Vondriska laboratuar NIH ve UCLA Laubisch Endowment Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe tarafından desteklenmektedir. EM UCLA Fizyoloji Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship alıcısı olduğunu; HC Amerikan Kalp Derneği Pre-doktora bursu sahibidir; MP bir NIH Ruth Kirschstein Doktora Sonrası Bursu alıcı olması ve SF alıcısı bir NIH K99 Ödülü.

Deneysel akışı yedi önemli adımlar (Şekil 1). Kütle spektrometresi üzerinde çalıştırmak olacaktır örnekler içeren herhangi bir iş için, deneyci bir laboratuvar önlüğü, eldiven ve saç filesi giymek ve toz ve keratin kişisel dökülme kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için özen göstermelisiniz. 1. Kalp Homojenizasyon ve Nükleer İzolasyon Fare kalpleri homojenize edilir ve bir bozulmamış çekirdekler pelet (Şekil 2) izole edilir. <ol><li> , Yetişkin fare Kurban tüketim kalp, buz gibi soğuk PBS içinde yıkayın ve 2 ml içeren (biz Fisher Wheaton Doku Öğütücü, # 08-414-13A tercih, ancak diğer yöntemler eşit derecede iyi çalışır olabilir) cam Dounce buz üzerinde homojenize lizis tamponu (10 mM Tris, pH 7.5, 15 mM NaCI ve% 0.15 v / v Nonidet P-40 [NP-40], deiyonize su içinde artı (diferansiyel olarak çekirdek içeren organel üzerinde hücre zarı lysis oluşumunu hipotonik bir çözeltisi) proteaz ve fosfataz inhibitor karışım: 10 mM sodyum butirat, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluorür [PMSF], 0.2 mM 3 VO 4, 0.1 mM NaF, 1 Roche proteaz pellet/10 ml, Na - lizis tamponu -20 ° C&#39;de bir hafta kadar saklanabilir ). (Not: Biz kütle spektrometresi veri olarak, PBS ile kalpleri serpmek için gerekli bulmak ve analiz ağırlıklı kardiyomiyosit kan kontaminasyonu aksine kökenli [p-değeri 3.8E-22] [p değeri 5.0 olarak proteinleri tespit GO yok E-2].) </li><li> 100 mikron süzgecinden lizat dökün ve 1.5 ml santrifüj tüp yoluyla akışını toplamak. Belirtilmediği sürece, bu noktada, örnek buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 4000 rpm&#39;de santrifüje </li><li> Süpernatantı. (Bu sitozolüne ve -80 saklanmalıdır ° C. parçalanan mitokondri içerir.) Yeniden süspanse pelet triturating tarafından 200 ul lizis tamponu. (Bu ham Nükleer pellet olduğunu.) </li><li> Sakaroz buff 1 ml 1.5 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne DolguER (% 24 sakaroz ağırlık / hacim, 10 mM Tris, pH 7.5, proteaz ve / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde 15 mM NaCl - sakaroz tampon kullanımının gününde taze yapılmış olmalıdır). 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 5000 rpm&#39;de santrifüj ve sakaroz ped üzerine yavaşça tabaka yeniden süspanse topak </li><li> Üstüne ince bir film olarak sakaroz tampon (membran içeren) çıkarın. 200 ul buz gibi soğuk PBS / EDTA (1 mM EDTA ile 1 x PBS) ile geriye kalan topak durulayın. (Bu çekirdekler pelet ve blot batı veya elektron mikroskobu kullanımı için çözündüğünü veya sabit olabilir [adımları 4.1 ve 4.2 &#39;ye bakınız] zenginleştirme ölçmek için.) </li></ol> 2. Çekirdek plazması ve Deterjan-ekstrakte kromatin Fraksiyonasyon Ham topak gevşek çekirdekleri DNA ile ilişkili proteinler ihtiva eden bir çekirdek plazması ve deterjan ile ekstre kromatin fraksiyon ayrılır. <ol><li> 200 ul deterjan ekstraksiyon tamponu (2 adım 1.6 pelet Karışım0 mM HEPES pH 7.6, 7.5 mM MgCI2. 0.2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M üre,% 1 proteaz / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde NP-40 - deterjan ekstraksiyon tampon çözeltisi) -20 ° C&#39;de bir hafta için saklanır. </li><li> Vortex örnek 2 kez, 10 sn her. Buz 10 dakika yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 13,000 rpm&#39;de santrifüje </li><li> Süpernatantı. (Bu çekirdek plazması ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir). Buz gibi soğuk PBS / EDTA ile pelet durulayın. (Bu kromatin pelet olduğunu.) </li><li> Tris, SDS, EDTA tampon azından bir hafta için hafızada saklanması - 300 ul Tris, SDS, EDTA tampon maddesi (50 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, proteaz / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde% 1 SDS içinde pelet Karışım -20 ° C). </li><li> 10 sn her DNA kırmak için 3-6 kez sonikasyon. Sonications arasındaki buz üzerinde örnek tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 13,000 rpm&#39;de santrifüje Süpernatant tutun. (Süpernatant deterjan-Ayıklanan kromatin protein fractio olduğunun ve -80 ° C) sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. Geri kalan topak az olmalıdır, ve atılabilir. </li><li> % 10 fetal bovin serumu (FBS) ile Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM),% 1 insülin kültür ardından enzimatik sindirimi ile doğumdan hemen sonra yavruların sıçan bir gün neonatal fare ventriküler miyositlerde izolat yerine bütün izole edilmiş kalp miyositleri kullanılıyorsa transferrine sodyum selenit (ITS), ve% 1 penisilin. 24 saat sonra, serum serbest medya (yukarıdaki gibi aynı, ama FBS eksik) transfer. Hasat lizis tamponu hücreleri (1.1 listelenen), ve adım 1.3 nükleer fraksiyon başlar. </li></ol> 3. Asit-ekstraksiyon Fraksiyonu - DNA-bağlı protein Zenginleştirme Histon gibi sıkıca DNA&#39;ya bağlı proteinler için ayrı bir fraksiyon zenginleştirir. <ol><li> Adımları 1,1-2,4 tekrarlayın. </li><li> 0,4 N sülfürik asit 400 ul kromatin pelet Karışım. Kümeleri kaldırmak için Vortex. </li><li> 30 dk ya da overn için 4 ° C sıcaklıkta inkübeight dönerken. </li><li> 4, 10 dakika için 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin ° C Nükleer tortularını çıkarmak üzere. </li><li> Taze bir tüp supernatant aktarın. </li><li> Trikloroasetik asit 132 ul süpernatanına açılan akıllıca ekleyin. Birkaç kez Invert. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin </li><li> Süpernatantı atın. Yavaşça buz aseton ile pelet durulayın. (Bu histon pelet olduğunu.) </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin </li><li> Yıkama tekrarlayın, 3,8-3,9 adımları. </li><li> Hava kuru pelet. </li><li> Tris, SDS, EDTA tamponu ve 100 ul içinde pellet yeniden süspanse edin. 1 M Tris ilave edilerek pH 8 ayarlayın. (PH ayarlı olmayan bir 1 M Tris stoğu kullanın.) </li><li> 15 dakika süreyle su banyosunda sonikasyon. Su banyosu, buz ekleyerek aşırı ısınmayı önleyin. (Bu asit-Ayıklanan fraksiyonu ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir) </li></ol> 4. Saflık Fiyatları Western blot ve elektron mikroskobuçekirdekleri ve diğer organellerin tükenmesi başarılı zenginleştirme onaylayın. Aşağıdaki kalite kontrol testleri için tüm tipik sonuçlarını görmek için, bizim önceki yayın bakın. 18 <ol><li> Western blot analizi gerçekleştirin. Histon H2A veya nucleoporin P62 (zenginleştirme doğrulamak için nükleer işaretleri gibi) ve adenin nükleotid taşıyıcı, bip ve tubulin (mitokondriyal bir işaretleyici, endoplazmik retikulum işaretleyici ve sırasıyla saflığını doğrulamak için sitoskeletal belirteç olarak) her fraksiyonu içeren Prob membran. Histon H3 veya fibrillarin (deterjan ve asit-Ayıklanan kromatin ve bozulmamış çekirdeği) ve SNRP70 veya E2F (çekirdek plazması) için çekirdekler, prob başarılı subfractionation doğrulamak için. Retinoblastom veya hipoksi indüklenebilir faktör-1 (asit-Ayıklanan fraksiyonu üzerinde deterjan-ekstre kromatin zenginleştirilmiş) için prob. HeLa hücre lizat ve bütün kalbi lizat Ek kontrol örnekleri de aynı jel çalıştırmak olabilir: Tris, SDS, ED ekleyerek HeLa hücre lizat kumandayı hazırlayınKültür çanak ve örnek toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak TA tamponu. Sonikasyon ve adımları 2,6-2,7 olarak örnek santrifüj. 2 ml tampon (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA,% 1 Triton X-100, 2.5 mM sodyum pirofosfat, deiyonize su içinde 1 mM gliserofosfat olarak kalp homojenleştirici tarafından bütün kalp lisatı kontrol hazırlanması Proteaz ve fosfataz inhibitörü karışımı ile). Sonikasyon ve adımları 2,6-2,7 olarak santrifüj. SDS-PAGE protein örneklerinin hazırlanması için adım 5&#39;e bakınız. </li><li> Elektron Mikroskopi:% 2 gluteraldehit içeren lizis tamponu adım 1.6 çekirdekler pelletini tekrar ve 4 örnek düzeltmek ° C Osmik asit örnekleri durulayın, kurutmak ve epoksi reçine gömün. Bir Reichert ULTRACUT ultramicrotome kullanılarak 70 nm dilimleri kesin. JEOL 100CX Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanılarak uranil asetat ve kurşun ve görüntü örnekleri Leke. Görüntülü malzemenin toplam alana karşı sağlam çekirdeklerin alanı ölçerek zenginleştirme ölçmek. Biz çekirdeklerin% 60-80 bulabilirsinizsağlam olması. 14. </li></ol> Çekirdekler zenginleştirici karşı arındırıcı için önemli hususlar. Bu protokol hastalık sırasında genel gen düzenleme süreçlerine eğitim amacıyla kardiyak kromatin proteomik analizler için geliştirilmiştir. Bütün-proteom kütle spektrometresi deneyler tasarlama önemli bir bileşeni dinamik aralık ve düşük bolluk proteinleri tanımlamak ve karakterize etmek edememek konudur. Çekirdeklerin daha subfractionation yaptığı gibi nükleer proteom için zenginleştiren, nükleer ve kromatin özgü biyolojisi hakkında bilgi sağlama temel amacı ek olarak, bu düşük bolluk proteinleri tespit ihtimali artar. Tartışıldığı gibi Bununla birlikte, yetişkin kardiyomiyosit nükleer membran bağlanmış bir yoğun sitoskeletal bileşeni vardır. Biz tamamen bu diğer hücresel bileşenler çekirdekler saflaştırılmış olduğunu inanmıyorum. Ancak, çekirdeklerin sadece zenginleştirerek, biz elde vared analiz türlerini etkinleştirmek için kabul edilebilir eşik nitelendirdi. Özellikle, bizim ham çekirdekler pelet saflığını değerlendirmek için EM kullanılmaktadır ve bozulmamış kabaca% 10 mitokondri çekirdeklerinin ve dinlenme enkaz olmak fraksiyonu% 60-80 bulduk. Ayrıca, sağlam çekirdeklerin nüfus önceki çalışmamızda, tanıdığımız birçok kas lifçikleriyle bu protokolün bazı proteinler (calsarcin-1) zenginleştirilmiş (Batı ile ölçülen tübülin ve aktin dahil), gerçek bir biyolojik nüfus önererek zenginleştirilmiş değil ise kardiyak çekirdeklerin bu proteinler. 19. Buna ek olarak, bu gen ontoloji göre, bu proteinlerin tahmin rolleri, asit-Çıkartılan kromatin fraksiyonunda mevcut olduğu bulunmuştur proteinleri karşılaştırılmaktadır. Önemlisi, bu gen ontoloji analiz hesabı farklı proteinlerin göreceli bolluk (bizim Western blot verileri gibi) dikkate almaz değil, tespit edilen tüm proteinleri (zenginleştirmek sayareşit olarak ed veya değil) ortak yollar ve hücresel bölümlerin belirlenmesi. Bu yolların ve hücresel bölümlerin analizi bizim daha önceki yayınlarda bulunabilir. 18,20 En önemlisi, asit-Çıkartılan kromatin fraksiyonu içinde zenginleştirme başarısı bize erişkin fare histon miyosit 54 varyantlarının varlığı, 18 tespit izin birçoğu belirlenmesi için bir benzersiz peptid dayanıyordu ve bu zenginleştirme protokol toplam kardiyomiyosit proteom muazzam karmaşıklığı verilen olmadan böylece olasılıkla saptanabilir olmazdı. Bu, kardiyak atom çekirdeklerinden gelen tespit 1.048 proteinleri, n = 56 (% 5.3) nükleozom parçası (ilgi çekirdek bir bileşeni) olarak analiz GO açıklamalı edildi. Bütün kalp bakarak başka bir çalışmada, sadece 11 proteinler (% 0.18) nükleozom 21 parçası olmak için açıklamalı almış olup, 6.180 proteinler tanımlanmıştır. Bu, daha ileri meaningfu için protokol gücünü tariflly nükleer proteinler için zenginleştirmektedir. 5. Protein Jel ve Enzimatik Protein Digest Proteinler kütle spektrometresi üzerinde çalıştırmak için sindirilmiş tek boyutlu SDS-PAGE ve tripsin ile ayrılır. <ol><li> Buz üzerinde örnekleri çözülme ve bicinchoninic asit (BCA) protein deneyi kullanılarak her numune için protein konsantrasyonu belirlenir. </li><li> Tek boyutlu SDS-PAGE için -20 ° C &#39;de 10 dakika ve saklamak için 5x Laemmli tampon, kaynatma ile, bilinen bir konsantrasyon için örnekler seyreltilir. İki-boyutlu jeller için -20 ° C &#39;de üre ekstraksiyon tamponu ve depo ile, bilinen bir konsantrasyon için örnekler seyreltilir. </li><li> Her kulvarda protein eşit miktarda yükleme seçim jel çalıştırın. Protein Western blotting (adımda olduğu gibi 4.1 &#39;de kontrol grubu) ya da şeritler kütle spektrometri analizi için kesilmiş olabilir için kullanılmak üzere bir nitroselüloz zarına transfer edilebilir; aşağıdaki adımları bkz. </li><li> Temiz bir kaba aktarmak için deiyonize su kullanılarak cihazdan jel çıkarın.Oriole jel leke ve ışık engellemek için alüminyum folyo ile sarın konteyner örtün. Jel en az 90 dakika süreyle bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında inkübe izin verin. </li><li> UV ışığı, ve bantlar görüntü üzerinde kesilecek işareti kullanarak Görüntü Oriole lekeli jel (Şekil 3). Biz toplam proteom ölçüm çalışmaları için yaklaşık 25 2 mm bantlar halinde her kulvarın kesti. </li><li> Temiz bir yüzeye jel yerleştirin. Mühürlü tutulmuştur veya keratin kontaminasyonu engellemek için etanol ile püskürtülür sadece malzeme kullanın. Her band Kes, ve daha fazla 3 eşit parçaya dilimleyin. Kendi etiketli 1,5 ml tüp içine birlikte her grubun her üç parçalarını yerleştirin. Jel adet birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Enzimatik sindirim için jel fişler hazırlayın. Özet jel parçalar 37 ° C&#39;da gece boyunca tripsin kullanarak. Detaylı jel örneği protokolü için bizim önceki yayın bkz. 22. Sen tripsin yerine kimotripsin ile düşük molekül ağırlıklı bantları sindirebilir,histon kuyruklarının tripsin kapsamlı bölünme ortadan kaldırmak için. </li></ol> 6. Kütle Spektrometresi ve Veri Analizi Örnekleri LC üzerinde ayrılır ve MS / MS ile analiz edilmiştir. Spektrumu protein tespiti için bir protein veri tabanı karşısında aranır. <ol><li> LC / MS / MS ile her bir örnek 10 ul çalıştırın. Biz 75 mikron ters faz kolon ile nano-akış Eskigent LC kullanın. Protein ve peptidlerin bir dizi için optimize LC işletilen kullanın. Mobil faz bir doğrusal gradyan çalıştırmak A (% 0.1 formik asit,% 2 su içinde asetonitril [ACN]), mobil faz B (% 0.1 formik asit, ACN içinde% 20 su):% 5 mobil fazB 50-60 dakika % B, daha sonra en az% 50, B% 95 B, 15 dakika% 95 ve sabit b, son olarak 10 dakika 200 nl / dak &#39;lık bir akış hızı kullanın. Bir veri bağımlı modunda kütle spektrometresi verileri edinin. Biz iyi 6 en bol ebeveyn iyonları parçaladı bir Thermo Orbitrap kullanın. </li><li> Tekrar en az üç biyolojik için çalışır ve iki teknik çoğaltır. (Recommended) </li><li> Bir arama algoritması (örneğin SEQUEST veya MASCOT gibi) aracılığı ile tercih Uniprot veritabanı karşı spektrumları aramak için; (kamuya açık seçenekleri Prowl dahil, X Tandem, SpectraST! Piyasada mevcut seçenekleri BioWorks ve Xcalibur dahil) yazılımını kullanın. </li><li> Sistein carbamidomethylation ve metionin oksidasyonu, örnek işleme sırasında oluşturulan iki genel değişiklikler için izin vermek için arama parametrelerini değiştirerek düşünün. </li><li> Ters veritabanı arama kullanarak bir yalancı pozitiflik oranı hesaplayınız. </li><li> Bir eşik güven maçlar sadece kabul etmek için protein kimlik filtreleyin. Biz başlatmak için aşağıdaki parametreleri de tavsiye: Xcorr&gt; 3 (+2),&gt; 4 (+3),&gt; 5 (+4); deltaCN&gt; 0.1, uzlaşma skoru ≥ 20, ebeveyn iyon kütle toleransı 2 Da, kütle toleransı ürün iyon 0.5 Da, en az 2 benzersiz başına protein peptitleri ve en fazla 3 bölünmelere kaçırdı. </li></ol> 7. Etiket serbest Kantifikasyonu Deteetiketsiz miktarının (Şekil 4) kullanılarak protein nispi bolluk rmine. <ol><li> Yazılım programları bir dizi sayımı (Prof. Yates grubu), 23 Elucidator (Microsoft), 24 elek (Thermo Scientific), 25 İskele (Proteome Software) dahil olmak üzere, kütle spektrometrisi verileri etiketsiz miktarının belirlenmesi için yayım ya da ticari olarak temin edilebilir. 26 Bu programlar, bozulmamış peptidler ya da iki ya da daha fazla durum arasında nispi bir protein miktarları ile peptid sıralama olayların sayısı, kütle spektrometrik sinyalin korelasyon amaçlamaktadır. </li><li> Her bir program benzer bir analiz boru hattı içeriyor olsa da, bazı programları veri gerçekleştirilebilir spesifik analiz tipleri ile sınırlıdır. Başlangıçta, farklı ishal veri hizalanır, sinyal yoğunluğu normalize edilir ve peptid zirveleri analizi için seçilir. </li><li> En yaygın iki yöntem spektral sayma veya LC-MS pik alanı esas miktar vardır. Bollukoranları farklı gruplar arasında peptit bereket değişiklikleri belirlemek için hesaplanır. </li><li> Bu programlar protein tanımlama miktar bilgileri ilişkilendirmek için proteomik arama algoritmaları (Maskot, Sequest, X! Tandem) ile arabirim olabilir. </li><li> Hem biyolojik (farklı deney örnekleri) ve teknik (kütle spektrometresi üzerinde birden çok kez aynı örnek çalışan) dahil etmek önemlidir verilerin doğruluğu ve tekrarlanabilirliği sağlamak için kitle spec veri çoğaltır. </li><li> Ve deneysel koşullar arasında peptit bolluk değişimi ANOVA ile değerlendirildi ve PCA (Şekil 5) ile çizilebilir. </li></ol> Etiket serbest ölçümü için önemli noktalar. Etiketi içermeyen niceliklendirme yaparken, özel önem her numune işleme ve ayrı ayrı analiz edilmelidir tutarlı örnek hazırlama, sindirim süresi ve LC-MS/MS koşulları sağlamak için verilmelidir. Met aksine(etiketleme eksikliği onları bir arada çalışan olasılığı ortadan kaldırır çünkü) abolic etiketleme yaklaşımlar, etiket içermeyen deneylerde karşılaştırmalar böylece (numune hazırlık yani, numune analizleri tüm yönleriyle yüksek tekrarlanabilirlik gerektiren, farklı kütle spektrometresi çalışan veri yapılır LC ve MS adım) ve yüksek kütle doğruluğu kütle spektrometre kullanımı. Numune hazırlama ve analiz bilinen bir standart olarak küçük değişiklikler dikkate almak için verilerin normalleştirilmesi yardımcı olmak için her bir örnek için ilave edilebilir. Ayrıca, çoğu yazılım programları enjeksiyon, iyonizasyon ve parçalanma farklılıkları hesaba katmak için veri toplama sonra sinyal şiddetleri arasında normalleşme (arka plan gürültü veya bilinen bol analit ayarlayarak gibi) izin verir. Hizalama algoritması peptid elüsyon profilleri farklılıkları düzeltmek yardımcı yukarıda referans olarak yazılım programları çoğu bulunmaktadır. Biyolojik ve teknik çoğaltır kullanımı olup essenBu istatistiksel analizler protein bolluk içinde gözlenen değişikliklerin tekrarlanabilirlik ve tutarlılığını doğrulamak için izin vermesi, çalışmanın bu tip uzaysal.

<ol>
	<li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development.">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li><li>Rumyantsev, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelations+of+the+proliferation+and+differentiation+processes+during+cardiact+myogenesis+and+regeneration.">Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration.</a> Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).</li><li>Olson, E. N., Schneider, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+up+the+heart:+development+redux+in+disease.">Sizing up the heart: development redux in disease.</a> Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).</li><li>Molkentin, J. D., Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+signaling+pathways+that+regulate+cardiac+hypertrophy.">Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy.</a> Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).</li><li>Fishman, M. C., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fashioning+the+vertebrate+heart:+earliest+embryonic+decisions.">Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions.</a> Development. 124, 2099-2117 (1997).</li><li>Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Return+to+the+fetal+gene+program+protects+the+stressed+heart:+a+strong+hypothesis.">Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis.</a> Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).</li><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li><li>Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+proteins+with+potential+disease+links+found+by+subtractive+proteomics.">Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics.</a> Science. 301, 1380-1382 (2003).</li><li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks.">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li><li>Malik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+and+lamin-dependent+targeting+of+novel+transmembrane+proteins+in+the+nuclear+envelope.">Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).</li><li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic,+nuclear,+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain.">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).</li><li>Chu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+chromatin+proteomics+identifies+evolutionarily+conserved+fertility+factors.">Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors.</a> Nature. 443, 101-105 (2006).</li><li>Uchiyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+human+metaphase+chromosomes.">Proteome analysis of human metaphase chromosomes.</a> J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).</li><li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy.">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse:+combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling.">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li><li>Moore, D. H., Ruska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+study+of+mammalian+cardiac+muscle+cells.">Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells.</a> J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).</li><li>Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+cardiac+hypertrophy:+a+quantitative+ultrastructural+study+in+the+compensatory+stage.">Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).</li><li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy.">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).</li><li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy.">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li><li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth.">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses.">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li><li>Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+Identify+Proteins+Interacting+with+P2X2+Ligand-Gated+Cation+Channels.">Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels.</a> J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).</li><li>Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+software+tool+for+mass+spectrometry-based+proteomics.">A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).</li><li>Kamleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+using+Orbitrap+Fourier+transform+mass+spectrometry+with+hydrophilic+interaction+chromatography:+a+method+with+wide+applicability+to+analysis+of+biomolecules.">Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).</li><li>Searle, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold:+a+bioinformatic+tool+for+validating+MS/MS-based+proteomic+studies.">Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies.</a> Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).</li><li>Murray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Proteins+of+Cell+Nuclei.">The Basic Proteins of Cell Nuclei.</a> Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).</li><li>Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fractionations+of+arginine-rich+histones+from+calf+thymus.">Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus.</a> Biochem. J. 77, 631-636 (1960).</li><li>Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+methods+for+purification+of+histones+from+cultured+mammalian+cells+with+the+preservation+of+their+native+modifications.">Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications.</a> Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).</li><li>Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+of+high-mobility-group+proteins+in+the+nucleus+and+cytoplasm+of+several+rat+tissues.">Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues.</a> J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).</li><li>Gronow, M., Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+separation+of+the+non-histone+proteins+of+rat+liver+nuclei.">Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei.</a> FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).</li><li>Mischke, B. G., Ward, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+tissue+specificity+of+chromatin-associated+proteins+in+Vicia+faba.">Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba.</a> Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).</li><li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+proteomic+analysis+of+the+human+nucleolus.">Directed proteomic analysis of the human nucleolus.</a> Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).</li><li>Zhao, Y., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification-specific+proteomics:+strategies+for+characterization+of+post-translational+modifications+using+enrichment+techniques.">Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques.</a> Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).</li><li>Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unrestricted+identification+of+modified+proteins+using+MS/MS.">Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS.</a> Proteomics. 10, 671-686 (2010).</li><li>Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+proteomic+characterization+of+combinatorial+post-translational+modification+patterns.">Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns.</a> Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).</li><li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes.">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protease+for+'middle-down'+proteomics.">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics.">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Nükleer izolasyonu için iki temel yolu önceden gözden geçirilmiştir: 27 tek bir sulu sakaroz / tuz çözeltisi içinde doku homojenleştirici bir sulu olmayan çözücü içinde liyofilize doku homojenleştirici arasında Behrens teknik ve ikinci olarak, burada kullanımı olan bir değişiklik, bir izlenen diferansiyel veya yoğunluk gradiyenti santrifüj yoluyla. Doku örnekleri asit ekstraksiyon ile çekirdeklerin Subfractionation histon analiz olmanın orijinal amacı il...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Dulbeco Modifiye Kartal Orta </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Proteaz pelet </td><td> Roche </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100 mikron süzgeçli </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> ULTRACUT ultramicrotome </td><td> Reichert </td><td></td></tr><tr><td> 100CX Transmisyon Elektron Mikroskop </td><td> JEOL USA, Inc </td><td></td></tr><tr><td> Sarıasma kuşu </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> Histon H2A antikor </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8648 </td></tr><tr><td> Nucleoporin P62 antikor </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> Adenin Nucleogelgit taşıyıcı antikor </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-9299 </td></tr><tr><td> Bip antikor </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-1050 </td></tr><tr><td> Tubulin antikoru </td><td> Sigma </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> Histon H3 antikor </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> Fibrillarin antikor </td><td> Hücre Sinyal </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 antikor </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1 antikoru </td><td> Thermo Fisher </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> Retinoblastom antikor </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> Hipoksi indüklenebilir faktör-1 antikoru </td><td> Novus Biyolojik </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCA protein tayini </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23227 </td></tr><tr><td> Faz kolon Ters </td><td> Yeni Objuygulamada etkili </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> BioWorks Tarayıcı </td><td> Thermo Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of chromatin proteomes in disease

Çekirdeğin içinde olan fonksiyonlar en yakından gen regülasyonu ile bağlantılı proteomlarda bulunur. Erişkin memeli kardiyomiyosit çekirdeklerinin nükleuslu hücrelerin oranı yüksek, 1 DNA ağırlıklı heterokromatik durumu nedeniyle benzersizdir ve geliştirme sırasında interfaz kalıcı bir devlet yetişkin çekirdekleri işler kardiyomiyosit-olmayan bölünmesi doğası. 2 Transkripsiyonal düzenleme ve Hastalığın sıra bu proteinlerin hastalığı sırasında meydana transkripsiyonel programları değişiklikleri kontrol nasıl bu organ, 3-5 okudu ama ne nispeten keşfedilmemiş kalır DNA paketlenmesi ve ifade sorumlu nükleer proteinler oynadığı rol ve oylandı. 6 geliştirilen yılında dünya, kalp hastalığı erkekler hem de kadınlar için ölüm bir numaralı nedenidir. nükleer proteinleri bu hastalığın ilerlemesini düzenleyen işbirliği nasıl 7 Insight güncel tedavi o ilerleyen için kritikeçenekler. Kütle spektrometresi bu hastalıkla nasıl bu proteinlerin bolluğu değişiklikler için nükleer proteom ve göreli kantifikasyon tarafsız bir açıklama sağlayan bu soruların iletilebileceği ideal bir araçtır. Son zamanlara kadar memeli nükleer protein kompleksleri, 8-13 için çeşitli proteomik çalışmalar varken 14 kardiyak nükleer proteom inceleyen sadece bir çalışma olmuştur ve oldukça nükleer alt bölmeleri düzeyinde proteom keşfetmek yerine, tüm çekirdek olarak kabul . Büyük bir kısmı 15, bu iş sıkıntısı kardiyak çekirdeklerin tecrit zorluk kaynaklanmaktadır. Kardiyak çekirdekler miyosit daralma değiştiren kendi genel şekli. 16 Ayrıca, kardiyomiyositlerde hacmi 17 ile% 40 mitokondri olduğu ölçüde, onlar endoplazmik retikulum birden uzantıları aracılığıyla bağlı bir katı ve yoğun aktin-miyozin aygıtı içinde ortaya çıktığı Necessitadiğer organeller dışında çekirdeğin zenginleştirme tes. Burada biyolojik ilgili bölmeye kardiyak nükleer zenginleştirme ve daha fazla fraksiyonasyon için bir protokol açıklar. Ayrıca, metabolik etiketleme mümkün değildir çeşitli hayvan modelleri ve organ sistemleri in vivo deneyler için mükellef bu fraksiyonların-teknikleri etiketi ücretsiz kantitatif kütle spektroskopisi diseksiyon için detaylı yöntemleri.

Şekil 4 Göreceli ölçüm bu formun programı vurgular. Sol paneldeki Gösterildi protein HMGB1 (veritabanı araması yoluyla tanımlanır) ait olarak atanmış tek tek izotoplu peptid zirveleri (farklı fareler bindirilmiş) vardır. Her bir tepe noktası, aslında belirli peptit için bir ekstre iyon kromatografisi, farklı bir fare gelir. Üç biyolojik her grup için tekrarlı, bazal, kardiyak hipertrofi ve kalp yetmezliği: grup üç farklı fizyolojik durumları temsil eder. Eğrinin altında ka...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease at JoVE.com

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca uygulanabilir<em&gt; In vivo</em&gt; Insan hastalık modelleri.

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

quantitative-analysis-of-chromatin-proteomes-in-disease

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K Görüntüleme.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca uygulanabilir In vivo Insan hastalık ...

Video: Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex process that can involve many tissue types, span variable time periods, and often occur deep within organs, making it difficult to investigate and quantify. In addition, the efficacy of the metastatic process is influenced by multiple steps in the metastatic cascade making it difficult to evaluate the contribution of a single aspect of tumor cell behavior. As a consequence, metastasis assays are frequently performed in experimental animals to provide a necessarily realistic context in which to study metastasis. Unfortunately, these models are further complicated by their complex physiology. The chick embryo is a unique in vivo model that overcomes many limitations to studying metastasis, due to the accessibility of the chorioallantoic membrane (CAM), a well-vascularized extra-embryonic tissue located underneath the eggshell that is receptive to the xenografting of tumor cells (figure 1). Moreover, since the chick embryo is naturally immunodeficient, the CAM readily supports the engraftment of both normal and tumor tissues. Most importantly, the avian CAM successfully supports most cancer cell characteristics including growth, invasion, angiogenesis, and remodeling of the microenvironment. This makes the model exceptionally useful for the investigation of the pathways that lead to cancer metastasis and to predict the response of metastatic cancer to new potential therapeutics. The detection of disseminated cells by species-specific Alu PCR makes it possible to quantitatively assess metastasis in organs that are colonized by as few as 25 cells. Using the Human Epidermoid Carcinoma cell line (HEp3) we use this model to analyze spontaneous metastasis of cancer cells to distant organs, including the chick liver and lung. Furthermore, using the Alu-PCR protocol we demonstrate the sensitivity and reproducibility of the assay as a tool to analyze and quantitate intravasation, arrest, extravasation, and colonization as individual elements of metastasis.

Using quantitative PCR, we demonstrate how the well-established chick CAM model can be used to quantitatively analyze the metastasis of human tumor cells to distant organs.

Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

Tıp

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Fare Akciğer Entübasyonun Basit Bir Yöntem

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

İskelet Kası Hastalığının kantitatif Manyetik Rezonans Görüntüleme

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible for phagocytosis and clearance of debris and detritus. These cells include CNS-resident macrophages known as microglia, and mononuclear phagocytes infiltrating from the periphery. Light microscopy has generally been used to visualize phagocytosis in rodent or human brain specimens. However, qualitative methods have not provided definitive evidence of in vivo phagocytosis. Here, we describe quantitative 3D in silico modeling (q3DISM), a robust method allowing for true 3D quantitation of amyloid-&#946; (A&#946;) phagocytosis by mononuclear phagocytes in rodent Alzheimer&#39;s Disease (AD) models. The method involves fluorescently visualizing A&#946; encapsulated within phagolysosomes in rodent brain sections. Large z-dimensional confocal datasets are then 3D reconstructed for quantitation of A&#946; spatially colocalized within the phagolysosome. We demonstrate the successful application of q3DISM to mouse and rat brains, but this methodology can be extended to virtually any phagocytic event in any tissue.

Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer&#039;s Disease

We developed a methodology for quantitative 3D in silico modeling (q3DISM) of cerebral amyloid-&#946; (A&#946;) phagocytosis by mononuclear phagocytes in rodent models of Alzheimer&#39;s disease. This method can be generalized for the quantitation of virtually any phagocytic event in vivo.

kantitatif 3D<em&gt; Siliko</emAlzheimer Hastalığının Kemirgen Modelleri Serebral Amiloid-beta Fagositoz&gt; Modelleme (q3DISM)

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

Application of Granger Causality Analysis of the Directed Functional Connection in Alzheimer's Disease and Mild Cognitive Impairment

Impaired functional connectivity in the Default Mode Network (DMN) may be involved in the progression of Alzheimer&#39;s Disease (AD). The Posterior Cingulate Cortex (PCC) is a potential imaging marker for monitoring the progression of AD. Previous studies did not focus on the functional connectivity between the PCC and nodes in regions outside the DMN, but our study is an effort to explore these overlooked functional connections. For collecting data, we used functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) and Granger Causality Analysis (GCA). fMRI provides a non-invasive method for studying the dynamic interactions between the different brain regions. GCA is a statistical hypothesis test for determining whether one-time series is useful in forecasting another. In simple terms, it is judged by comparing the &#34;Known all the information on the last moment, the distribution of the probability of X at this time&#34; and the &#34;Known all the information on the last moment except Y, the distribution of the probability of X at this time&#34;, to determine whether there is a causal relationship between Y and X. This definition is based on the complete information source and stationary chronological sequence. The main step of this analysis is to use X and Y to establish the regression equation and draw a causal relationship by a hypothetical test. Since GCA can measure causal effects, we used it to investigate the anisotropy of the functional connectivity and explore the hub function of the PCC. Here, we screened 116 participants for MRI scanning, and after preprocessing the data obtained from neuroimaging, we used GCA to derive the causal relationship of each node. Finally, we concluded that the directed connection is significantly different between the Mild Cognitive Impairment (MCI) and AD groups, both from the PCC to the whole brain and from the whole brain to the PCC.

Application of Granger Causality Analysis of the Directed Functional Connection in Alzheimer&#039;s Disease and Mild Cognitive Impairment

Based on resting-state functional magnetic resonance imaging with Granger causality analysis, we investigated the alterations in the directed functional connectivity between the posterior cingulate cortex and whole brain in patients with Alzheimer&#39;s Disease (AD), patients with Mild Cognitive Impairment (MCI), and healthy controls.

Granger Nedensellik analizi yönlendirilmiş fonksiyonel bağlantı hafif kognitif bozukluk ve Alzheimer hastalığı uygulanması

Impaired functional connectivity in the Default Mode Network (DMN) may be involved in the progression of Alzheimer&#39;s Disease (AD). The Posterior ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

Vivo Menière'nın hastalığı kulakları ve Normal işitme kulak manyetik rezonans görüntüleme kullanarak insan kranial sinirler xarakteristikaları analizi

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Whole-brain Segmentation and Change-point Analysis of Anatomical Brain MRI&#8212;Application in Premanifest Huntington's Disease

Recent advances in MRI offer a variety of useful markers to identify neurodegenerative diseases. In Huntington&#39;s disease (HD), regional brain atrophy begins many years prior to the motor onset (during the &#34;premanifest&#34; period), but the spatiotemporal pattern of regional atrophy across the brain has not been fully characterized. Here we demonstrate an online cloud-computing platform, &#34;MRICloud&#34;, which provides atlas-based whole-brain segmentation of T1-weighted images at multiple granularity levels, and thereby, enables us to access the regional features of brain anatomy. We then describe a regression model that detects statistically significant inflection points, at which regional brain atrophy starts to be noticeable, i.e. the &#34;change-point&#34;, with respect to a disease progression index. We used the CAG-age product (CAP) score to index the disease progression in HD patients. Change-point analysis of the volumetric measurements from the segmentation pipeline, therefore, provides important information of the order and pattern of structural atrophy across the brain. The paper illustrates the use of these techniques on T1-weighted MRI data of premanifest HD subjects from a large multicenter PREDICT-HD study. This design potentially has wide applications in a range of neurodegenerative diseases to investigate the dynamic changes of brain anatomy.

Whole-brain Segmentation and Change-point Analysis of Anatomical Brain MRI&amp;#8212;Application in Premanifest Huntington&#039;s Disease

This paper describes a statistical model for volumetric MRI data analysis, which identifies the &#34;change-point&#34; when brain atrophy begins in premanifest Huntington&#39;s disease. Whole-brain mapping of the change-points is achieved based on brain volumes obtained using an atlas-based segmentation pipeline of T1-weighted images.

Bütün beyin segmentasyon ve değişim noktası analizi anatomik beyin MR'ı — uygulama Premanifest Huntington hastalığı

Recent advances in MRI offer a variety of useful markers to identify neurodegenerative diseases. In Huntington&#39;s disease (HD), regional brain atrophy ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Nicel [18F]-Facetogenic alçak sırt ağrısı olan bir hastada dinamik kemik cirosunun değerlendirilmesi Için NAF-Pet-MRI Analizi

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...