Name: recombinant protein expression, crystallization, and biophysical studies of a bacillus-conserved nucleotide pyrophosphorylase, bcmazg
Uploaded: 2017-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG at JoVE.com

X-ışını kırınımı veri setleri, Pohang Hızlandırıcı Laboratuvarının (Kore) kiriş çizgisi 7A&#39;da toplandı. Bu çalışma, Bilim Bakanlığı, BİT ve Gelecek Planlama (2015R1A1A01057574 - MH) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla uygulanan Temel Bilim Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

1.RBC1531&#39;in Rekombinant Protein Üretimi ve Saflaştırılması <ol><li> Bir rekombinant BC1531 proteini (rBC1531) ekspresyon plazmidinin hazırlanması <ol><li> B. cereus&#39;un genomik DNA&#39;sını hazırlayın 10 . </li><li> Sırasıyla Bam HI ve Sal I kısıtlama enzimi siteleri oluşturmak için ileri ve geri primerler (Bkz. Malzeme Listesi) kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile B. cereus genomik DNA şablonundan bc1531 genini yükseltin 10 . </li><li> PCR ürününü ve değiştirilmiş bir pET49b vektörünü (pET49bm) Bam HI ve Sal I kullanarak tanımlayın ( 11) . </li><li> Söndürülen PCR ürününü ve vektörünü (adım 3&#39;te tarif edildiği gibi) bir 10 uL reaksiyonda T4 DNA ligaz kullanarak 1.1.3 adımından karıştırın. 18 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> 50 μL kimya içine ligasyon reaksiyonu 3 mcL pipetleyinYetkili E. coli DH5α hücrelerini bir tüp içinde tutun. Pipetleme yaparak yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. 42 ° C&#39;de 45 sn ısı şoku. 1 mL Luria-Bertani (LB) ortamı ekleyin ve kuvvetli çalkantılar yaparken hücreleri büyütünüz (250 rpm, 37 ° C, 45 dak.). </li><li> Adım 1.1.6&#39;dan 100 μL dönüştürülmüş hücreleri alın ve bunları 100 μg / mL kanamisin (Kan) ile LB-agar plakalarına yayın. ~ 18 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Steril bir uç kullanarak koloniler seçin ve 100 μg / mL Kan ile 3 mL LB ortamında hücreleri büyütün; Çalkalayın (250 rpm, 37 ° C, 18 saat). </li><li> Plazmid DNA&#39;yı, açıklandığı gibi bir alkalin-SDS liziz yöntemi kullanarak hazırlayın. </li><li> DNA dizilemesi kullanılarak rBC1531-ekspresyon yapısının nükleotid dizisini doğrulayın 12 . </li></ol></li><li> RBC1531 proteinin aşırı ekspresyonu <ol><li> E. coli BL21 (DE3) suşunu rBC1531-exp ile yeniden transforme edinAşırı ekspresyon için aşamalar 1.1.5-1.1.6&#39;da tarif edildiği gibi hazırlama plazmiti. </li><li> Bir koloni seçin ve 50 μg / mL Kan (LB + Kan) içeren 10 mL LB ortamında büyütün; 37 ° C&#39;de 18 saat şiddetle çalkalayın. </li><li> 1 L LB + Kan ortamında gece boyunca 10 mL kültür inoküle edin ve OD 600 (600 nm&#39;de optik yoğunluk) ~ 0.7&#39;ye ulaşıncaya kadar 37 ° C&#39;de büyütün. </li><li> Sıcaklığı 18 ° C&#39;ye soğutmak için ~ 15 dakika boyunca buz soğuk suda kültür batırın ve rekombinant protein ekspresyonu için 1 mM nihai konsantrasyonda kültür izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin. Kültürü 18 ° C&#39;de ek bir 16-18 saat daha büyütün. </li></ol></li><li> RBC1531&#39;in saflaştırılması <ol><li> Hücreleri santrifüjle (5,000 xg, 4 ° C, 30 dakika) hasat edin. Hücreleri rahatsız etmeyecek şekilde süpernatanı dikkatle atın. Hücreleri, 10 mM imidazol içeren 50 mL fosfat tamponlu salin (PBS) solüsyonunda yeniden süspanse edin. </li><li> Hücre lizatlarının fazla ısınmasını önlemek için (saat: 2 dak. 30 s; devir sayısı: 5 s; devreden çıkma: 10 s; genlik:% 38), buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri iki kez lize edin. </li><li> Santrifüjleme (~ 25.000 xg, 4 ° C, 30 dakika) ile hücre lisatını boşaltın. </li><li> Dengelenmiş nikel boncuklarını 2,5 x 10 cm&#39;lik bir cam kromatografi kolonuna yerleştirmek için, 3 mL nikel boncukları ve 10 mM imidazol ve yerçekimi akışı içeren 60 mL PBS&#39;yi ekstra tamponla karıştırın. </li><li> Süpernatantı adım 1.3.3&#39;ten önceden dengelenmiş nikel boncukları olan kolona aktarmak için pipet ve düşük devirde (~ 20 rpm) bir eğirme tekerleğinde 2 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Süpernatanın yerçekimi ile boşaltılmasına izin verin ve kolondaki nikel boncuklarını 10 mM imidazol ihtiva eden 100 mL PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> 250 mM imidazol içeren 4 x 5 mL PBS uygulayarak rBC1531 proteini elute edin. </li><li> Adım 1.3.7&#39;den 15 uL elüsyon alın ve% 15 SDS-PAGE&#39;de çalıştırın. Üzerinde protein bantları görselleştirmekCoomassie mavisi boyama 10 kullanarak jel. </li></ol></li><li> RBC1531 proteinin afinite etiketlerinin trombin proteoliziyle giderilmesi <ol><li> Fraksiyonları diyaliz tüpüne pipetleyin (molekül ağırlığı kesildi: 3 kDa) ve tüp, 4 L trombin bölünme-uyumlu tampon (20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl ve 1.5 mM β-merkaptoetanol) içeren bir beher içine yerleştirin. Gece boyunca 4 ° C&#39;de. </li><li> Kesirleri pipetleyin ve konik bir boruya aktarın. </li><li> 280 nm&#39;de absorbansı ölçün ve tarif edildiği gibi rBC1531 protein konsantrasyonunu hesaplayın 13 . </li><li> 0.5 mL&#39;lik bir tüpte 50 μg rBC1531 alın ve çeşitli miktarlarda trombin ekleyin ( yani 2, 1, 0.6 ve 0.3 birim). N-terminal afinite etiketini parçalamak için gereken en düşük trombin miktarını belirlemek için rBC1531 ve trombin reaksiyonlarını 20 ° C&#39;de ~ 3 saat inkübe edin. </li><li> RBC1531 ve trombin reaksiyonlarını% 15SDS-PAGE ile yıkayın ve N-terminal afinite etiketini tamamen sindiren ve etiketsiz bir rBC1531 üreten en düşük trombin miktarını ( örn., 50 μg rBC1531 başına 0.3 ünite trombin) belirleyin. </li><li> 15 mL&#39;lik bir tüpe 10 mg rBC1531 proteini ve 60 ünite trombin ekleyin ve trombin-proteoliz reaksiyonu için ~ 3 saat boyunca 20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Açıklanan moleküler ağırlıkların ve elüsyon hacimlerinin standart bir eğrisini hazırlamak için jel filtreleme standartlarını boyut dışlama kromatografısi (SEC) sütununa uygulayın 13 . </li><li> Adım 1.4.6&#39;dan trombin ile sindirilmiş rBC1531 proteinini bir santrifüj filtresi tüpüne (molekül ağırlığı kesilmiş: 3 kDa) yerleştirin ve 5 mL&#39;den daha düşük bir hacme indirgemek için 3 ° C&#39;de 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Konsantre rBC1531 proteinini SEC sütununa uygulayın ve tüp başına 0.5 mL içinde elüsyona uğramış 60 fraksiyon toplamayın 13 . </li><li> Her fraksiyonun 15 μL&#39;ini alın, onları% 15&#39;lik bir SDS-PAGE üzerinde çalıştırın ve stai10&#39;da tarif edildiği gibi, Coomassie boyama çözeltisi (% 0.15 (v / v) Coomassie parlak mavi,% 40 (v / v) metanol ve% 10 (v / v) glasiyal asetik asit) kullanılarak jel. </li><li> RBC1531 içeren fraksiyonları pipetleyin ve bir tüpe toplayın. </li></ol></li></ol> 2. rBC1531&#39;in Kristalizasyon Tarama ve Optimizasyonu <ol><li> RBC1531 protein kristalleşmesi için tarama koşulları <ol><li> Adım 1.4.8&#39;de tarif edildiği gibi, rBC1531&#39;i, adım 1.4.11&#39;den ~ 18.5 mg / mL&#39;ye kadar bir santrifüj filtresi tüpü kullanarak konsantre hale getirin. </li><li> Her kristalleştirme tarama solüsyonundan 50 μL (bkz. Bölüm 2.2) 14 , 96-gözlü oturma-damla kristalizasyon