Name: oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

Bu çalışma, Kore Ulusal Hükümet Başkanlığı (MSIP) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (2015R1A2A1A10052663 ve 2014M1A3A3A02034698 no&#39;lu) tarafından desteklenmiştir.

1. Güvenlik DİKKAT: Bu protokol AMPK aktivitesini değerlendirmek için [γ- 32 P] -ATP kullanır. Fosfor-32, büyük oranda beta radyasyon yayan bir radyoaktif izotoptur. Bir beta parçacık boyutu son derece küçük olduğu için, giyim ve deriye kolayca nüfuz edebilir. Hem beta hem de dışa maruz kalma, insan sağlığına zararlı olabilir; cilt yanıkları ve doku hasarına neden olabilir. <ol><li> Akrilik koruyucu gibi uygun koruma kullanılarak [γ- 32 P] -ATP&#39;nin kullanılmasını gerektiren tüm adımları uygulayın. </li><li> Tüm işlemler sırasında zararlı radyasyona maruz kalma durumunu izlemek için tüm personelin elektronik kişisel dozimetrelerle (EPD) donatılmış olduğundan emin olun. </li><li> Açık kaynaklı radyasyonu yalnızca uygun eğitim ve düzenleyici onayı aldıktan sonra kullanın. NOT: Buradaki tüm deneyler, Seul Ulusal Üniversitesi&#39;nde açık kaynak radyasyon kullanımı eğitimi tamamlandıktan sonra gerçekleştirildiErsity ve Kore hükümetinin onayı (nssc.go.kr/nssc/en). </li><li> Yerel yönetmeliklere göre radyoaktif atıkları imha edin. NOT: Burada, Seul Ulusal Üniversitesi Çevre Koruma ve Güvenlik Enstitüsünden direktifler takip edildi. Aşağıda ABD ve Avrupa ülkelerindeki düzenleyicilerin bir listesi bulunmaktadır: Birleşik Devletler, Birleşik Devletler Nükleer Düzenleme Komisyonu (http://www.nrc.gov/); Birleşik Krallık, Sağlık ve Güvenlik İcracı (SEÇ) (http://www.hse.gov.uk); Fransa, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); Ve Almanya, Çevre, Doğa Koruma, İnşaat ve Nükleer Güvenlik (BMU) Federal Bakanlığı (http://www.bmu.de). </li></ol> 2. In Vitro Rekabetçi Kinaz Testi <ol><li> Rekabetçi Peptitlerin İnşası <ol><li> AMPK ile fosforillenmiş konsensüs motifini belirleyin. NOT: AMPK, konsensüs motifini tanır,# 934 - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. Konsensüs dizisinde, Φ, hidrofobik amino asitleri ( yani, valin [V], lösin [L], metiyonin [M] ve izolösin [I] temsil eder ve β, bazik amino asidi temsil eder ( örn., Lisin [K], arginin [ R] ve histidin [H]) 1 . </li><li> Yukarıdaki konsensüs motifine uygun olarak hedef sekanslardan serin veya treonin kalıntılarını seçin. İnsan Nrf2&#39;sinin (Ser153 içeren # 1, 148-157; Ser335 içeren # 2, 330-339 ve Ser558 ihtiva eden # 3, 553-562) üç varsayılan alanı kullanın. </li><li> Tahmini siteleri taklit eden 10 kalıntı peptidi ticari olarak sentezleyin. Sentezlenen ürünü, her bir peptid için saflık derecesi% 98&#39;den fazla olan bir liyofilize toz olarak elde edin. </li><li> 71.667 g / L bir konsantrasyon elde etmek için bir kinaz tampon kullanarak peptidleri çözün. Bir peptid bir kinaz tamponunda çözünmezse,% 20 DMSO içinde çözünür. Çözünmez kalırsa, putı taklit eden bir peptidÇözünürlüğü artırmak için genişletilebilir. </li></ol></li></ol><ol start="2"><li> In Vitro Rekabetçi AMPK Kinaz Testi <ol><li> 5X kinaz tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın: 100 mM HEPES, pH 7.4; 25 mM MgCI2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-gliserofosfat (serin / treonin fosfataz inhibitörü); 5 mM Na3VO4 (tirozin fosfataz inhibitörü); % 0.5 (h / h) Proteaz İnhibitörü Kokteyl Seti III, 1 mM soğuk ATP; Ve 500 uM AMP. NOT: AMP, AMPK aktivitesini test etmek için kinaz tamponunun vazgeçilmez bir bileşenidir. Tampon, hem serin / treonin kinazları hem de tirozin kinazların aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. </li><li> Aşağıdaki rekombinant protein ve sentetik peptidleri buz üzerinde çözdürün: AMPK; Nrf2; Ve oligopeptid # 1, # 2 ve # 3&#39;ü içerir. </li><li> Buz üzerinde bir reaksiyon tamponu hazırlayın: 0.15 μg AMPK, 0.4 μg Nrf2 (~ 4 pmol), 0.43 mg oligopeptid (~ 300 nmol) ve 6 μL 5 x kinaz tamponu. birSteril damıtılmış su (DW) ile nihai hacmi 30 μL&#39;ye ayarlayın. NOT: Tepkime tamponunu hazırladıktan sonra [γ- 32 P] -ATP ilavesi, kinazın otofosforilasyonundan kaynaklanan radyoaktif sinyali azaltabilir. </li></ol></li><li> Reaktanları Çalıştırmak NOT: Aşağıdaki tüm işlemler, koruyucu bir akrilik kalkan, raf veya blok ile uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla yapılmalıdır. <ol><li> Denetime başlamadan önce ısıtma bloklarını 30 ° C&#39;ye ayarlayın. </li><li> Buz üzerinde reaksiyon tüplerine 1 uL [γ- 32 P] -ATP (1 uCi) ekleyin. Reaksiyon tamponunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. NOT: 32 P&#39;nin radyoaktivitesi, yaklaşık 14 gün 9 kısa bir yarılanma ömrüne sahiptir. Yarı ömrü göz önüne alarak hacmi ayarlayın ( örneğin, [γ- 32 P] -ATP&#39;nin üretiminden bir ay sonra, [γ- 32 P]1 μCi yapmak için -ATP). </li><li> Numuneyi 15-30 dakika boyunca 30 ° C&#39;de ısıtma bloğunda inkübe edin. Bu adım esnasında,% 7.5 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jelleri hazırlayın. Jel yüzdesini hedef proteinin boyutuna göre ayarlayın. </li><li> % 10 (v / v) gliserol,% 20 (ağ / hac) SDS,% 15.42 (ağ / hac) ditiyotreitol,% 90 (h / h) 0,5 M Tris-HC1 (pH 6.8) ve% 0.02 (w / v) bromofenol mavisi). Reaksiyon tamponunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. </li><li> Örnekleri% 7.5 SDS-PAGE jelinde 70 V&#39;de 20 dakika boyunca ve sürekli 140 V&#39;de 1 saat süreyle çalıştırın. NOT: Jelin sonundaki bromofenol mavi çizgisi, son derece yüksek radyoaktif sinyaller içerir. Arka plandaki sinyalleri azaltmak için bir sonraki adıma geçmeden önce meleğin altındaki jelin çıkarılması önerilir. </li><li> SDS-PAGE&#39;den sonra jöleyi casterdan hafifçe çıkarın. Jeli bir bardak içine yerleştirin.Bir sonraki adıma. </li><li> Jel fiksasyon tamponu ile 20 dakika sabitleyin (% 50 metanol ve% 10 buzlu asetik asit). </li><li> Jeli hafifçe filtre kağıdının üzerine alın ve şeffaf bir sargı ile örtün. Bu aşamada jelin kolayca yırtılabileceğini unutmayın. Jel bir vakumlu jel kurutucu ile 1 saat boyunca 80 ° C&#39;de kurutulur. </li></ol></li><li> görüntüleme <ol><li> Jel, gece boyunca (genellikle yaklaşık 16 saat boyunca) bir fosforlu elek veya bir X ışını filmi ile açıklayın. NOT: Ekstra parlak ışığa maruz kaldıktan sonra fosforlu bir elek kullanılabilir. Bir röntgen filmi kullanıldığında, iki gün içinde jel ortaya koyun. X-ışını filmleri, fosforlu ekranlardan daha düşük hassasiyete sahiptir. </li><li> Fosfor ekranını bir fosforlu görüntüleyiciyle tarayın. Görüntüyü yüksek çözünürlüklü bir TIFF veya bitmap dosyası olarak dışa aktarın. </li><li> Görüntülemeden sonra, jel Coomassie parlak mavi (CBB) boyama için bir cam veya plastik kap taşımak. </li><li> Jeli DW ile yıkayın. DW&#39;yi atın ve lekeBoyama reaktifi ile 1 saat j el ile jel edin. </li><li> Reaktifi atın ve 1 saat boyunca veya gece boyunca DW ile jelleştirin. Bir ofis tarayıcısı ile taramak için jel şeffaf plastik filmlerin (veya eşdeğeri) arasına yerleştirilir. </li></ol></li></ol> 3. Bir Siteye Özgü Mutant Kullanan İn Vitro Kinaz Testi <ol><li> PGEX-Nrf2&#39;nin Alan Yönelimli Mutagenezi <ol><li> Mutajenik Astar Tasarımı NOT: Uygun mutajenik primerler tasarlamak, mutajenezin başarılı bir sonucu için kritik önem taşır. Mutajenik primerler tasarlamak için bazı hususlar aşağıda belirtilmiştir. Astarın ortasında arzu edilen mutasyonla 25 ila 45 baz içeren bir astar oluşturun. Primer% 40-60 GC içeriğine sahip olmalı ve bir veya daha fazla G veya C bazıyla sonlandırılmalıdır. [T m = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / bazların uzunluğu) -% uyumsuzluk] formülüne göre primerin Tm değerinin 78 ° C veya daha yüksek olmasına dikkat edin. NOT:Çünkü saflık mutasyon verimliliği için önemlidir. Mutajenik primerler tasarlamak için birkaç web sitesi bulunmaktadır. <ol><li> &quot;Alana yönelik mutajenez için primerler tasarlamak&quot; için primer tasarım programını açın (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp). </li><li> İnsan Nrf2 DNA dizisini yapıştırın (Erişim No. NM_006164.4) ve &quot;çevrilmiş karşıya yükle&quot; düğmesini seçin. </li><li> Alanin olarak değiştirilmek üzere çevrilmiş amino asit dizisinden serin 558 kalıntısını seçin. Mutagenik primeri kullanarak alanin için agc&#39;dan gcc&#39;ye serin için kodonu değiştirin. </li><li> Primer uzunluğu, T m ve GC içeriğini düşünün. NOT: Mutajenik primer sonunda 5&#39;-ctactgaaaaaacactacgcc accttatatctcgaag-3 &#39;olarak tasarlanır. </li></ol></li><li> Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanılarak Mutant İplikçik Sentezi için Reaksiyon <ol><li> PCR reaksiyon karışımının buz üzerinde hazırlanması: 10 x reaksiyon tamponu, 50 ngPGEX-GST-Nrf2, 125 ng ileri primer, 125 ng ters primer, 1 uL dNTP karışımı (her biri 10 mM), 2.5 U Pfu DNA polimeraz ve 50 uL&#39;ye kadar steril DW. </li><li> Aşağıdaki bisiklet programı ile pGEX-GST-Nrf2-mutant iplikçik sentezi için PCR&#39;ı çalıştırın: 95 ° C&#39;de 30 saniye süreyle 1 devir; 95 ° C&#39;de 30 saniye, 55 ° C&#39;de 1 dakika ve 68 ° C&#39;de 90 saniye boyunca 18 döngü; Ve 1 çevrim 68 ° C&#39;de 5 dakika süreyle. NOT: Plazmid uzunluğuna bağlı olarak, döngü parametreleri değiştirilebilir. </li><li> Bir sonraki adım için reaktifleri soğutmak için 2 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. Alternatif olarak, gece boyunca 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Dpn I Sindirimi ve Bir Mutant Plasmid Seçimi <ol><li> Soğutmadan sonra her bir reaktana 1 uL Dpn I sınır enzimi (10 U / μL) ekleyin. 1 dakika pipetle ve santrifüjle iyice karıştırın. </li><li> Ebeveyn pGEX-GST-Nrf2 çift sindirimi için 37 ° C&#39;de 2 saat inkübe edin,Telli DNA. </li><li> Buz üzerinde DH5 α supercompetent hücreleri yavaşça çözülür. </li><li> Önceden soğutulmuş DH5α supercompetent hücrelerin 150 ul 50 μL reaktan ekleyin ve buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin. </li><li> Tüpleri 42 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğuna aktarın ve 90 saniye boyunca bırakın. 2 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. </li><li> Dönüştürülmüş DH5 α hücrelerine önceden ısıtılmış lizojen besiyeri (LB) ekleyin ve 180 rpm&#39;de çalkalama ile 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Dönüştürülen hücreleri LB-ampisilin agar plakalarına yayın ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: Amfisilin, GEX-GST-Nrf2 plasmidinin ampisilin direnci işaretçisine sahip olması nedeniyle seçim için kullanılır. Mutajenize tâbi tutulan plazmitin direnç markörüne bağlı olarak uygun antibiyotikleri kullanın. </li><li> Plakadan tek bir koloni seçin, 5 mL LB-ampisiline aktarın ve gece boyunca 180 rpm&#39;de çalkalayarak 37 ° C&#39;de inkübe edin.Mutajenik dizinin doğrulanması için en az üç koloniyi değerlendirin. </li><li> DNA dizi analizi için bir DNA miniprep kiti kullanarak DNA ekstrakte edin; Üreticinin protokolünü izleyin. </li><li> Üreticinin protokolüne göre otomatik DNA sekans analizörü kullanarak mutajenik DNA sekanslarını doğrulayın. Mutant dizilerin doğrulanması için DNA yapısının en az 200 ng&#39;ı kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> Rekombinan GST-Nrf2 Proteininin Saflaştırılması <ol><li> Escherichia coli&#39;sinde mutajenik GST-Nrf2 Füzyon Proteininin Ekspresyonu <ol><li> Mutajenik pGEX-GST-Nrf2 plasmidini BL21 hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloni, ampisilin (100 μg / mL) içeren 25 mL LB suyunda inoküle edin ve 37 ° C&#39;de rotatorda gece boyunca inkübe edin. </li><li> Kültürlenen hücreleri 1: 100 seyreltme oranında ampisilin (100 ug / mL) içeren 100 mL LB suyu içerisinde inoküle edin. </li><li> 37 ° C&#39;de bir rotatta inkübe edinVeya 600 nm&#39;de absorbans yaklaşık 0.4-0.8 (yaklaşık 4 saat) ulaşana kadar. </li><li> 1 mM IPTG&#39;nin nihai konsantrasyonunu hazırlamak için 100 mL kültürlenmiş hücrelere 100 uL 1 M IPTG ekleyin. </li><li> Hücreleri, protein ekspresyonu için 6 saat veya gece boyunca rotatorda 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 20 dakika süreyle 5,000 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin ve 1 mL bakteri liziz tamponu (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT,% 0.1 CHAPS, 1 μg / mL pepstatin, 0.5 μg / mL leupeptin) ile hücre peletini tekrar süspanse edin, Ve 1 mM PMSF) eklendi. </li><li> Hücre pelletlerini, maksimum güç çıkışının% 50&#39;sinde 2 dakika aralıklarla bir ultrasonik homojenleştirici kullanarak lize edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın. </li></ol></li><li> Rekombinant GST-Nrf2 Proteininin Saflaştırılması <ol><li> 200 ul% 50 (v / v) glutatyon agaroz boncuk hazırlayın ve 1 mL PBS (pH 7.3; 140 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2 </sUb&gt; HPO 4 ve 1.8 mM KH2PO4). Boncukları, 500 × g&#39;de 1 dakika süreyle santrifüje ederek toplayın. Yıkama adımını ç kez tekrarlayın. </li><li> % 50 (v / v) glutatyon-agaroz boncuklar hazırlanmış 200 mcL hücre lizatı ekleyin ve 2 saat boyunca bir uç uca rotator 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüj ederek GST-Nrf2 proteini ile kombine edilen glutatyon-agaroz boncuklarını toplayın. Süpernatantı 1 ml&#39;lik bir şırınga kullanarak 31 G&#39;lik bir iğne ile çıkarın. </li><li> Adım 1&#39;de olduğu gibi, boncukları 1 mL PBS (pH 7.3) ile yıkayın. </li><li> GST-Nrf2 ile kombine glutatyon-agaroz boncuklara 500 uL elüsyon tamponu (50 mM Tris-HC1 ve 10 mM indirgenmiş glutatyon, pH 8.0) ilave edin. 30 dakika boyunca uç uca bir rotatörde 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 dakika süreyle 500 xg&#39;de santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın. </li><li> Yine boncuklara 300 uL elüsyon tamponu ilave edin ve 3.2.2.5-3.2.2.6 adımlarını iki kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> Saflaştırılmış GST-Nrf2 Proteinin Doğrulanması <ol><li> 0.5 μg standart protein BSA ile protein miktarının görselleştirilmesi için numunenin 5 μL&#39;sini hazırlayın. </li><li> Örnekleri% 7.5 SDS-PAGE jelinde 70 V&#39;de 20 dakika çalıştırın ve sonra 140 V&#39;da 60 dakika süreyle çalıştırın. </li><li> Jel, 2 saat süreyle% 0.1 CBB boyama çözeltisi (0.1 g CBB R250, 40 mL% 99 metanol, 10 mL buzlu asetik asit ve 50 mL damıtılmış H20) ile leke ve destain (30 mL metanol, 10 mL buzlu asetik asit ve 60 mL damıtılmış H20), bantlar açıkça gösterilene kadar. </li><li> Kusurlu jeli filtre kağıdına yerleştirin ve şeffaf bir sargı ile örtün. Jel bir vakumlu jel kurutucu ile 1 saat boyunca 80 ° C&#39;de kurutulur. </li><li> In vitro AMPK kinaz tahlili için dansitometre ile mutant GST-Nrf2 proteininin miktarını belirleyin. </li></ol></li></ol></li><li> Siteye Özgü Mutant İle In Vitro AMPK Aktivite Testi DEĞİLE: İn vitro AMPK kinaz tahlili, peptid inhibitörleri olmadan 0.4 mikrogram saflaştırılmış vahşi tip GST-Nrf2 veya GST-Nrf2-S558A mutant kullanılarak adım 2.2-2.4&#39;e göre gerçekleştirilir. 1. adımda açıklanan tüm radyasyon güvenlik yönergelerini uygulayın. <ol><li> 0.15 μg AMPK, 0.4 mikrogram mutant veya vahşi GST-Nrf2 ve 6 uL 5 kinaz tamponu ile buz üzerinde bir reaksiyon tamponu hazırlayın. Steril DW ile 30 mcL&#39;ye kadar doldurun. </li><li> Buz üzerindeki reaksiyon tüplerine 1 uL [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) ekleyin. Reaksiyon tamponunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve santrifüjleyin. </li><li> Numuneleri 30 ° C&#39;de 30 dakika ısıtma bloğunda inkübe edin. </li><li> 3 μL 10 x SDS numune tamponu ilave ederek kinaz reaksiyonunu durdurun. </li><li> % 7.5 SDS-PAGE jelinde 70 V&#39;de 20 dakika ve daha sonra 140 V&#39;de 1 saat çalıştırın. </li><li> Jel sabitleme tamponuyla 20 dakika sabitleyin, filtre kağıdına taşıyın ve jel şeffaf ile örtünSarıcı. </li><li> Jel vakum jel kurutucusu ile 80 ° C&#39;de 1 saat kurutulur ve daha sonra gece boyunca fosforlu bir elek veya bir röntgen filmine maruz bırakılır. </li><li> Bir fosforlu görüntüleyiciyle fosfor taramasını tarayın ve adım 2.4&#39;e göre görselleştirmeden sonra CBB boyaması için jeli bir cam tüpe taşıyın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs.">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li><li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint.">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li><li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription.">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li><li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance.">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li><li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2.">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li><li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry:+myths,+facts,+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements.">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li><li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites:+a+quick+guide+for+cell+biologists.">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li><li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550.">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li><li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-lives+of+some+radioactive+isotopes.">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365 (1951).</li><li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1.">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li><li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

AMPK&#39;nın aracılık ettiği tahmini fosforilasyon mevkilerinin özgünlüğünü değerlendirmenin basit ve kullanışlı bir yolu olarak, burada, rekabetçi peptidleri kullanarak belirli bir fosforilasyon bölgesini keşfetmek ve bir bölgeye özgü mutant kullanarak doğrulamak için kullanılabilecek bir in vitro kinaz tahlilini açıklamaktayız . In vitro rekabetçi AMPK aktivite tahlilinden elde edilen temsili veriler, bir bölgeye yönlendirilmiş mutant protein kullanılarak bir deneyin so...

Belirli bir tortuda protein fosforilasyonu çok çeşitli hücresel süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, sinyalleme ağlarının anlaşılması, spesifik fosforilasyon sahalarının tanımlanmasını gerektirir. Buna ek olarak, fosforilasyon bölgesi protein işlevindeki etkiyi belirler, çünkü bir proteindeki tekli alanlar farklı yapılara ve işlevlere sahiptir. Anahtar bir antioksidan transkripsiyon faktörü olan nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2 (Nrf2) aktivitesi, farklı bölgelerdeki fosforilasyon yoluyla iki yönlü olarak düzenlenir. Çalışmalarımız, Nrf2&#39;nin fosforilasyonunu katalizleyen kinazlara odaklanmıştır. Nrf2&#39;nin oksidatif meydan okumaya karşı stres tepkisi, esas olarak serin 40&#39;da fosforilasyon yoluyla ve Nrf2 3 , 4&#39;ü aktive eden protein kinaz C (PKC) -8 aracılığında hızlı bir şekilde oluşur. Tersine, Fyn, Tirozin 5&#39;de Nrf2&#39;nin inhibe edici fosforilasyonunu katalize ederAktivitenin sıkı kontrolü için 68. Fosforilasyon bölgelerini keşfetmek için kullanılan en yaygın yöntem sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi (LC / MS) analizidir. Hızlı ve son derece hassas fosforilasyon sitesi haritalama verileri bu şekilde oluşturulabilir; Bununla birlikte, sıklıkla yanlış negatif sinyaller üreten birkaç teknik sınırlama vardır. Zayıf dizi kapsamı sıklıkla LC / MS analizinde meydana gelir. Fosforilasyon bölgelerini belirlemek için, bir proteinin maksimum amino asit kapsamı hakkında bilgi gereklidir 6 . Sindirim basamağı boyunca ilgi çekici proteinin birkaç proteazla proteolizi, sekans kapsamının iyileştirilmesinde yardımcı olabilir. Fosforilasyon kalıntılarının belirlenmesinin bir başka engeli, serin ve treonin fosforile peptitler 6 , 7 için sıklıkla gözlemlenen kolay fosforik asit kaybıdır. Labil fosfat kısımları genellikleParçalanma işlemi sırasında fosfopeptidlerden salınır 7 . Fosforilasyon bölgeleri ararken ikinci seçenek, bir peptid mikrodizisi metodu kullanmaktadır. İlgi konusu bir proteinden türetilen peptid fragmanlarını içeren bir mikro-dizi çipi kullanarak kinaz hedef bölgeleri için tarama yapmak mümkündür. Bununla birlikte, mikroarray çipinin üretilmesi ve algılanması için ekipman gereksinimi nedeniyle, peptid mikrodizisi metodu zaman alıcı ve pahalıdır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bilinen tanıma motifleri olan bir protein kinazı için bir in vitro oligopeptit-rekabet kinaz testi kullanılabilir. Bir kinazın konsensüs tanıma motifi oluşturulursa, aday bir substratın varsayılan fosforilasyon bölgeleri tahmin edilebilir ve sitelerin orijinalliği doğrulanabilir. Bu işlem için en ikna edici yöntem, bir mutant proteinde fosforilasyonun kaldırılmasını göstermektir; burada predicteD kalıntısı, fosforile edilemeyen bir amino asitle ( yani, alanin için serin ya da treonin, tirosinden fenilalanine) ikame edilir. Bununla birlikte, mutant proteinlerin üretimi ve izolasyonu zaman alıcıdır. Araştırmanın ilk aşamasında alternatif olarak, rekabetçi peptit kinaz tahlili basit ve kullanışlıdır. Burada, bir in vitro peptit rekabet testi için ve fosforilasyon bölgesinin doğrulamasına ilişkin bir protokolü açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Calbiochem, Nottingham, UK</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>AMPK</td><td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td><td>14-840</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2 (WT)</td><td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td><td>H00004780-P01</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]-ATP</td><td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td><td>NEG502A</td><td></td></tr><tr><td>EZblue staining reagent</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Pfu turbo DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>600250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>200415-51</td><td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td><td>L1704</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td><td>32034</td><td></td></tr><tr><td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td><td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td><td>QDF100</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td><td>BSA100</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid glacial</td><td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methyl alcohol&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td><td>Daejung Chemicals &amp;amp; Metals, Siheung, South Korea</td><td>5558-4410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>28-9558-09</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-178</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-1746</td><td></td></tr><tr><td>Dancing shaker</td><td>FINEPCR, Seoul, Korea</td><td>CR300</td><td>The machine is needed for washing step</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Incubator/shakers</td><td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td><td>NB-205L</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuges</td><td>LABOGENE, Seoul, Korea</td><td>1730R</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography columns</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>732-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

Belirli bölgelerdeki protein fosforilasyonu, konformasyonunu ve diğer moleküllerle olan etkileşimini belirler. Böylece protein fosforilasyonu, hücrenin biyolojik işlevlerini ve özelliklerini etkiler. Günümüzde, fosforilasyon alanlarını keşfetmek için en yaygın yöntem, hızlı ve hassas bir yöntem olan sıvı kromatografi / kütle spektrometresi (LC / MS) analizidir. Bununla birlikte, nispeten kararsız fosfat kısımları sıklıkla sahte-negatif sinyaller üreten parçalanma aşaması esnasında fosfopeptidlerden salınmaktadır. Bu gibi durumlarda , bölgeye yönelik mutantları kullanan geleneksel bir in vitro kinaz tahlili daha doğru olur, ancak bu yöntem zahmetli ve zaman alıcıdır. Bu nedenle, peptid rekabetini kullanan alternatif bir yöntem avantajlı olabilir. 5 &#39;adenosin monofosfat aktive protein kinaz (AMPK)&#39; nın konsensüs tanıma motifi 1 olarak belirlenmiş ve pozisyonel tarama peptit kütüphanesi eşeği kullanılarak onaylanmıştır2. ay. Böylece, yeni bir substrat için AMPK fosforilasyon bölgeleri peptid rekabet deneyleri ile öngörülebilir ve teyit edilebilir. Bu raporda, AMPK aracılı nükleer faktör eritroid 2 ile ilişkili faktör 2 (Nrf2) fosforilasyonunu örnekleyerek, in vitro oligopeptidle rekabet eden kinaz tahlili için ayrıntılı adımları ve prosedürleri açıklıyoruz. Fosforilasyon sahasının kimliğini doğrulamak için, bir bölgeye özgü mutant kullanarak ardışık in vitro kinaz deneyi gerçekleştirdik. Genel olarak, peptit rekabet tahlili, çoklu potansiyel fosforilasyon bölgelerini taramak ve fosforilasyon bölgesi mutantları tarafından geçerlilik için siteleri belirlemek için bir yöntem sağlar.

Şekil 1 ve Şekil 2 , daha önce bildirilen bildiride 8 tekrarlanan deneylerden elde edilen sonuçları göstermektedir. Tahmini AMPK hedef bölgelerini taklit eden üç farklı 10 kalıntı oligopeptid (Ser153 içeren # 1, 148-157, Ser335 içeren # 2, 330-339 ve Ser558 içeren # 3, 553-562) sentezlendi ve in Vitro kinaz tahlili. Nrf2&#39;nin AMPK tarafından fosforilasyonu, oligopeptit # 3 varl...

Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

oligopeptide-competition-assay-for-phosphorylation-site-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.4K Görüntüleme.  Seoul National University.  Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır. 

Video: Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Biyokimya

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Biyoloji

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Rekabet tahlilleri kullanılarak GTPaz bağlayıcı proteinlerin afinitesini

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...