1, 2 temel besin ayrı tutmaktadır. Bu düşmanca ortamlarda hayatta kalmak için, bakteriyel patojenler virülans faktörleri dağıtın. Bu faktörlerin bazıları bakteriler bağışıklık karşılığına izin; diğer faktörler doku türevi bileşenleri 3, 4, 5, tüketerek eksik besin doldurmak için bakteri sağlayabilir, örneğin hiyaluronidaz, thermonuclease ve lipaz gibi sindirim enzimleri, salgılanan içerir. Gerçekten de, bakteriler virülans, 6 faktörleri 7 üretimine hücrenin fizyolojik durumunu bağlayan düzenleyici sistemleri gelişmiştir, <s<html> class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10 kadar. Artan miktarda kanıt vücut metabolizmasını ve virülans bağlayan kritik bir regülatör olarak Cody işaret ediyor. İlk dipeptit permeaz (DPP) gen 11 bir bastıncısı olarak Bacillus subtilis keşfedilmiştir, ancak Cody hemen hemen tüm düşük G + C Gram-pozitif bakteriler 12, 13 tarafından üretildiği bilinmektedir ve düzenler karbon katılan genlerin onlarca azot metabolizması 14, 15, 16, 17, 18, 19. Patojenik türlerde, Cody, en önemli hastalık oluşturma gen 20, 21 bazı ekspresyonunu kontrol,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody ligandların iki sınıf ile bir DNA-bağlama proteini olarak aktive edilir: dallı zincirli amino asitler (BCAAs, izolösin, lösin ve valin [ILV]) ve GTP transkripsiyonu bu besinler bol olduğunda., Cody bastırmaktadır (ya da bazı durumlarda, uyarır). bu besin sınırlı hale geldikçe, Cody aktivitesi aşamalı olarak azalır,-yolları yeniden merkezi metabolizmaya bağlı çeşitli metabolik yollar aracılığıyla öncüleri bir kademeli transkripsiyonel yanıt olarak ortaya çıkan 28, 29, 30. Kütle spektrometrisi (LC-MS) bağlanmış Tandem sıvı kromatografisi doğru küçük moleküllü hücre içi metabolitler 31 tanımlamak ve miktarını güçlü bir tekniktir. transkripsivonel ile eşleştirilmiş zamanriptome analizi (örneğin, RNA-Dizi), bu analitik akışı çevresel veya beslenme stres yanıt olarak oluşan fizyolojik değişiklikler hakkında fikir verebilir. Burada, LC-MS ile Staphylococcus aureus hücreleri ve daha sonra analiz metabolit ekstraksiyonu için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım S. aureus fizyolojisi üzerinde Cody pleiotropik etkilerini göstermek için kullanılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

bakteriyel patojenler engellemek için bir çaba, ana sıklıkla enfeksiyon yerinde besinlerin kullanılabilirliğini sınırlamaktadır. Bu sınırlama düzenleyici faktörler hücresel metabolizmayı ayarlayarak, cevap hangi anahtar metabolitlerin bolluklarını değiştirebilir. Son yıllarda, proteinler ve RNA bir dizi hastalık oluşturma gen ekspresyonunun önemli regülatörleri olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, Cody proteini dallı zincirli amino asitler ve GTP seviyelerine yanıt ve yaygın olarak düşük G + C Gram-pozitif bakteriler ile muhafaza edilir. Staphylococcus aureus küresel regülatör olarak, Cody virülans ve metabolik genlerin onlarca ifadesini kontrol eder. Biz S. aureus Cody, kısmen, potansiyel konak ortamında karşılaşılan besin sınırlayıcı koşullara uyum sağlama çabası içinde olan metabolik durumunu değiştirmek için kullandığı varsayımında. Bu makale kütle spektrumu ile birleştiğinde sıvı kromatografisi kullanılarak S. aureus metabolitleri çıkarılması ve analiz edilmesi için bir yöntem tarif etmektedirtrometry, bu hipotezi test etmek için geliştirilen bir protokoldür. yöntem ayrıca, sürekli kemostat kültürlerin kullanmadan biyolojik kararlı duruma ve sürekli havalandırma sağlamak gibi titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlayacaktır iyi uygulamaları, vurgulamaktadır. USA200 metisiline duyarlı S. aureus Bağıl UAMS-1 ebeveyn soy izole izogenik codY mutantı aspartat (örneğin, treonin ve izolösin) elde edilen amino asit önemli artışlar sergilemiştir ve (bunların ön azalır, örneğin aspartat ve O-asetilhomoserin ). Bu bulgular, bir RNA seq analizi ile elde edilen transkripsiyon veriler ile iyi bir korelasyon: Cody boş mutantta 10- ve 800-kat arasında up-regüle bu yolların genler idi. transcriptome ve metabolom küresel analizlerini Coupling çevresel veya beslenme stresle karşılaştıklarında bakteri phys içine potansiyel kavrayış sağlayan onların metabolizmasını değiştirebilir nasıl ortaya çıkarabilirbesin tüketme ile ilişkili iological değişiklikler enfeksiyon sırasında yaşadı. Bu bulgular, yeni anti-infektifler ve terapötik maddelerin geliştirilmesi için yol açabilecektir.

Biz zengin, karmaşık ortamda in vitro büyüme sırasında S. aureus hücre içi metabolit havuzları analiz ettik. Prensip kanıtı olarak, karşılaştırıldığında, metisiline duyarlı S. aureus osteomiyelit arasında metabolit profilleri UAMS-1 (vahşi tip [WT]) ve küresel bir transkripsiyonel düzenleyici Cody (Δ codY) 26 eksik izogenik soy izole eder. Protokol aşama 2&#39;de tarif edildiği gibi kararlı durum, WT ...

Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid Chromatographyâ€“Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

a-tandem-liquid-chromatographymass-spectrometry-based-approach-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K Görüntüleme.  Georgetown University.  Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar. 

Video: A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Biyokimya

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management of product yield and quality. Metabolomics data provides a read-out of these interactions at a given moment in time and is informative of an organism&#39;s biochemical status. Further, individual metabolites or panels of metabolites can be used as precise biomarkers for yield and quality prediction and management. The plant metabolome is predicted to contain thousands of small molecules with varied physicochemical properties that provide an opportunity for a biochemical insight into physiological traits and biomarker discovery. To exploit this, a key aim for metabolomics researchers is to capture as much of the physicochemical diversity as possible within a single analysis. Here we present a liquid chromatography-mass spectrometry-based untargeted metabolomics method for the analysis of field-grown wheat grain. The method uses the liquid chromatograph quaternary solvent manager to introduce a third mobile phase and combines a traditional reversed-phase gradient with a lipid-amenable gradient. Grain preparation, metabolite extraction, instrumental analysis and data processing workflows are described in detail. Good mass accuracy and signal reproducibility were observed, and the method yielded approximately 500 biologically relevant features per ionization mode. Further, significantly different metabolite and lipid feature signals between wheat varieties were determined.

A method for the untargeted analysis of wheat grain metabolites and lipids is presented. The protocol includes an acetonitrile metabolite extraction method and reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry methodology, with acquisition in positive and negative electrospray ionization modes.

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler