Biz sinek stoklarının sinek yiyecek hazırlama ve bakımı için Chun-lan Hsu ve Yu-Chi Yang minnettarız ve Su-Ping Lee ve konfokal mikroskobu ile yardım için IMB Görüntüleme Core. Bu çalışma, 101-2321-B-001 -004 NSC 100-2321-B-001 -012 NSC 102-2321-B-001 -002, EN 103-2311-B-001 YHS (MGK hibe ile desteklenmiştir Ulusal Bilim Konseyi ve Çin Cumhuriyeti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı&#39;ndan -035 -MY3).

1. Ön deneysel Kur <ol><li> 5 gün boyunca 25 ° C&#39;de bir sinek mδ0.5-Gal4 altında nükleer yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eden yumurta ve kültürünü toplayın. </li><li> Mikrodalga agaroz 1x Fosfat tamponlu tuzlu su, 10 mL agaroz tamamen eriyene kadar (PBS) içinde, düşük erime 0.7 g. 37 ° C kuluçka makinesi içinde kullanıma kadar% 0.7 düşük erime sıcaklıklı jel tutun. </li><li> Birden fazla 12 saat boyunca% 70 etanol ile forseps, makas 42 mm x 0.17 mm lamelleri, 9 oyuklu cam nokta plaka ve bir manyetik kültür odası dahil olmak üzere tüm ekipman, sterilize edin. </li><li> % 2 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 0.5 penisilin-streptomisin ve 1.25 mg / ml insülin ile takviye Schneider Drosophila ortamı: kültür ortamı 3 hazırlayın. kirlenmesini önlemek için, bir hücre kültürü kaputu ortamı hazırlar. 4 ° C &#39;de hazırlanan kültür ortamı Mağaza ve bir ay içinde kullanılır. </li><li> Diseksiyon platform ve deneyci&#39; temizleyindiseksiyon başlamadan önce ler% 70 etanol ile el. </li></ol> 2. Disk Diseksiyon <ol><li> Hava% 70 etanol gelen tüm ekipman kurutun. </li><li> Bir sinek şişesinden bir üçüncü evre larva seçin. sinek Flakondan kirlenmesini önlemek için, atık kaldırmak için 1x PBS 3x larva yıkayın. </li><li> bir diseksiyon mikroskobu altında 9 gözlü cam nokta plakada (oda sıcaklığında) kültür ortamının 1 mL temizlenmiş larva teşrih. </li><li> Yaklaşık bir arka ucundan bir şekilde üçüncü ve ağız kanca başka forseps ile bir çift forseps ile larva tutun. Iç doku serbest bırakmak için zıt yönlerde iki forseps çekin. <ol><li> Ağız kanca takılı göz-beyin kompleksinden tükürük bezleri, vücut yağ ve manikür çıkarın. ventral sinir kordonu hala bağlı ise, makasla onu kesip. </li></ol></li><li> co doku parçası kaldırmak için ağız kanca ve forseps bir çift kavrama forseps bir çift kullanındorsal bölümünde beyinleri ve göz diskleri nnects. NOT: Bu doku kaldırılmazsa, iki göz anten diskler birbirleriyle ve beyne yakın olacaktır. Bu doku, beyin ve göz anten disk, üçgen şekli çünkü göz Diskler daha sonra lamel üzerinde düz olarak durmaktadır olmaz. </li><li> Ventral-yukarı konuma bütün kompleks döndürün. Beyne kanca veya diski bağlayan filamanın çıkartın. NOT: filaman kaldırılmazsa ağız kanca kaldırıldığında, göz anten disk iki parça bölünecek. <ol><li> Ağız kanca çıkarın. sürecinde göz diski zarar vermemeye özen gösterin. NOT: Göz disk şimdi ortamdaki serbest ve tek optik sap ile beyne bağlı olduğunu. </li></ol></li></ol> 3. Montaj <ol><li> Hava ve kuru bir 42 mm x 0.17 mm örtücü kısım haznenin bileşenleri bir araya getirin. th tutmak için kapak kayma merkezine O-halkalarının bir çift katmanlı takınE agaroz. </li><li> lamel ile bölme bir araya getirin. aşama alıcı 42 mm x 0.17 mm lamel koyun. kapak üzerinde bulunan silikon bir O-halkası yerleştirin. tabanını yerleştirin. Sızdırmazlık dolap Kilit kapağı (Şekil 1) koyun. </li><li> Dikkatli bir şekilde 10-200 uL ucu olan bir 20 uL mikropipet kullanılarak O-ring merkezine parçalara göz-beyin kompleksi aktarın. </li><li> Sıvı ortamı en iyi çıkarın ve örnek (37 ° C&#39;de),% 0.7 düşük erime noktalı agaroz 12 uL ekleyin. NOT: Göz diskin pozisyon agaroz sertleşmesinden önce forseps ile değiştirilebilir. Agaroz 5 dakika içinde katılaşacaktır. <ol><li> O-ring merkezine oda sıcaklığında 1 ml kültür ortamı ilave et; her biri O-halka 4 örneğe kadar yükleyebilir. Agaroz numunenin sürüklenmesini önlemek için O-ring yapıştırılmış olduğundan emin olun. NOT: ortamın hiçbir havalandırma veya dolaşım gereklidir. </li></ol></li></ol>4. Konfokal mikroskopi <ol><li> sıcaklığı eşitlemek için 30 dakika boyunca bir ters konfokal mikroskop aşamasında odasına yerleştirin. Bu görüntüleme sırasında Z ekseni sürüklenme önleyebilir. </li><li> Uzun süreli canlı görüntüleme önce, doku diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile bozulmamış olup olmadığını kontrol edin. </li><li> fototoksisite önlemek için, 2 mW altındaki bir lazer gücü kullanacak. görüntüleme için 40X objektif kullanın. </li><li> 1 um bir optik aralıklarla 12 dakika içinde 62 um, Z-yığın görüntüler elde. 10 saatlik bir toplam üzerinden taramasından 40 döngü elde edin. her döngü görüntüleme 12 dk ve dinlenme 3 dakika içerdiğinden emin olun. </li></ol>

