この作品は独立賞にNIH経路（GM 099893を付与）し、教員のスタートアップ資金SRBに、だけでなく、研究プロジェクト助成（GM 042219を付与）によって部分的に資金を供給されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集および解釈、または出版のために仕事を提出するという決定には役割がありませんでした。

緩衝溶液の調製<ol><li>超純と1Xの最終濃度になるように10×PBSのストック溶液を希釈することにより（蒸留及び脱イオン）水;リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4のPBS）を調製。 </li><li>アセトニトリルを2mL、メタノール2mL、超純H 2 O 1mLの、及びギ酸の19μL（0.1mMの最終濃度）を組み合わせることにより、クエンチング溶液を調製します。 </li><li> LC-MSは、超純水にギ酸（0.2％[v / v]の最終濃度）を添加することによりA溶媒準備。 </li><li>アセトニトリルにギ酸（0.2％[v / v]の最終濃度）を添加することによりLC-MSの溶媒Bを調製。 注：すべてのソリューションは、（一般的に高速液体クロマトグラフィーグレード）利用可能な最高純度の試薬を用いて調製されなければなりません。ソリューションは、各実験の前に新たに調製し、使用前に氷上で保存してください。 </li></ol>定常状態黄色ブドウ球菌の成長2.確立<ol><li>ストリークS. aureu凍結グリセロールストックからのトリプシン大豆寒天（TSA）の分離のための関心のS株。 16-24時間37℃でインキュベートします。 </li><li>トリプシン大豆ブロス（TSB）又は各株の単一コロニーを有する滅菌ガラス培養管に別の適切な培地4mlに植菌。 16-20時間、37℃で毎分60の回転（rpm）で回転させながら傾斜（〜70°の角度）でインキュベートします。 注：細胞生理に影響を与える工程2.2に記載のものを含む、標準的な方法を使用するときに一晩培養物を酸素勾配を受けやすいです。したがって、我々は（以下、ステップを2.4から3.2を参照）、生物学的定常状態を確保するために複数のバック希釈戦略を採用しています。 </li><li> 600nmで（OD 600）でのステップ2.2からの培養物の光学密度を測定するために分光光度計を使用します。光学的基準（ブランク）として滅菌媒体を用います。別々の、250mLのデロングフラスコ内（37℃に予め温めておいた）滅菌TSB培地50mlに0.05のOD 600にこれらの細胞を希釈します。 </li><li> IncuBATE 280 rpmで振盪しながら水浴中で37℃で培養。 </li><li> 30分ごとに、OD 600回の測定を行います。光学濃度が増加するにつれて、それは、分光光度計の線形吸光度範囲内に留まるようにTSBで培養物を希釈することが必要になることができます。 </li><li>ステップ2.5からの培養物を〜0.8〜1.0のOD 600を達成したとき、0.01〜0.05のOD 600まで37℃TSB 50mlにそれらを継代培養を繰り返し2.4および2.5ステップ。 </li></ol> 3.サンプルのコレクションのセットアップ<ol><li>適当な容器（ 例えば、ガラス皿、アイスバケット、またはクーラー）に砕いたドライアイスのベッドを準備します。 </li><li>培養物の光学濃度が所望の収穫点に近づくと、≥5分間ドライアイス上で35ミリメートル未処理のペトリ皿と予備冷却するために急冷溶液1mLを加えます。 注：「希望収穫ポイントは」実験的な目標に応じて異なります。例えば、一方がMを検査した場合etabolites好気性成長の間、この状態の重要な指標は、酢酸排泄及び後指数増殖期32、33中の酢酸の再同化を含みます。一般に、この点は、特定の成長段階（ 例えば、対数期）以内でなければなりません。この段階に関連する特定のOD 600の値は、異なる細菌株および増殖培地の間で変化してもよいです。 </li><li>ゴム栓で（-20℃に予冷）ステンレス鋼フィルターフリットを配置し、ハウス真空または真空ポンプに取り付けられた真空フラスコの上にそれを置きます。 </li><li>真空を適用し、上部に混合セルロースエステル膜（0.22μmの孔径）を置きます。 注：フリットと同等の直径を有するフィルタを使用すると、適切サンプルがフィルタを介してではなく、エッジ上に描画されることを保証するために、このフィルタをセンタリングすることが重要です。氷冷、滅菌H 2 Oを用いて膜を濡らすことを助けることができます膜を配置しています。 </li></ol> 4.サンプルの収穫<ol><li> OD 600〜0.4〜0.5で、フラスコからの培養物の13 mLのを除去するために血清学的ピペットを使用して、フィルターに試料を適用します。 </li><li>全サンプルを濾過した後、直ちに培地関連代謝産物を洗い流すために氷冷PBSの≥5mLでフィルターを洗浄します。 </li><li>真空を外し、フリットからフィルタを除去するために滅菌ピンセットを使用します。予冷クエンチ溶液にフィルタ（セル側ダウン）を反転させます。 注：これは、すぐに液体が代謝活性を逮捕、細胞の急速冷却を確保するために除去されているように（ すなわち、数秒以内）すぐに上記の手順を実行することが重要であると。 </li><li> ≥20分間ドライアイス上でクエンチ溶液中でフィルターをインキュベートします。 </li><li>滅菌ピンセットを用いて、ペトリ皿にフィルタ（セルサイドアップ）を反転し、Tのオフ細胞をリンスするためにマイクロピペットを使用して彼は、クエンチ液に膜。 </li><li>急冷溶液中で細胞を再懸濁し、次いで0.1ミリメートルシリカビーズ〜100μLを含む無菌2mLの耐衝撃性チューブに細胞懸濁液を移します。ドライアイス上または-80°Cでこれを保管してください。 </li></ol> 5.代謝物の抽出<ol><li>融解サンプルを湿潤氷上及びサイクル間ドライアイス上で2分間の冷却期間と、6,000rpmで4つの30秒バーストでホモジナイザーで細胞を破壊します。 </li><li>最高速度で予め冷却、冷蔵微量で15分間溶解物を明確に（ すなわち、≤4℃で18213×gで）。 </li><li>きれいな微量遠心チューブに上清を移します。 </li><li>マイクロピペットを用いて、ステップ6中の残留ペプチド含量の定量化のためのマイクロ遠心チューブにサンプルの小部分を転送します。 -80℃で残りを格納します。 注：予約済み試料の体積は、ステップ6.1で使用されるBCAアッセイに依存して、変化します。このサンプルは、即時の分析のために湿った氷の上に格納されるか、または-80℃で凍結されなければなりません。 </li></ol> 6.ビシンコニン酸（BCA）アッセイ<ol><li>各試料の残留ペプチド濃度を決定するために、ステップ5.4からのサンプルを用いて、キットの製造業者によって推奨されるようにBCAアッセイを行います。 </li></ol> 7. LC-MS <ol><li>ステップ1.4で調製したLC-MS溶媒B、75μLで抽出した黄色ブドウ球菌の75μLを混合します。 </li><li>混合し5分間13,000×gで回転させる渦。 </li><li>液体クロマトグラフィー（LC）バイアルに上清の100μLを置き、それをキャップ。空気の泡が試料中に閉じ込められていないことを確認してください。 </li><li> LC-MSオートサンプラーにLCバイアルをロードし、ソフトウェアで実行されているリストを編集「オフラインワークリストエディタ。」 <ol><li> &quot;サンプル名&quot;を記入（ 例えば、野生型-1）、 &quot;サンプル位置&quot;（ 例えば、P1-A1）、 &quot;メソッド&quot;（ 例えば、ギACID-負の方法）、および&quot;データファイル&quot;（ 例えば、野生型-1）の列。ボタン「保存ワークリスト」ボタンをクリックしてください。 「質量分析データ収集ワークステーション」のソフトウェアと入力以前に保存されたワークリストを開きます。連続LC-MS測定を開始するには、「スタートワークリストファイル名を指定して実行」ボタンをクリックしてください。 </li></ol></li><li>列上のサンプルを分離し、フライト（TOF）スペクトロメータ、およびLCシステムと結合TOF分析計の時間に列をリンクします。次のように移動相勾配を使用する：0-2分、85％溶媒Bを、 3~5分、80％溶媒B。 6~7分、75％溶媒B。 8~9分、70％溶媒B。 10から11.1分、50％溶媒B。 11.1から14分、20％溶媒B。及び14.1から24分、5％溶媒B。 85％溶媒Bで10分間の再平衡期間と0.4 mLの分-1の流量で終わります。 </li><li> アイソクラティックポンプを用いて、同時質量軸の較正を可能にするために実行して基準質量溶液を注入します。 注：この手順標準TOF分析計のマニュアルに基づいています。 <ol><li>リアルタイムキャリブレーションを実行するために、基準質量液として酢酸D4及びヘキサキス（1H、1H、3H-テトラフルオロ）ホスファジンの混合物を使用します。分-1注入用の2.5ミリリットルの流量でアイソクラティックポンプを使用します。 </li></ol></li></ol>イオン数の8バッチ修正<ol><li> （1複製、 例えば、野生型）バッチ補正のための基準サンプルとして機能する任意のサンプルを指します。 </li><li>基準試料内の全ての代謝産物のためのイオンカウントの合計を計算します。すべてのサンプルについてこの計算を繰り返します。 </li><li>比を生成するために、参照試料の総イオンカウントすることにより、各試料の総イオンカウント数を分割します。 </li><li>各代謝産物のバッチ補正イオンカウントを得るために、サンプル/基準比率によってサンプル内の各代謝産物のためのイオンカウントを分けます。 </li></ol> 9.ペプチドの正規化<ol><li> D各代謝産物の正規化値を生成するためにステップ6でBCAアッセイを用いて決定したペプチド濃度によって、ステップ8で得られた各サンプルのバッチ補正イオンカウント値をivide。 注：ステップ9.1で得られた各代謝産物の正規化、バッチバッチ補正イオンカウントは直接株の間で比較し、統計的分析（-test 例えば、マンホイットニーU）に供することができます。あるいは、いずれかの治療または遺伝的背景により変化しないことが知られている代謝産物は、代謝産物の分解による変化を検出するための正規化として使用することができます。抽出緩衝液中のL-ノルバリン又はgluraric酸の既知量の包含は、試料処理34中の損失を補正するために使用することができます。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