plakalarının oyuklarına ilave edin. Oturan bir yatağa 0.5 uL 18.5 mg / mL rBC1531 protein solüsyonu yerleştirin. Protein solüsyonunu 0.5 mL&#39;lik iyi çözeltiyle karıştırın, plakanın tamamı için işlemi tekrarlayın. </li><li> Plakayı açık yapışkan filmle örtün.96 oyuklu plakaları 18 ° C&#39;ye yerleştirin ve buhar difüzyonuna izin verin. </li><li> 2-3 hafta boyunca günlük olarak kristal oluşumunu izlemek için hafif bir mikroskop kullanarak damlaları 20-40X büyütmede tarayın. </li><li> Elde edilen rBC1531 protein kristallerini kullanarak X-ışını kırınım verilerini 12 toplayın. </li></ol></li><li> RBC1531 kristalleşme koşullarının optimizasyonu <ol><li> Seçilen başlangıç ​​kristalleştirme koşul solüsyonundan ( örn., 0.1 M sodyum cacodylate, pH 6.5 ve 1.0 M sodyum sitrat) 500 mcL hazırlayın ve oturma damlası için 24 gözlü bir kristalleştirme plakasını doldurun. </li><li> Bir oturma yatağına 0.5 μL 18.5 mg / mL rBC1531 protein solüsyonu ilave edin, 0.5 mL&#39;lik iyi çözeltiyle karıştırın ve plakayı açık yapışkan filmle hemen örtün. Plakayı 18 ° C&#39;ye yerleştirin. </li><li> Haftalık bir mikroskop altında kristal büyümesine bir hafta boyunca dikkat edin. </li><li> PH değerini değiştirerek çeşitli kristalleşme koşullarını optimize edin ( örn., PH 5.5-6.8) ve sodyum sitratın tuz konsantrasyonunu ( yani, 0.9-1.2 M) değiştirerek tekil kristaller elde edildi. ~ 1 hafta boyunca kristal büyümesini izleyin ve X-ışını kırınım verileri toplamak 12 . </li></ol></li></ol> 3. rBC1531&#39;in Nükleozid Trifosfataz (NTPaz) Aktivitesinin Karakterizasyonu <ol><li> İnorganik fosfat bağımlı kolorimetrik çalışmanın doğrulanması <ol><li> Bir pirofosfat (100 mM) stokunu hazırlayın ve reaksiyon tamponunun 200 mcL&#39;sinde (20 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM) 0,1, 0.25, 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50, 100 ve 250 mcM nihai konsantrasyonlarına kadar sulandırın. MM NaCI ve 2 mM MgCl2) ile yıkandı. İlk plakayı bir kontrol olarak kullanın (bu pirofosfataz içermez). İkinci plakanın, adım 3.1.2&#39;de belirtildiği gibi, bir çalışma plakası olarak pirofosfataz içerdiğinden emin olun. </li><li> 0.01 birim Saccharomyces cerevisiae inorganik pYrophosphatase (1 μL) çalışma plakasının çukurlarına bırakın ve 20 ° C&#39;de 30-60 dakika inkübe edin. </li><li> Molibden asit çözeltisini, 7: 3 oranında amonyum molibdat (% 0.86 v / v) ve askorbik asit (% 14 v / v) çözeltileri ile karıştırarak hazırlayın. Çalışma ve kontrol kuyularına molibdat asit çözeltisi 16 uL ekleyin ve 15 dakika bekleyin. </li><li> Optik yoğunluğu 690 nm&#39;de (OD 690 nm) okuyun . </li></ol></li><li> Kolorimetrik NTPaz tahlili <ol><li> 100 mM nükleozid trifosfat (NTP) substrat stoğu hazırlayın ve 180 uL tahlil tamponu (20 mM HEPES, 100 mM NEP) içinde beklenen konsantrasyona ( örn., 0, 0.2, 4.4, 11, 22, 44, 88 veya 132 uM) PH 7.4; 150 mM NaCI ve 2 mM MgCl2). </li><li> Adım 3.2.1&#39;den 20 μg rBC1531 (1.5 mM) ve NTP substratları, 96 oyuklu bir plakada 200 μL&#39;ye kadar reaksiyona ekleyin ve iyice karıştırmak için pipetleyin. Plakayı kapağı ile kapatın ve 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre yerleştirin.Substrat hidrolizi reaksiyonu gerçekleştirmek için. </li><li> Plakayı 70 ° C su banyosuna aktarın ve rBC1531 aracılı katalitik reaksiyonları durdurmak için 15 dakika bekletin. </li><li> Reaksiyon plakasının her bir gözüne (adım 3.2.3&#39;ten) 0,01 ünite S. cerevisiae inorganik pirofosfataz (1 uL) ilave edin ve 20 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. Rengi (~ 15 dakika) geliştirmek için reaksiyon plakasına molibdat asit çözeltisi 16 uL ekleyin. OD 690nm&#39;de okuyun. </li><li> Michaelis-Menten denklemini kullanarak tarif edildiği gibi analiz edin 12 . </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ivanova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+Bacillus+cereus+and+comparative+analysis+with+Bacillus+anthracis.">Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis.</a> Nature. 423, 87-91 (2003).</li><li>Spencer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+anthracis.">Bacillus anthracis.</a> J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).</li><li>Deli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LmbE+proteins+from+Bacillus+cereus+are+de-N-acetylases+with+broad+substrate+specificity+and+are+highly+similar+to+proteins+in+Bacillus+anthracis.">LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis.</a> FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).</li><li>Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MazG+--+a+regulator+of+programmed+cell+death+in+Escherichia+coli.">MazG -- a regulator of programmed cell death in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).</li><li>Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=House+cleaning,+a+part+of+good+housekeeping.">House cleaning, a part of good housekeeping.</a> Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Escherichia+coli+MazG,+the+regulator+of+nutritional+stress+response.">Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response.</a> J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+dUTPases,+HisE,+and+MazG+belong+to+a+new+superfamily+of+all-alpha+NTP+pyrophosphohydrolases+with+potential+&amp;#34;house-cleaning&amp;#34;+functions.">Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential &amp;#34;house-cleaning&amp;#34; functions.</a> J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).</li><li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+house-cleaning+enzyme+encoded+within+an+integron+array:+1.8+A+crystal+structure+defines+a+new+MazG+subtype.">A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype.</a> Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+complex+of+Campylobacter+jejuni+dUTPase+with+substrate+analogue+sheds+light+on+the+mechanism+and+suggests+the+&amp;#34;basic+module&amp;#34;+for+dimeric+d(C/U)TPases.">The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the &amp;#34;basic module&amp;#34; for dimeric d(C/U)TPases.</a> J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, (2012).</li><li>Brown, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene cloning an introduction. , (1986).</li><li>Kim, M. I., Hong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+Bacillus-conserved+MazG+protein,+a+nucleotide+pyrophosphohydrolase.">Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).</li><li>Sheehan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical biochemistry: Principles and applications. , (2009).</li><li>Lesley, S. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+crystallization+at+the+joint+center+for+structural+genomics.">Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics.</a> J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).</li><li>Jeon, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+biochemical+characterization+of+bacterial+YpgQ+protein+reveals+a+metal-dependent+nucleotide+pyrophosphohydrolase.">Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase.</a> J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr...