<ol>
	<li>Cohen, S. M., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+disc+development.">Imaginal disc development.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 2, 747-842 (1993).</li><li>Auerbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+legs,+wings+and+halteres+in+wild+type+and+some+mutant+strains+of+Drosophila+melanogaster.">The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster.</a> Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila Melanogaster. , 1277-1316 (1993).</li><li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila.">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li><li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye.">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li><li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions.">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li><li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK/Pnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe/AF6.">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li><li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster.">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+differentiation+in+Drosophila.">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, ., Wittbrodt, F., J, E. H., Stelzer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway.">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae.">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li><li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc.">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li><li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs.">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li><li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis.">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li><li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila.">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li><li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro.">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Bu çalışmada, Drosophila hayali diskler üzerinde uzun süreli canlı görüntüleme deney için ayrıntılı bir protokol sağlar. Dikkatli diseksiyon disk zarar görmemesi için ve lamelleri yakın diskin yapışmasını sağlamak üzere pratik çok zaman geçirdi. Bu doku tutmak için Poli-L-lisin (PLL) ve agaroz düşük erime çalıştı; Sonunda, düşük erime noktalı agaroz doku tutmak için daha iyi bir yeteneği gösterdi. sadece göz diski 10 saat canlı görüntüleme döneminde fotoreseptör farklılaşması ve ommatidial normal dönme oluşumunu göstermek için bu yazıda kullanılmış olmasına rağmen, bir de gösterildiği gibi, bu yöntem de en az bir başka disk, kanat disk uygulanabilir Bir önceki çalışmada 3. Dahası, kültür ortamı hazırlama ve canlı görüntüleme kurulumu basittir ve havalandırma veya orta dolaşımını gerektirmez. Sürekli canlı görüntüleme biyolojik arifesinde net bir zamansal dizisi sağlayabilirnts. Göz diskin glia farklılaşma ve göç eden önceki raporda, sarma çlia göz pulunun 3 ön göç sonrasında mevcut glia ayırt o direkt kanıt sağladı. Uzun süreli ex vivo kültür davranışlarını 3 takip etmek böyle KAEDE floresan proteininin fotoğraf dönüşümü olarak hücrelerin, spesifik lazer aktive etiketleme sağlar. Aynı zamanda, kültür ortamı doğrudan ilave kimyasal maddelerin test barındırabilir; Bu şekilde, bir ilaç tarama platformu olarak kullanılabilir. Bazı dinamik süreç dakika veya saniye içinde cereyan ettiği için, yüksek zamansal çözünürlük gereklidir. Zamansal çözünürlük, ışık levha mikroskopisi 15, 16 veya eğirme disk mikroskopisi 17 arttırmak için iyi bir seçenek olabilir. Geçerli kültür koşulu mükemmel değildir. Bu disk büyümesini desteklemez. Hücre proliferation sadece yukarı 12 saat 3 için desteklenir. Ex vivo kültür içinde 12 saat sonra, fotoreseptör farklılaşma oranı 3 azalmaya başlar. Bu, belirli besinlerin veya hormonların eksikliği nedeniyle olabilir. Bu kültür ortamında önemli fark, yüksek insülin konsantrasyonu için, memeli insülin endojen insülin-benzeri peptidlerin fonksiyonunu taklit eden kısmen olabilir. Uçucu özü, böcek kan şekeri trehaloz ve deri değiştirme hormonu 20-hidroksiekdison çeşitli konsantrasyonlarının eklenmesi, 3 yararlı değildi. Ancak, 12-18 saat kültür dönemi birçok gelişim süreçlerini incelemek için yeterlidir. Larva hayali diskler kültürleme için alternatif kültürleme metotları 3 karşılaştırılmıştır ve bizim kültür ve görüntüleme koşulu canlı görüntüleme için en uzun zamanı penceresi ve en netlik sağlar. canlı larva ve pupa içinde diskleri doğrudan görüntülü olabilir rağmen18, 19, 20, 21, 22, gözlemler için çözünürlük ve zaman penceresi sınırlıdır. Geç larva ve pupa diskler uzun süre 23, 24 için kültüre, ancak diskler önemli morfonogenezi tabi tutulabilir. düz ve 2B larva disklerin yararlanmak için lütfen kültürü ve görüntüleme yöntemi şimdiye kadar en iyi çözümdür.