すべての小分子代謝物は、中央代謝経路におけるそれらの共通の起源を介して相互に接続されています。指数関数的成長の間、細菌細胞は、特定の条件の下での生理的状態のスナップショットを提供し、生物学的および代謝定常状態です。コーディはILV​​とGTPに応答することによって栄養素充足を監視します。 ILVとGTPプール降下として、コーディ活性は、おそらく徐々に栄養枯渇<sup class="...

細菌性病原体は、ホスト環境内の多くの課題に取り組まなければなりません。免疫細胞による直接攻撃に加えて、ホストはまた、栄養免疫1、2を生成し 、細菌の生存および複製に必須の栄養素を隔離します。これらの厳しい環境を生き残るためには、細菌性病原体は、病原性因子を展開します。これらの要因のいくつかは、細菌が免疫応答を回避することができます。他の要因は、組織由来成分3、4、5を消費して不足している栄養素を補充するために、細菌を可能にすることができるようなヒアルロニダーゼ、thermonuclease、およびリパーゼなどの消化酵素を分泌が挙げられます。実際、細菌が毒性、6因子7の産生に対する細胞の生理学的状態を結ぶ調節系を進化させてきました、 <s<html>クラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 8、9、10アップ。 証拠の成長体は、代謝および毒性を結ぶ重要な調節因子としてのコーディを指します。第ジペプチドパーミアーゼ（DPP）遺伝子11のリプレッサーとして枯草菌で発見が、コーディは、現在、ほぼ全ての低G + Cグラム陽性細菌12,13によって産生されることが知られており、炭素に関与する遺伝子の多数を調節して窒素代謝14、15、16、17、18、19。病原性の種では、コーディも最も重要な病原性遺伝子の一部20、21の発現を制御し、EF &quot;&gt; 22、23、24、25、26、27コーディは二つの配位子のクラスによってDNA結合タンパク質として活性化される：分岐鎖アミノ酸（BCAA、イソロイシン、ロイシン、およびバリン[ILV]）及びGTP。これらの栄養素が豊富である場合、コーディは抑制する（またはいくつかの場合において、刺激）転写を。これらの栄養素は限らなるように、コーディ活性は徐々に中央代謝に接続された様々な代謝経路を介してその再ルーティング前駆段階的転写応答をもたらす、低減されます28、29、30。 質量分析（LC-MS）に連結されたタンデム液体クロマトグラフィーを正確に小分子の細胞内代謝物31を同定および定量することができる強力な技術です。相互コンダクタンスとペアになったときriptome分析（ 例えば、RNA-配列）、この解析ワークフローは、環境または栄養ストレスに応答して起こる生理的変化への洞察を提供することができます。ここでは、LC-MSを介した黄色ブドウ球菌細胞とその後の分析からの代謝産物の抽出のための方法を提示します。このアプローチは、 黄色ブドウ球菌の生理学上のコーディの多面的な効果を発揮するために使用されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

細菌性病原体を阻止するための努力では、ホストは、多くの場合、感染部位での栄養素の利用可能性を制限します。この制限は、細胞の代謝を調節する、調節因子が応答するための鍵代謝物の存在量を変えることができます。近年では、タンパク質やRNAの数は、病原性遺伝子発現の重要な調節因子として浮上しています。例えば、コーディタンパク質は、分枝鎖アミノ酸及びGTPのレベルに応答して、広く、低G + Cグラム陽性細菌で保存されています。 黄色ブドウ球菌のグローバルレギュレーターとして、コーディは、毒性の多数および代謝遺伝子の発現を制御します。私たちは、 黄色ブドウ球菌は、潜在的にホスト環境で遭遇栄養制限条件に適応するための努力でその代謝状態を変更するために、部分的には、コーディを使用すると仮定しました。この原稿は、質量分析と連結した液体クロマトグラフィーを用いて、 黄色ブドウ球菌からの代謝産物を抽出し、分析するための方法を記載していますtrometry、この仮説をテストするために開発されたプロトコル。この方法はまた、このような連続ケモスタット培養を使用することなく、生物学的に定常状態と一定の通気を維持するなど厳しさと再現性を確保するベストプラクティスを、強調しています。 USA200メチシリン感受性黄色ブドウ球菌に対してはUAMS-1親株を分離、同質遺伝子コーディ変異体は、（（ 例えば 、スレオニンおよびイソロイシン）アスパラギン酸に由来するアミノ酸の有意な増加を示し、それらの前駆体の減少、例えば 、アスパラギン酸およびO -acetylhomoserine ）。これらの知見は、RNA配列解析で得られた転写データとよく相関：これらの経路における遺伝子は、 コーディヌル変異体に10〜800倍の間にアップレギュレートしました。トランスクリプトームとメタボロームのグローバルな分析を結合することは、環境または栄養ストレスに直面したとき細菌がPHYのに潜在的な洞察を提供し、彼らの代謝を変化させる方法を明らかにすることができます栄養素の欠乏に関連したiological変化は、感染の間に経験しました。そのような発見は、新規な抗感染薬および治療薬の開発のための道を開くことができます。

私たちは、豊かな、複雑な培地中でのin vitro成長中の黄色ブドウ球菌における細胞内代謝物プールを分析しました。原理の証明として、我々は比較メチシリン感受性黄色ブドウ球菌骨髄炎の間の代謝産物プロファイルはUAMS-1（野生型[WT]）及びグローバル転写調節コーディ（Δ コーディ ）26を欠く同系株を単離します。プロ?...

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

ここでは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を介して、 黄色ブドウ球菌およびそれらのその後の分析からの代謝産物を抽出するためのプロトコルを記載します。

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

a-tandem-liquid-chromatographymass-spectrometry-based-approach-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K ビュー.  Georgetown University. ここでは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を介して、 黄色ブドウ球菌およびそれらのその後の分析からの代謝産物を抽出するためのプロトコルを記載します。 

ビデオ: A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

生化学

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

酵素的に活性G4 Resolvase1の精製のためのG-四重鎖DNA親和性のアプローチ

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

微生物タンパク質および特殊代謝産物データの分析にオープンソースのMALDI TOF-MS IDBacパイプラインを使用

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management of product yield and quality. Metabolomics data provides a read-out of these interactions at a given moment in time and is informative of an organism&#39;s biochemical status. Further, individual metabolites or panels of metabolites can be used as precise biomarkers for yield and quality prediction and management. The plant metabolome is predicted to contain thousands of small molecules with varied physicochemical properties that provide an opportunity for a biochemical insight into physiological traits and biomarker discovery. To exploit this, a key aim for metabolomics researchers is to capture as much of the physicochemical diversity as possible within a single analysis. Here we present a liquid chromatography-mass spectrometry-based untargeted metabolomics method for the analysis of field-grown wheat grain. The method uses the liquid chromatograph quaternary solvent manager to introduce a third mobile phase and combines a traditional reversed-phase gradient with a lipid-amenable gradient. Grain preparation, metabolite extraction, instrumental analysis and data processing workflows are described in detail. Good mass accuracy and signal reproducibility were observed, and the method yielded approximately 500 biologically relevant features per ionization mode. Further, significantly different metabolite and lipid feature signals between wheat varieties were determined.

A method for the untargeted analysis of wheat grain metabolites and lipids is presented. The protocol includes an acetonitrile metabolite extraction method and reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry methodology, with acquisition in positive and negative electrospray ionization modes.

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...