Rekombinant protein ekspresyonu, sınırlı protein miktarı ve zararlı kontaminasyon gibi doğal protein kaynaklarıyla ilişkili problemlerin üstesinden gelmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, patojenik genler ve protein araştırmalarında ilave güvenlik önlemleri gerektirmeyen alternatif bir laboratuvar suşu kullanılabilir. Örneğin, Bacillus cereus , yakın evrimsel ilişkileri nedeniyle Bacillus anthracis&#39;i incelemek için faydalı bir modeldir 1 . B. anthracis , insanlarda ve hayvanlarda ölümcül inhalasyon şarbonuna neden olan zorunlu bir patojendir ve potansiyel olarak bir biyolojik silah olarak kullanılabilir 2 . Dolayısıyla, B. anthracis ile ilgili laboratuvar çalışmaları, ABD Hastalık Kontrol Merkezleri tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir ve laboratuar alanının negatif oda basıncıyla ayrılması zorunluluğu getiren biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL-3) uygulamaları gerektirir. B. anthracis&#39;in aksine </eM&gt;, B. cereus bir BSL-1 ajan olarak kategorize edilir ve bu nedenle en az güvenlik kaygısı vardır. B. cereus , enfeksiyon sırasında gıda zehirlenmesine neden olan ve tıbbi yardım almadan tedavi edilebilen, fırsatçı bir patojendir. Bununla birlikte, B. cereus B. anthracis ile birçok kritik geni paylaştığı için, B. anthracis proteinlerinin fonksiyonları B. cereus 1&#39;in ilgili homologları kullanılarak incelenebilir. B. anthracis&#39;in ba1554 - ba1558 gen kümesi, bc1531 - bc1535 kümesi ile oldukça korunmuştur B. cereus&#39;un yanı sıra Bacillus thuringiensis&#39;in bt1364-bt1368 kümesiyle , gen organizasyonu ve sekansı açısından. Dahası, ilgili kümelerin ilk genleri ( ba1554 , bc1531 ve bt1364 ) tamamen korunmuştur ( yani, % 100 nükleotid sekansı özdeşliği)Bacillus türündeki gen ürününün kritik bir rolü. Bu gen kümelerindeki konumu nedeniyle ba1554 , varsayılan bir transkripsiyon regülatörü 3 olarak yanlış tanımlandı. Bununla birlikte, ba1554 ürününün amino asit sekansı analizi, nükleotid pirofosfohidrolaz aktivitesine sahip olan ve transkripsiyon faktörü aktivitesi 4 , 5 ile ilişkili olmayan MazG ailesine ait olduğunu gösterir. MazG ailesine ait proteinler genel dizi ve uzunluk bakımından çeşitlilik göstermesine rağmen, bir EXXE 12-28 EXXD motifiyle (&quot;X&quot; herhangi bir amino asit artığı anlamına gelir) karakterize edilen yaygın bir ~ 100 kalıntı MazG alanını paylaşırlar ve sayı X kalıntılarının sayısını belirtir). MazG alanı belli bir katalitik etkinliği her zaman doğrudan doğruya açıklamaz. Escherichia coli&#39;den bir MazG üyesi (EcMazG), iki MazG alanına sahiptir, ancakC-terminal MazG alanı enzimatik olarak aktif 6 . Dahası, MazG enzimlerinin substrat özgüllüğü spesifik olmayan nükleozid trifosfatlardan (EcMazG için) belirli dCTP / dATP&#39;ye (integrin ile ilişkili MazG için) ve dUTP&#39;ye (dUTPazlar için) 6 , 7 , 8 , 9 arasında değişir. Bu nedenle, BA1554 proteininin biyofizyokimyasal analizleri, NTPaz etkinliğini teyit etmek ve substrat özgüllüğünü deşifre etmek için gereklidir. Burada, B. anthracis ba1554&#39;ün bir ortologu olan B. cereus bc1531 geninin protein ürününü moleküler düzeyde karakterize etmek için bir BSL-3 tesisi olmayan çoğu laboratuvarın izleyebileceği adım adım bir protokol sunuyoruz. Kısaca, rekombinant BC1531 (rBC1531), E. coli&#39;de eksprese edildi ve bir afınite etiketi kullanılarak arıtıldı. X-ışını kristalografik deneyleri için, kristalRBC1531 proteininin zation koşulları tarandı ve optimize edildi. RBC1531&#39;in enzimatik aktivitesini değerlendirmek için, geleneksel olarak kullanılan radyoaktif olarak işaretlenmiş nükleotidlerden kaçınmak için NTPaz etkinliği kolorimetrik olarak izlenmiştir. Son olarak, elde edilen biyofizikokimyasal verilerin analizi, rBC1531&#39;in oligomerleşme durumunu ve katalitik parametrelerini belirlememize ve rBC1531 kristalinden X-ışını kırınım verilerini elde etmemize olanak sağladı.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus cereus&lt;/em&gt; ATCC14579</td><td>Korean Collection for Tissue Culture</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>Genomic DNA prep kit</td><td>GeneAll</td><td>106-101</td><td>Genomic DNA preparation</td></tr><tr><td>Forward primer</td><td>Macrogen</td><td>GAAGGATCCGGAAGCAAAAA&lt;br/&gt; CGATGAAAGATATGCA</td><td>&lt;em&gt;Bam&lt;/em&gt;HI site is underlined</td></tr><tr><td>Reverse primer</td><td>Macrogen</td><td>CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT&lt;br/&gt; CCCTCATCAATACGTG</td><td>&lt;em&gt;Sal&lt;/em&gt;I site is underlined</td></tr><tr><td>nPfu-Forte</td><td>Enzynomics</td><td>P410</td><td>PCR polymerase</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bam&lt;/em&gt;HI</td><td>Enzynomics</td><td>R003S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sal&lt;/em&gt;I</td><td>Enzynomics</td><td>R009S</td><td></td></tr><tr><td>pET49b expression vector</td><td>Novagen</td><td>71463</td><td>Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Enzynomics</td><td>M001S</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis memebrane</td><td>Thermofisher</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Dry block heater</td><td>JSR</td><td>JSBL-02T</td><td></td></tr><tr><td>LB broth (Luria-Bertani)</td><td>LPS solution</td><td>LB-05</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>LPS solution</td><td>KAN025</td><td></td></tr><tr><td>Mini-prep kit</td><td>Favorgen</td><td>FAPDE300</td><td>Plasmid DNA preparation</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent cell</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>50-213-378</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Daejung</td><td>7548-4100</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Daejung</td><td>6566-4405</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Bio Basic Inc</td><td>PB0445</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Sodium phosphate</td><td>Bio Basic Inc</td><td>S0404</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Bio Basic Inc</td><td>IB0277</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agaros</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Nickel bead</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Finepcr</td><td>AG</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE protein standard</td></tr><tr><td>Coonmassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP101-25</td><td>Coomassie staining solution</td></tr><tr><td>Methyl alcohol</td><td>Samchun chemical</td><td>M0585</td><td>Coomassie staining solution</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Daejung</td><td>1002-4105</td><td>Coomassie staining solution</td></tr><tr><td>Dialysis memebrane</td><td>Thermofisher</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Merckmillipore</td><td>605157-1KUCN</td><td>Prepare aliquots of 20 &amp;mu;L (1 Unit per &amp;mu;L) and store at 70 &amp;deg;C and thaw before use</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600</td><td>General Electric</td><td>28989335</td><td>Size exclusion chromatography</td></tr><tr><td>Gel filtration standard</td><td>Bio-rad</td><td>151-1901</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal filter</td><td>Amicon</td><td>UFC800396</td><td></td></tr><tr><td>Crystralization plates</td><td>Hampton research</td><td>HR3-083</td><td>96-well sitting drop plate</td></tr><tr><td>The JCSG core suite I-IV</td><td>Qiagen</td><td>130924-130927</td><td>Crystallization secreening solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Cryschem plates</td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td><td>24-well sitting drop plate</td></tr><tr><td>Inorganic pyrophosphatase</td><td>Sigma</td><td>10108987001</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium molybdate solution</td><td>Sigma</td><td>13106-76-8</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>NTP substrate</td><td>Startagene</td><td>200415-51</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biotek</td><td>SynergyH1</td><td>microplate reader</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>Prism 5 for Window</td><td></td></tr></tbody></table>