Drosophila larva hayali diskler biyolojik mekanizmaları çok çeşitli çalışma için tercih deneysel sistem olmuştur. Bu diskler, iki epitel tabakaları ile inşa kesesi benzeri yapılar embriyonik epitelden invagine haline, Peripodial Epitel (PE) ve uygun Disk (DP) 1, 2. hayali disk hücreleri çoğalır ve giderek larva ve pupa aşamalarında farklılaştırmak ve sonuçta erişkin vücut yapılarına gelişir. Nedeniyle hayali diskler düz ve basit iki katmanlı yapısı, onlar larva disseke zaman gözlemlemek kolaydır. Ancak, birçok gruplar tarafından çeşitli çabalara rağmen, hayali diskler uzun vadeli kültürü için mevcut yöntemler tatminkar olmamıştır. Geçenlerde en fazla 18 saat çoklu hayali diskler normal gelişimini devam edebilir bir kültür yöntemi geliştirdik ve bu canlı görüntüleme 3 tanır </s&gt; Yukarı. kültür yöntemi, hücre farklılaşması ve taşıma destekleyebilir, ancak yalnızca 7-12 saat boyunca hücre çoğalmasını destekleyebilir ve disk büyümesini desteklemez. Kültür ortamında önemli fark insülin 3 yüksek konsantrasyondur. yöntem basittir ve hiçbir özel havalandırma veya orta dolaşım gereklidir. en çok çalışılan hayali diskler biri göz anten disktir. Drosophila göz yaklaşık 800 ommatidia inşa edilmiştir. Her ommatidium sekiz fotoreseptör hücrelerinin (R1-R8) oluşur. Larva göz disk, fotoreseptör hücreleri 4, 5 anterior posterior göz diski süpürür Morfojenetik Furrow (MF), geçişi izleyen farklılaştığı. Bir ommatidium fotoreseptörlerin R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6 ve R7 6 ardından R8 ile başlayan, sırayla ayırt. dorsal ommatidia&#39;lar ve ettikGöz diskin ntral yarımları zıt kiraliteye 7, 8 ile sonuçlanan, ters yönde 90 ° &#39;lik dönme tabi tutulur. dönme işlemi iki aşamada gerçekleşir: İlk olarak, 45 ° &#39;lik dönme başlar ve MF arkasında altıncı ommatidia&#39;lar satırdaki tamamlanır; ikinci 45 ° &#39;lik dönüş satır 16 9, yaklaşık 10 tamamlanır. R3 / 4 spesifik mδ0.5-GA4 11 ile işaretlenmiş ommatidial dönme kullanılan bu çalışma, kültüre bu yöntem sayesinde gözlemlenebilir normal hücresel farklılaşma ve dinamikleri göstermek ve göz diski imajını canlı.

<table><tbody><tr><td>Low-melting agarose</td><td>AMRESCO&amp;nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm cover slips&amp;nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Culture chamber&amp;nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 Cell Cultivation System</td></tr><tr><td>40X objective</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fly strain:nls.GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

Canlı görüntüleme sürekli gerçek zamanlı olarak dinamik hücresel ve gelişimsel süreçleri izleme olanağı sağlar. Drosophila larva hayali diskler böyle hücre çoğalması, farklılaşması, büyümesi, göç, apoptoz, rekabet, hücreler arası iletimde, ve kompartıman sınır oluşumu gibi birçok biyolojik süreçleri, çalışma kullanılmıştır. Ancak, uzun süreli ex vivo kültür ve hayali diskler canlı görüntüleme yöntemleri birçok çabalara rağmen, tatmin edici olmamıştır. Son zamanlarda, uzun vadeli ex vivo kültür ve en fazla 18 saat hayali diskler canlı görüntüleme için bir yöntem geliştirdi. Kültür ortamı içinde, yüksek insülin konsantrasyonu kullanılarak ek olarak, bir düşük erime noktalı agaroz ayrıca, görüntüleme süresi boyunca kaymasını önlemek için disk gömmek için kullanılmıştır. Bu rapor örnek olarak göz anten diskleri kullanır. Fotoreseptör R3 / 4 spesifik mδ0.5-GA4 ekspresyon ayırıcı bu fotoreseptör göstermek için izlenmiştirdüzene sokan ve ommatidial rotasyon 10 saat canlı görüntüleme süresi boyunca görülebilir. Bu, bu basit bir yöntem açıklayan ayrıntılı bir protokoldür.

<html> Bu örnekte, R3 / R4 fotoreseptör fotoreseptör farklılaşmasını izlemek için mδ0.5-GA4 ile etiketlenmiştir. mδ0.5-GA4 olarak ommatidial dönme işlemi için, bu, R3 ve R4 için mükemmel bir patron yapım, R3 11&#39;de R4 güçlü ekspresyonu ve zayıf ekspresyonu sağlayan. Film 1, R3 ve R4, GFP ile etiketlenmiştir. 10 saat canlı görüntüleme oturumunun başında, ommatidial kümeler (Şekil 2A ve Film 1) ve sonunda (Şekil 2B) ommatidial kümelerinin 14 satır 8 satır vardı. Ommatidial farklılaşma oranı, in vivo olarak diskleri 7, 8, 9, 10, 11 1.5-2 saat / sıranın oranına yakın olan, sıra başına 1.67 saat olmuşturs = &quot;xref&quot;&gt; 12, 13, 14. R3 ve R4 nispi konumlarına bağlı olarak, ommatidial dönme canlı görüntüleme (Şekil 2A &#39;A&#39;, B&#39; ve B &#39;&#39;) sırasında, ex vivo kültürlenmiş disk meydana geldi. Tek bir R3 / R4 küme film 2&#39;nin birinci çerçevedeki bir beyaz küre ile etiketlenmiştir. Başlangıçta, R3 / R4 ekseni ekvator (Şekil 2C ve Film 2) dik olacak şekilde görünür. Daha sonra, sırasıyla, (Şekil 2C &#39;&#39; &#39;) h 3 (Şekil 2C&#39;), 6 (Şekil 2C &#39;&#39;) 15 °, 30 ° ve 45 ° döndürmek için görüntülenir ve 9. Bu veriler, bu yöntem 10 saat canlı görüntüleme sırasında fotoreseptör farklılaşmayı sürdürmek ileri sürmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figu1 re: Oda Meclisinin Şematik. Hazne düzeneğinin şematik diyagramı: (1) aşama alıcı çift katmanlı O-ring bağlı lamel koyun. (2) bir kapak üzerinde silikon O-halka yerleştirin. (3), taban. (4) sızdırmazlık dolap kilitler. (5) O-ring merkezinde örnek yükleyin ve kapağını kapatın. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Şekil 2, R3 / R4, türev ve Rotasyon Canlı Görüntüleme. R3 / R4 canlı görüntüleme 10 saat boyunca nükleer bir şekilde GFP ifade mδ0.5-Gal4 ile etiketlenmiş. Tüm rakamlar Film 1&#39;den ele geçirildi. Başında alınan (A) görüntüsü. ( <strong<html> &gt; A &#39;A&quot;) sola (A&#39;) ve sağ (A kutulu alandan genişlemiş Resmi&quot;). (B), resim 10 saatlik bir süre sonunda alınmıştır. &quot;((P&#39;-B) sola (B&#39;) ve sağdaki B) kutulu alandan genişlemiş Görüntü&quot;. (CC &#39; &#39;), (A bir ok ile gösterilen bir tek, R3 / R4 çift&#39;), R3 / R4 çiftinin rotasyon sergilemektedir için zaman içinde takip edilir. Ölçek çubukları = 15 um, sırasıyla 10 um, ve A, B, ve C de 5 um. Tüm şekiller maksimum yoğunluğu z tahminleridir. zaman ölçeği saat gösterilmektedir: min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Film 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc at JoVE.com

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Bu protokol uzun vadeli ex vivo kültür ve Drosophila hayali diskin canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem tarif etmektedir. Göz diskin canlı görüntüleme 10 saat süre içinde fotoreseptör farklılaşma ve ommatidial dönüşünü gösterir. protokol basit ve pahalı kurulum gerektirmez.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K Görüntüleme.  National Yang-Ming University.  Bu protokol uzun vadeli ex vivo kültür ve Drosophila hayali diskin canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem tarif etmektedir. Göz diskin canlı görüntüleme 10 saat süre içinde fotoreseptör farklılaşma ve ommatidial dönüşünü gösterir. protokol basit ve pahalı kurulum gerektirmez. 

Video: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biyoloji

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

Göz hayali Disk Görselleştirme Yardım Roman RFP Reporter Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Drosophila Pupa Bacak Morfogenezinin Puparium Olmadan Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Drosophila Gelişimi Sırasında Dinamik Epitel Yapılarının Ortaya Çıkarılması

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Puparium çıkarıldıktan sonra Drosophila pupa bacak gelişiminin uzun süreli canlı görüntülenmesi

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Uzun süreli Canlı Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Canlı-görüntüleme

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Göz hayali Disk Görselleştirme Yardım Roman RFP Reporter Drosophila

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Puparium çıkarıldıktan sonra Drosophila pupa bacak gelişiminin uzun süreli canlı görüntülenmesi

Puparium çıkarıldıktan sonra Drosophila pupa bacak gelişiminin uzun süreli canlı görüntülenmesi

Puparium çıkarıldıktan sonra Drosophila pupa bacak gelişiminin uzun süreli canlı görüntülenmesi

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi