Name: a filtration-based method of preparing high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle for chromatin immunoprecipitation
Uploaded: 2017-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation at JoVE.com

Karyn Esser, Nobuya Koike ve Noheon Park&#39;a faydalı tavsiyeler için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen S.-HY&#39;ye NIH / NIGMS (R01GM114424) ve Robert A. Welch Vakfı (AU-1731) ve NIH / NIA (R01AG045828) tarafından ZC&#39;ye destek verildi

Hayvan bakımı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergeleri kapsamında gerçekleştirildi ve işlemler Houston&#39;daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından onaylanmış bir hayvan protokolüne göre gerçekleştirildi. 1. Çapraz bağlı İskelet Kası&#39;ndan Çekirdek İzolasyonu <ol><li> Yaklaşık 20 haftalık C57BL / 6 erkek farelerden izole edilen arka bacak iskeleti kasını, daha önce 22&#39;de detaylı olarak tarif edildiği gibi buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içinde tartın ve kıymalayın. NOT: Genellikle bir fare ile 1.0 - 1.5 g iskelet kası alırız. <ol><li> Öğütülmüş iskelet kası dokusunu, buz üzerinde 10 mL PBS içeren 50 mL&#39;lik bir konik tüp içine yerleştirin. </li></ol></li><li> 4 dakika 300 xg&#39;de santrifüj 0 ° C&#39;de 5 dakika. </li><li> Aspirasyonla PBS süpernatantını dikkatlice çıkarın. </li><li> 1, 2, 3 ve 4 mL su bulunan referans tüpleri kullanarak her 50 mL&#39;lik tüpteki pelet hacmini tahmin edin. </li><li> 7 cilt ekleyin.Buz soğukluğundaki% 1 formaldehit ile PBS&#39;de karıştırın ve bir prob dokusu homojenizatörü kullanarak buz üzerinde numuneleri homojenize edin (bkz . Malzeme Tablosu ). NOT: İsteğe bağlı: Homojenleştirme prosedürü soğuk bir odada yapılabilir. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe ederek numuneyi çapraz bağlayın. </li><li> 0.125 M&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar 1 M glisin ilavesiyle çapraz bağlanma reaksiyonunu söndürün ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Numuneleri 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 3.000 xg&#39;de santrifüjleyin. Yüzey aspirasyon yoluyla alın. </li><li> Yeni eklenen proteaz inhibitörleri (0.2 mM fenilmetilsülfonil fluorür (PMSF) içeren 10 mL buz soğukluğunda baz tampon çözeltisi (pH 7.3&#39;de 10 mM HEPES-KOH, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT) , Ve 10 ug / mL leupeptin). 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 3000 g&#39;de santrifüjleyin ve süpernatanı özenle aspire edin. </li><li> Pelet 6 mL liziz tamponu (10 mM HEPES-KOH, pTaze olarak ilave edilen proteaz inhibitörleri (0.2 mM PMSF ve 10 ug / mL leupeptin) ihtiva eden% 0.1 Tris-H 7.3, 10 mM EDTA, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT,% 1 Triton X- </li><li> Numuneyi önceden soğutulmuş bir 15 mL Dounce homojenizöre aktarın ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Çekirdekleri serbest bırakmak için sıkı havaneli 15 vuruş takiben gevşek havyar kullanarak 15 yavaş vuruş ile buz üzerinde her örneği homojen hale getirin. </li><li> Homojenat (6 mL), hücre süzgeci (gözenek boyutu: 100 μm) boyunca filtre edin ve 4 mL liziz tamponuyla durulayın. Örnekleri 1,000 xg&#39;de 10 dakika süreyle 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. 5 mL buz soğukluğunda baz tamponuna tekrar süspansiyon haline getirin ve çekirdekleri serbest bırakmak için sıkı havan ile 10 kez atın. <ol><li> Spektrofotometre (OD260 / OD280) ile DNA konsantrasyonu ölçümü için 20 μL&#39;lik bir kısım ve gerekirse trypan mavisi ile mikroskopik gözlem çıkarın (aşağıya bakın) ( Şekil 1 A ). </li></ol></li><li> Süspansiyonu filtrelemeBir hücre süzgeci (Gözenek büyüklüğü: 70 μm) tüpü durulayın ve tekrar yukarıdaki gibi 2 mL baz tamponu ile filtreleyin. </li><li> Adım 1.13&#39;te olduğu gibi filtrelemeyi yavaş yavaş azaltılmış gözenek boyutundaki (40 μm, 30 μm, 20 μm ve 10 μm) hücre süzücü ile tekrarlayın. NOT: Toplam olarak, 6 gözenek boyutundaki süzgeçler 1.12-1.14 adımlarında kullanılmıştır. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1000 g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı kaldırın ve 500 μL baz tampon pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Yukarıdaki gibi DNA konsantrasyonunu ölçün. NOT: Yaklaşık 200 ug nükleik DNA, her iki arka ekstremanın bir hayvandan birleştirilmesiyle elde edilmiştir. İsteğe bağlı olarak, trypan mavi boyama ile mikroskopik gözlem için 20 μL&#39;den tasarruf edin (stok konsantrasyonu% 0.4, 1: 5 seyreltme); Çekirdekler maviye boyar ( Şekil 1 B ). </li><li> 1000 g&#39;de 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Pelleti -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2. Sonication &lt;ol&gt; <li> 500 μL SDS liziz tamponundaki örnekleri çözünür ve nazik pipetleme ile tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Çekirdek DNA süspansiyonunu buz üzerindeki bir cam şişeye aktarın. </li><li> Sonikasyonu, çanak şeklindeki bir dönüştürücüden ultrasonik akustik enerjinin odaklanmış patlamalarıyla çalıştırın. Ekipman detayları için Malzeme Tablosu&#39;na bakın. Aşağıdaki ayarı kullanın: kopya başına döngü sayısı: 200; Yoğunluk: 5; Görev döngüsü: 20; Sıcaklık 4 - 6 ° C; 30 saniye açık / kapalı. NOT: Sonikasyon etkinliğini değerlendirmek için bir örnek Şekil 2&#39;de gösterilmektedir. </li><li> Sonikasyona uğramış kromatin 1.5 mL&#39;lik bir tüpe aktarılır. 15 dakika süreyle 12.000 xg&#39;de santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. 65 ° C&#39;de gece boyunca ters çapraz bağlama için 50 μL sonike edilmiş örnekleri (~ 7 - 10 μg / kas örneği) yeni bir 1.5 mL tüp içine aktarın. Kalan örnekleri -80 ° C&#39;de dondurun. </li></ol> 3. Sonikasyon ve Niceleşmenin Değerlendirilmesi <ol><li> 1.0 ekle50 μL sonike edilmiş örneklere RNase A (500 U / mL RNase A: 20,000 U / mL RNase T1) ile 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> 8 μL proteaz K (10 mg / mL) ilave edin ve 55 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> Bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak DNA hasat. <ol><li> 5 cilt bağlama tamponu ilave edin, spin sütununa uygulayın ve 4,000 xg, 10 dakikada santrifüjleyin. </li><li> Pass&#39;u aynı kolona uygulayın ve tekrar santrifüjleyin. </li><li> Yıkama tamponuyla iki kez 13.000 xg, 1 dakika yıkayın. </li><li> Kolonu kurutmak için tekrar 13.000 xg&#39;de 1 dakika santrifüjleyin. </li><li> 50 uL H 2 O ekleyin ve DNA&#39;yı elüe etmesi için 13.000 xg&#39;de 1 dakika santrifüjleyin. </li><li> Pass&#39;u aynı kolona uygulayın ve tekrar santrifüjleyin. </li></ol></li><li> Bir spektrofotometre (OD260 / OD280) ile DNA miktarını ölçün. Sonikli ürünlerin boyut ve miktarını (1 μg) değerlendirmek için% 0.8 jel üzerinde numuneler çalıştırın ( Şekil 2 ). NOT: Ortalama kromatin verimi yaklaşık% 20&#39;dir. </li></ol> 4. Çip <ol><li> Daha önce kaydedilen kromatin&#39;i -80 ° C&#39;de çözdürün ve kromatin miktarını tüp başına ~ 100 - 120 μg&#39;a bölün. 1: 10&#39;u radyoimünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu (20mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, 1x Proteaz inhibitör kokteyl (PIC),% 0.1 Na-deoksikolat W / v),% 1 Triton X-100). <ol><li> Her grupta birden fazla numune varsa, ~ 100-120 μg / numunenin son miktarına eşit miktarda kromatin DNA&#39;sı birleştirin. Girdi olarak% 10 tasarruf edin. </li></ol></li><li> BSA ön bloke edilmiş (~ 2 saat, 4 ° C) Protein A / G agarozu (tavuk olmayan antikor) veya IgY boncuklarını (Tavuk antikoru) 40 μL (RIPA tamponunda% 50 v / v bulamaç) ilave edin ve 4 ° C&#39;de 3 saat rotator. </li><li> 1,000 xg&#39;de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni tüplere dikkatle aktarın. </li><li> 1 μg antikor başına antikor ekleyin25 - 100 μg kromatin DNA. </li><li> Yaklaşık 15 rpm&#39;de gece boyunca 4 ° C&#39;de nazikçe döndürün. </li><li> 10 μL BSA ön bloke edilmiş (~ 2 saat, 4 ° C) Protein A / G agarozu (tavuk olmayan antikor) veya IgY boncuklarını (Tavuk antikoru) karıştırın ve 2 saat boyunca soğuk odada döndürün. </li><li> Boncukları aşağıdaki gibi yıkayın. 1 mL RIPA tamponu ile 3 kez yıkayın, 1 mL yüksek tuzlu tampon (20 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF,% 1 Triton X-100) ile 3 kez iki kez yıkayın , 1 mL LiCl tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF,% 1 Na-deoksikolat,% 0.5 NP40) ile 3 dakika boyunca iki kez yıkayın. <ol><li> 1 mL Tris-EDTA (TE) tamponu (10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA) ile 3 dakika bir kez yıkayın. Sonra elüsyon tamponu (20 mM Tris-HC1, 5 mM EDTA ve% 0.5 SDS) ile DNA&#39;yı elute edin. </li></ol></li><li> 1000 g, 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. </li><li> Boncuğu 50 uL elüsyon tamponu ile tekrar süspanse edin. </li><li> 10 için kuluçkaya yatırınMin, 65 ° C&#39;de. </li><li> 5 dakika süreyle 12.000 g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın, 5 mL daha 12,000 g&#39;de bir kez daha 50 μL ekleyin ve santrifüjleyin. Nihai elüsyon hacmi 100 uL olacaktır. </li><li> Ters çevrilen çapraz bağlama ve DNA elüsyonu. <ol><li> Eriyen kromatin gece boyunca 65 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1.0 uL RNase A ekleyin ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> 8 μL proteaz K (10 mg / mL) ilave edin ve 55 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> Üreticinin protokolüne göre 50 μL&#39;de elüsyon hacmi olan bir PCR temizleme kiti kullanarak DNA&#39;yı hasat edin. </li></ol></li><li> Profilleri daha önce 25 , 26 açıklandığı gibi Gerçek Zamanlı qPCR ile analiz edin. NOT: Primer dizileri Şekil 3 Efsane&#39;de listelenmiştir. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur ( Şekil 3 ). </li></ol>

<ol>
	<li>Bouzakri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-based+gene+silencing+reveals+specialized+roles+of+IRS-1/Akt2+and+IRS-2/Akt1+in+glucose+and+lipid+metabolism+in+human+skeletal+muscle.">siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle.</a> Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).</li><li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states.">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).</li><li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+circadian+signaling+networks+and+therapeutic+targets.">Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets.</a> Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).</li><li>Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms,+the+molecular+clock,+and+skeletal+muscle.">Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle.</a> J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).</li><li>Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+the+circadian+and+sleep+cycles+to+protect+against+metabolic+disease.">Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).</li><li>Harfmann, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+loss+of+Bmal1+leads+to+disrupted+tissue+glucose+metabolism+and+systemic+glucose+homeostasis.">Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis.</a> Skelet Muscle. 6, 12 (2016).</li><li>Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscles,+exercise+and+obesity:+skeletal+muscle+as+a+secretory+organ.">Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ.</a> Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Jackson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+histone+organization+in+the+nucleosome+using+formaldehyde+as+a+reversible+cross-linking+agent.">Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent.</a> Cell. 15 (3), 945-954 (1978).</li><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo:+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes.">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li><li>Takahashi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+RNA-seq+methods+to+study+circadian+control+of+transcription+in+mammals.">ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals.</a> Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).</li><li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein:DNA+associations+in+a+chromatin+environment.">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li><li>Chen, Z., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+promoter+elements+and+TAFs+contribute+to+the+diversity+of+transcriptional+activation+in+vertebrates.">Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates.</a> Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).</li><li>Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+PER+repression+mechanisms+in+the+Drosophila+circadian+clock:+from+on-DNA+to+off-DNA.">Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA.</a> Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).</li><li>Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+Period2+expression+and+the+circadian+clock.">p53 regulates Period2 expression and the circadian clock.</a> Nat Commun. 4, 2444 (2013).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Koike, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+and+chromatin+landscape+of+the+core+circadian+clock+in+mammals.">Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals.</a> Science. 338 (6105), 349-354 (2012).</li><li>Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPping+away+at+the+Drosophila+clock.">ChIPping away at the Drosophila clock.</a> Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).</li><li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. , (2016).</li><li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei.">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).</li><li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+nuclei+from+skeletal+muscle+satellite+cells+and+myofibers+for+use+in+chromatin+immunoprecipitation+assays.">Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays.</a> Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).</li><li>Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nuclei+and+preparation+of+nuclear+envelopes+from+skeletal+muscle.">Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle.</a> Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).</li><li>Hahn, C. G., Covault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+transcriptionally+active+nuclei+from+striated+muscle+using+Percoll+density+gradients.">Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients.</a> Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).</li><li>Jeong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+attenuation+of+proteasomal+and+autophagic+BMAL1+degradation+in+Clock+Delta19/++mice+contributes+to+improved+glucose+homeostasis.">Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis.</a> Scientific reports. 5, 12801 (2015).</li><li>Nohara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonia-lowering+activities+and+carbamoyl+phosphate+synthetase+1+(Cps1)+induction+mechanism+of+a+natural+flavonoid.">Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid.</a> Nutrition &amp; metabolism. 12, 23 (2015).</li><li>Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxa2+integrates+the+transcriptional+response+of+the+hepatocyte+to+fasting.">Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting.</a> Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity.">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li><li>Kondratov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMAL1-dependent+circadian+oscillation+of+nuclear+CLOCK:+posttranslational+events+induced+by+dimerization+of+transcriptional+activators+of+the+mammalian+clock+system.">BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system.</a> Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).</li><li>Ripperger, J. A., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+CLOCK-BMAL1+binding+to+multiple+E-box+motifs+drives+circadian+Dbp+transcription+and+chromatin+transitions.">Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions.</a> Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).</li><li>Laplante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEPTOR+cell-autonomously+promotes+adipogenesis,+and+its+expression+is+associated+with+obesity.">DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity.</a> Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).</li><li>Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+regulator+PGC-1alpha+directly+controls+the+expression+of+the+hypothalamic+neuropeptide+oxytocin.">The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin.</a> J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için çapraz bağlı iskelet kas dokularının kullanıldığı sağlam bir yöntemi açıkladık. Çekirdekleri enkazdan etkili bir şekilde ayırmak için sıralı filtreleme yapıldı ve çanak şeklinde dönüştürücüden gelen ultrasonik akustik enerji, ChIP analizi için kromatı kesti. Sonuçlar BMAL1&#39;in hedef promoterlere sirkadiyen zamana özel bağlanmasını gösterdi. ChIP, çapraz bağlanma gerçekleştiğinde genomik DNA...

İskelet kası fizyolojide ve davranışta önemli rol oynamaktadır. Çok çekirdekli kas lifi, aktin ve miyozinin kasılma kuvveti oluşturmak için sarkomerler denilen işlevsel birimleri oluşturduğu miyofibrillerden oluşur. İskelet kası aynı zamanda vücudun en büyük metabolizma organıdır, postprandial glikoz alımının&gt;% 80&#39;ini ve insülin tepkisini ve metabolik homeostazı düzenleyen 1 , 2&#39;yi hesaplar. Kas fizyolojisi ve metabolizması sirkadiyen saat, 3 , 4 , 5 , 6 nispi biyolojik zamanlayıcı tarafından yakından düzenlenir. Örneğin, çekirdeğin sirkadiyen saat bileşenlerinden biri olan Bmal1&#39;in iskelet kasına özgü silinmesi, iskelet kasında insülin direnci ve glukoz alımını azalttı ve hayvanlarda tip 2 diyabet 7 geliştiği bulundu. benAyrıca, iskelet kası, sistemik metabolizma ve fizyolojiyi düzenlemek için mokinleri salgılayan bir endokrin organ 8 olarak giderek daha fazla takdir edilmektedir. İskelet kasında bu düzenleyici işlevleri tam olarak anlamak için mekanik çalışmalara ihtiyaç vardır. ChIP, DNA bağlayıcı proteinlerin hızlandırıcı alımını tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. ChIP başlangıçta kromatin DNA 9 , 10&#39;daki nükleozom organizasyonunu tanımlamak için geliştirildi. O zamandan beri çeşitli yöntemlerin, formaldehit, dimetil sülfat veya mor ötesi ışınlama (UV) 11 , 12 kullanarak proteinleri ve kromatin DNA&#39;yı çapraz bağladığı bildirildi. Formaldehit çapraz bağlanma, kromatin yapısını koruyan ve DNA-protein etkileşimlerini koruyan en yaygın yöntemdir ( 9 , 13 , 14) . Çapraz bağlı kromatografiSonication tarafından parçalanmış ve ilgilenilen belirli DNA bağlama proteinine karşı antikor ile immüno-çökeltilmiş 15 , 16 . Son yıllarda, genom çapında transkripsiyon faktörü bağlama 17&#39;yi sorgulamak için ChIP&#39;i NGS ile birleştiren bir yöntem olan ChIP sıralama (ChIP-sequ) geliştirildi ve bazı durumlarda bir süre içerisinde dinamik değişiklikleri izlemek için 18 , 19 , 20 . Örneğin, sirkadiyen ChIP-seq çalışmaları, sirkadiyen saat bileşenlerinin ve histone belirteçlerinin genomik olarak bağlanmasını düzenleyen, ~ 24 saatlik döngüsel döngü 18 boyunca geçici gen ifadesini sürükleyen, oldukça düzenlenmiş bir dizi ortaya koymuştur. Çoğu mevcut ChIP protokolleri yumuşak dokular ( örneğin karaciğer, beyin vb. ) Için tasarlanmıştır ve skele dahil olmak üzere sert dokular için çok az yayınlanmıştırKas kas. Fiberle zengin iskelet kasını homojenize etmek ve özellikle çapraz bağlanmayı gerektiren ChIP deneyleri için yüksek kaliteli çekirdekleri 21 izole etmek teknik açıdan zorlayıcı bir işlemdir. Yeni bir kas ChIP çalışmasında22, uydu hücreleri miyofiberlerden ayrılmış ve çekirdekler, doku sindirimini içeren uzun bir prosedür aracılığıyla her iki hücre tipinden hazırlanmıştır. İzole edilmiş çekirdekler üzerinde formaldehit çapraz bağlanmadan önce tüm işlemin tamamlanması yaklaşık üç saat sürdü. Bu prosedür kas dokusunu etkin homojenizasyon için daha da dirençli hale getiren ve yüksek kaliteli çekirdekler üretebilen kas lifini çapraz bağlamayı önlerken doku toplanmasından çekirdek çapraz bağlanmaya kadar olan önemli zaman gecikmesi, değişmiş DNA riskini doğurur -protein etkileşimi. Buna karşın, çoğu çalışma deneysel muamele ya da doku toplanması sonrasında gerçek zamanda DNA-proteinin korunması için çapraz bağlama gerçekleştirmiştirN bağlayıcı 12 . Çapraz bağlantıdan önce çekirdek izolasyonunun ikinci bir dezavantajı, tipik olarak 3-4 saat aralıklarla ortaya çıkan sirkadiyal örnek toplama gibi zamana duyarlı uygulamaların engellenmesidir. Çekirdeklerin çapraz bağlanması olmaksızın, izolasyonun kesilme işleminden hemen sonra ilerlemesi gerekirken çapraz bağlı numuneler, tüm zaman çizelgesi tamamlandıktan sonra birlikte işlenebilir ve böylece daha fazla deney tutarlılığı sağlanır. Çapraz bağlanmamış iskelet kasında çekirdek izolasyonu için diğer protokoller de bildirilmiştir. İki çalışma, çekirdekleri kalan miyofibriller ve hücre öpleri 23,24&#39;ten ayırmak için gradyan ultra-santrifüj kullandığını açıkladı. Sükroz veya koloidal gradyent ultra-santrifüj, çapraz bağlanmamış kas dokuları ile etkili olsa da, deneylerimiz, çapraz bağlamadan sonra gradyan ultra-santrifüj işlemi ile çekirdeklerin hücre d&#39;den ayrımında başarısız olduğunu ortaya koymuşturDegrade üzerinde ebris. Bu nedenle, çapraz bağlı fare iskelet kas dokuları kullanarak yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir prosedür geliştirdik. Degrade ultra-santrifüjden ziyade, çekirdeği enkaztan etkili bir şekilde ayırmak için seri bir filtreleme yöntemi geliştirdik. Ultrasonication işlemini takiben, kromatin örnekleri, hedef geliştiricilere bağlanan BMAL1 proteininin sirkadiyen bir modeli gösteren ChIP çalışmaları için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Metodumuz, kas dokularının çeşitli mekanik çalışmalarına genel olarak uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution (0.4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Protease K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Anti-BMAL1 antibody</td><td></td><td></td><td>Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chicken IgY Precipitating Resin</td><td>GenScript</td><td>L00405</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KINEMATICA&amp;nbsp;Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-178</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Dounce tissue grinder</td><td>Whearton</td><td>357544</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 100 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 70 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 40 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 30 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 20 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 10 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50010-03</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S2 Focused-ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>Model S2</td><td></td></tr><tr><td>Labquake&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>CCD Microscope Camera</td><td>&amp;nbsp;Leica Microsystems</td><td>DFC3000 G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent Kit&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA extraction kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a filtration-based method of preparing high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle for chromatin immunoprecipitation

Kromatin immüno çökeltme (ChIP), kromatin DNA&#39;ya bağlanan proteini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Bununla birlikte, fibreden zengin iskelet kası, yüksek kaliteli çekirdeklerin miyofibrillerin en az kirletilmesiyle izole edilmesindeki teknik zorluk nedeniyle ChIP için bir zorluk olmuştur. Önceki protokoller, çekirdeği çapraz bağlamadan önce arıtmaya çalışmış ve bu da uzun çekirdek hazırlama işlemi sırasında değişmiş DNA-protein etkileşimi riskini doğurmuştur. Mevcut protokolde, önce farelerden toplanan iskelet kas dokusunu çapraz bağladık ve dokular kıyılmış ve sonike edildi. Çoğaltılmış kas dokusu kullanarak çekirdekleri miyofibrillerden ayıramadığını buldukumuzdan, önemli miyofibril kontaminasyonu olmayan yüksek kaliteli çekirdekler elde etmek için ardışık bir filtrasyon prosedürü geliştirdik. Daha sonra bir ultrasonatör kullanarak kromatin hazırladık ve anti-BMAL1 antikoru ile yapılan ChIP analizleri, sirkadiyen bağlanmayı sağlamıştırBMAL1 modelinin gen promoterlerini hedeflemesi. Bu filtreleme protokolü, yüksek kaliteli çekirdekleri çapraz bağlı iskelet kası dokusundan izole etmek için kolayca uygulanabilir bir yöntem oluşturur ve sirkadiyen ve zamana duyarlı diğer çalışmalar için tutarlı örnek işlenmesine izin verir. Yeni nesil sıralama (NGS) ile birlikte, yöntemimiz iskelet kası fonksiyonuna odaklanan çeşitli mekanik ve genomik çalışmalar için kullanılabilir.

Burada gerçek zamanlı DNA-protein etkileşimini korumak için doku toplanmasının hemen ardından formaldehit çapraz bağlandı. Bununla birlikte, çekirdek izolasyonu 23 , 24 için yaygın olarak kullanılan sükroz veya koloidal gradyan, çekirdeklerin miyofibrillerden ayrılmasında etkili olmadığını bulmuştur (veriler gösterilmemiştir). Bunun nedeni, çekirdek ve miyofibriller için çapraz bağlantının benzer a?...

Watch this Scientific Journal Video about A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation at JoVE.com

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Çapraz bağlantılı fare iskelet kasında yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için filtrasyon tabanlı bir protokol sunuyoruz ki, ultra-santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırdık ve kolay uygulanabilir hale getirdik. Çekirdeklerden hazırlanan kromatin, kromatin immünopresipitasyonu ve muhtemelen kromatin immünopresipitasyon sıralama çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir.

Kromatin İmmunopresipitasyon için Çapraz Bağlı İskelet Kasında Yüksek Kaliteli Nükleerlerin Hazırlanması İçin Filtrasyona Dayalı Bir Yöntem

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

a-filtration-based-method-preparing-high-quality-nuclei-from-cross

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.8K Görüntüleme.  University of Texas Health Science Center at Houston.  Çapraz bağlantılı fare iskelet kasında yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için filtrasyon tabanlı bir protokol sunuyoruz ki, ultra-santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırdık ve kolay uygulanabilir hale getirdik. Çekirdeklerden hazırlanan kromatin, kromatin immünopresipitasyonu ve muhtemelen kromatin immünopresipitasyon sıralama çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir. 

Video: A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Biyokimya

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Nörobilim

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Tıp

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Biyoloji

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Immunoprecipitation of Target Protein-DNA Complexes from Motor Neuron Lysate

Source: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. <a href="https://app.jove.com/v/61124">High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo).</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates the immunoprecipitation of DNA fragments crosslinked with target protein from stem cell-derived motor neuron lysates using target protein-specific antibody-coated magnetic beads.

Motor Nöron Lizatından Hedef Protein-DNA Komplekslerinin İmmünopresipitasyonu

NOTE: Autoclaved distilled and deionized water (ddH2O) is recommended for making buffers and reaction master mixes.
1. Harvesting and crosslinking cells

	...