recombinant protein expression, crystallization, and biophysical studies of a bacillus-conserved nucleotide pyrophosphorylase, bcmazg

Gerçek patojenlerden genleri ve proteinleri incelerken emniyet kısıtlamalarını ve yönetmelikleri aşmak için bunların homologları incelenebilir. Bacillus anthracis ölümcül inhalasyon şarbonuna neden olan zorunlu bir patojendir. Bacillus cereus , yakın evrimsel ilişkisi nedeniyle B. anthracis&#39;i incelemek için faydalı bir model olarak düşünülür. B. anthracis&#39;in ba1554 - ba1558 gen kümesi B. cereus&#39;daki bc1531 - bc1535 kümesi ile Bacillus thuringiensis&#39;deki bt1364 - bt1368 kümesi ile yüksek oranda korunmuştur, bu da Bacillus cinsindeki ilişkili genlerin kritik rolünü göstermektedir. Bu el yazması, B. anthracis&#39;teki gen kümesinden birinci gen ( ba1554 ) &#39;ün bir protein ürününü B. cereus , bc1531&#39;deki ortologunun rekombinant bir proteinini kullanarak hazırlamak ve karakterize etmek için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır.

Bu çalışmada ilgilenilen proteinin karakterizasyonu, tercihen birkaç miligramdan daha fazla rekombinant B. cereus bc1531 (rBC1531) proteininin yeterli bir miktarının hazırlanmasıyla başlamıştır. BC1531 proteinini kodlayan DNA parçası, ba1554&#39;e özdeş ortolog genler içerdiği için B. cereus&#39;un genomik DNA&#39;sını şablon olarak kullanarak PCR ile hazırlandı . RBC1531, E. coli hücrelerinde çözünür bir protein olarak aş...

