Bu protokol, kromatin immünopresipitasyon deneyleri için dondurulmuş karaciğer örneklerinden tekrarlanabilir ve güvenilir kromatin ekstraksiyonu ile sonuçlanır. Başlamak için, donmuş dokuyu içeren tüpü harç içine yerleştirin ve beş dakika boyunca orada bekletin. Daha sonra, daha fazla katı ufalanma kalmayana kadar önceden soğutulmuş bir havane kullanarak numuneye basınç uygulayın.
Numuneyi içeren tüpü harçtan çıkarın. Gerekli inhibitörlerle birlikte 950 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve numune tamamen askıya alınana kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapın. Doku süspansiyonunu derhal homojenizatöre aktarın ve daha ince bir süspansiyon elde etmek için Havaneli A ile 20 ila 30 vuruş uygulayın.
Köpüklenmeyi önlemek için havaneyi sıvı fazın dışına taşımaktan kaçının. Homojenatı daha önce buz üzerinde soğutulmuş 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra tüpü 1.300 G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin.
Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve nazik pipetleme ile peleti 950 mikrolitre oda sıcaklığı PBS'de tamamen askıya alın. Ardından,% 1'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için 63.6 mikrolitre% 16 metanol içermeyen formaldehit ekleyinTüpü hemen oda sıcaklığında 10 dakika döndürün. Döndükten sonra, 125 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için oda sıcaklığında 113 mikrolitre 1.25 molar glisin ekleyin ve tüpü beş dakika daha döndürün.
Daha sonra numuneyi dört santigrat derecede üç dakika boyunca 1.300 G'de santrifüj edin. Supernatanı atın ve gerekli inhibitörlerle 950 mikrolitre buz gibi PBS'de pipetleyerek peleti dikkatlice askıya alın. Numuneyi tekrar santrifüj edin ve daha önce gösterildiği gibi pelet tekrar askıya alın.
Santrifüjleme adımını bir kez daha tekrarlayın ve hemen kromatin izolasyon prosedürüne geçin. Peletin üzerine gerekli inhibitörlerle birlikte 950 mikrolitre Tampon A ekleyin ve pelet tamamen boşalana kadar pipetleyerek hafifçe karıştırın. Ardından tüpü dört santigrat derecede 10 dakika döndürün.
Döndükten sonra, numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2.000 G'de santrifüj edin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peletin üzerine gerekli inhibitörlerle birlikte 950 mikrolitre Tampon B ekleyin ve pelet tamamen yeniden askıya alınana kadar pipetleyerek hafifçe karıştırın. Ardından tüpü dört santigrat derecede 10 dakika döndürün.
Döndürdükten sonra, numuneyi tekrar santrifüj edin. Supernatan'ı çıkarın. Daha sonra pelet ve pipete gerekli inhibitörlerle birlikte 300 mikrolitre oda sıcaklığı Tampon C ekleyin.
Numuneyi 15 ila 30 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, kapaktaki damlaları toplamak için tüpü kısaca döndürün. Kromatin örneğini sonikleştirdikten sonra, 30 mikrolitre% 10 Triton X-100 çözeltisi ve beş ila 10 saniye boyunca vorteks ekleyin.
Numuneyi 16.000 G'de dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik temiz bir tüpe aktarın. 10 ila 25 mikrolitre kesilmiş kromatini yeni bir tüpe aktarın ve 200 mikrolitrelik nihai hacme ulaşmak için Tampon C ekleyin.
Aliquot ve şok, kromatinin geri kalanını bir sonraki kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede dondurur. Beş molar sodyum klorürden sekiz mikrolitre ekleyin ve 1.000 RPM'de sallanırken ısıtma bloğunda 65 santigrat derecede en az altı saat inkübe edin. Mümkünse inkübasyonu gece boyunca uzatın.
Numunelerin oda sıcaklığında beş dakika soğumasına izin verdikten sonra, iki mikrolitre RNase A ekleyin ve 1.000 RPM'de çalkalarken 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Numuneleri ısıtma bloğundan çıkarın ve yedi mikrolitre 300 milimolar kalsiyum klorür ve iki mikrolitre proteinaz ekleyin K.Isıtma bloğundaki numuneleri 56 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe ederken 1.000 RPM'de çalkalayın. Bu arada, her numune için dört santigrat derecede bir dakika boyunca 16.000 G'ye kadar santrifüj ederek bir faz ayırma tüpü hazırlayın.
Tüpleri ısıtma bloğundan çıkardıktan ve üç dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmelerine izin verdikten sonra, numunenin 400 mikrolitresini daha önce santrifüjlü faz ayırma tüpüne aktarın. Daha sonra, 400 mikrolitre fenol kloroform izoamil alkol çözeltisi ve beş saniye boyunca vorteks ekleyin. Tüpü 16.000 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin.
Sonra beş saniye boyunca 400 mikrolitre kloroform ve vorteks ekleyin. Tüpü beş dakika daha santrifüj edin ve üst fazın 400 mikrolitresini, 24 mikrolitre beş molar sodyum klorür ve 0.75 mikrolitre glikojen içeren yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Sonra kısaca tüpü vorteks.
1.055 mikrolitre% 100 etanol ekleyin. Daha sonra iyice vorteks yapın ve numuneyi bir saat boyunca eksi 80 santigrat derecede veya gece boyunca eksi 20 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, numuneyi 16.000 G'de dört santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj edin ve peleti yerinden çıkarmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın.
500 mikrolitre soğuk% 70 etanol ekleyin ve peletin yıkandığından emin olmak için tüpü hafifçe eğin. Tüpü 16.000 G'de dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüj edin. Tüm süpernatantı dikkatlice çıkarın ve peletin oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
Alternatif olarak, daha hızlı kuruma için tüpü 37 santigrat derecede inkübe edin. 50 mikrolitre Tris-EDTA çözeltisi ekleyin ve tüpü 300 RPM'de çalkalayarak beş ila 10 dakika boyunca ısıtma bloğuna koyun. Daha sonra DNA'yı% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde analiz edin.
Kromatinin çapraz bağlanmasından ve DNA'nın agaroz jeli üzerinde görselleştirilmesinden sonra, başarılı kesme, 100 ila 300 baz çifti aralığında fragmanların varlığı ile tanınabilir. Kromatin, H3K4 trimetilasyon, H3K27 asetilasyon ve H3 K27 trimetilasyon antikorları ile başarılı bir şekilde çökeltildi ve qPCR ile daha fazla analiz edildi. Karaciğerde aktif olarak transkribe edilen kromozom bir açık okuma çerçevesi 43, proteazom 20S alt birimi beta iki ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz promotör bölgeleri, H3K4 trimetilasyon ve H3K27 asetilasyon için zenginleştirme göstermiştir.
Buna karşılık, homeobox C13, homeobox C12 ve karaciğerde susturulan fare miyelin transkripsiyon faktörü bir promotör bölgesi beklendiği gibi zenginleştirilmemiştir. H3 K27 trimetilasyon zıt davranışı gösterir, böylece kromatin immünopresipitasyonunun veya ChIP testinin başarısını doğrular. Kromatin başarıyla ChIP-Seq'e tabi tutuldu.
Sıralamadan sonra, sazlar önceden hazırlanmış bir indekse hizalandı ve türlere göre ayrıldı. Beklendiği gibi H3K27 trimetilasyon birikimi ile antagonize edilen gen transkripsiyon başlangıç bölgelerinde H3K4 trimetilasyon ve H3K27 asetilasyon birikimi. Hox C kümesi, hem fare hem de insan karaciğerlerinde transkripsiyonel olarak inaktif olduğu için bilinir.
H3K4 trimetilasyon ve H3K27 asetilasyonunun profillenmesi, kümenin dışındaki bu iki translasyonel sonrası modifikasyon için zirveler gösterirken, H3K27 trimetilasyonunun sinyal yoğunluğu gen kümesi içinde artma eğilimindedir. Dondurulmuş doku örneklerinden kromatin ekstraksiyonu, çapraz bağlama sırasında hücre süspansiyonu inceliğine ve sıcaklığına güçlü bir şekilde bağlı olarak yüksek içsel değişkenliğe sahiptir. Sabit laboratuvar koşullarının sağlanması, parça boyutu aralığının tekrarlanabilirliğinin korunmasına yardımcı olur.