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG at JoVE.com

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis ölümcül inhalasyon şarbonunun zorunlu patojendir, bu nedenle genleri ve proteinleri üzerine yapılan çalışmalar kesinlikle düzenlenmiştir. Alternatif bir yaklaşım, ortolog genleri incelemektir. B. cereus , bc1531&#39;de B. antrasis ortologunun biyofizikokimyasal çalışmalarını, minimal deney ekipmanı gerektiren ve ciddi güvenlik endişeleri içermeyen çalışmalarını anlattık.

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları<em&gt; Bacillus</em&gt; - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

recombinant-protein-expression-crystallization-biophysical-studies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

7.5K Görüntüleme.  Yonsei University.  Bacillus anthracis ölümcül inhalasyon şarbonunun zorunlu patojendir, bu nedenle genleri ve proteinleri üzerine yapılan çalışmalar kesinlikle düzenlenmiştir. Alternatif bir yaklaşım, ortolog genleri incelemektir. B. cereus , bc1531'de B. antrasis ortologunun biyofizikokimyasal çalışmalarını, minimal deney ekipmanı gerektiren ve ciddi güvenlik endişeleri içermeyen çalışmalarını anlattık. 

Video: Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Biyokimya

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Biyoloji

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. PRMTs can either mono- or dimethylate arginine guanidino groups symmetrically or asymmetrically. The enzymology of these proteins is a complex and intensely investigated area that requires milligram quantities of high-quality recombinant protein. The baculovirus expression vector system (BEVS) employing Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insect cells has been used for expression screening and production of many PRMTs, including PRMT 1, 2, and 4 through 9. To simultaneously screen for the expression of multiple constructs of these proteins, including domains and truncated fragments as well as the full-length proteins, we have applied scalable methods utilizing adjustable and programmable multichannel pipettes, combined with 24- and 96-well plates and blocks. Overall, these method adjustments enabled a large-scale generation of bacmid DNA, recombinant viruses, and protein expression screening. Using culture vessels with a high-fill volume of Sf9 cell suspension helped to overcome space limitations in the production pipeline for single batch large-scale protein production. Here, we describe detailed protocols for the efficient and cost-effective expression of functional PRMTs for biochemical, biophysical, and structural studies.

The baculovirus expression vector system (BEVS) is a robust platform for expression screening and production of protein arginine methyltransferases (PRMTs) to be used for biochemical, biophysical, and structural studies. Milligram quantities of material can be produced for the majority of PRMTs and other proteins of interest requiring a eukaryotic expression platform.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Lipidik Bisellerde ABC Taşıyıcı Membran Proteinlerinin Kristalizasyonu

ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an aqueous environment is typically achieved by employing detergents. These detergents disintegrate the lipid bilayer and solubilize the proteins. The intrinsic habitat of membrane proteins within the lipid bilayer poses a challenge in maintaining their stability and uniformity in solution for structural characterization. Bicelles, which comprise a blend of long and short-chain phospholipids and detergents, replicate the natural lipid structure. The utilization of lipid bicelles and detergents serves as a suitable model system for obtaining high-quality diffraction crystals, specifically to determine the high-resolution structure of membrane proteins. Through these synthetic microenvironments, membrane proteins preserve their native conformation and functionality, facilitating the formation of three-dimensional crystals. In this approach, the detergent-solubilized heterodimeric ABCG5/G8 was reintegrated into DMPC/CHAPSO bicelles, supplemented with cholesterol. This setup was employed in the vapor diffusion experimental procedure for protein crystallization.

Yazar Spotlight: İlaç Geliştirmeyi İlerletmek için ABC Taşıyıcı Membran Proteinleri için Bir Bicelle Kristalizasyon Kurulumu 

This protocol describes a setup for the crystallization of the sterol transporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 is reconstituted into bicelles for hanging-drop crystallization. The protocol does not require specialized materials or substrates, making it accessible and easy to adapt in any laboratory for determining the protein structure through X-ray crystallography.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an ...

Çözünen Taşıyıcı Taşıyıcıların İfade Edilmesi ve Saflaştırılması için Stratejiler

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Yazar Spotlight: Kodon İçin Optimize Edilmiş Genler Kullanılarak İnsan Çözünen Taşıyıcı Taşıyıcılarının İfadesi ve Saflaştırılması 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması