Biz yardım protokolü göstermek için Şekil 1 ve Anna Ratliff hazırlamak için Melissa Klocke ederim. Bu çalışma Bilim İlerlemesi için Araştırma Kurumu tarafından desteklenmiştir.

1. Mikrotubul Kayma Testi Stok Çözümleri Öncesinde kayma testin hazırlayın. <ol><li> Seyrek parlak organik fluorofor 22 ile etiketlenmiş 0.5 mg mikrotübüller Polimerize. Hedef etiketi konsantrasyonu 1 mikrotübülün mikrometre başına fluorofor veya 1.500 tübülin dimerleri başına yaklaşık 1 fluorofor bir etiketleme yoğunluğudur. Oda sıcaklığında, ışık saklayın kadar iki hafta için alüminyum folyo ile korunmaktadır. </li><li> Yaklaşık 1 mcM az biotin kinesin 21 arındırın. -80 ° C&#39;de saklayın ayrı deneylerde kullanılmak için 5 ul alikotları. </li><li> 50 mM imidiazole ve deney tamponu (AB), 50 mM potasyum klorid (KCl), 4 mM magnezyum klorür (MgCI2), 2 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), pH 6.7 hazırlayın. 4 at Steril filtre ve mağaza ° C </li><li> 2 mg / AB içinde ml biotinlenmiş sığır serum albumini (biotin-BSA) çözülür. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre.-80 Store 4 de uzun süreler için 100 ul alikotları ° C, ° C kadar bir ay için. </li><li> 10 mg / AB ml için streptavidin (SA) çözülür. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre. -80 Mağazası kadar iki hafta için 4 ° de uzun süreler için 20 ul alikotları C, ° C. </li><li> 5 AB mg / ml &#39;ye α-kazein eritilir. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre. -80 Store 4 de uzun süreler için 100 ul alikotları ° C, ° C iki hafta için. </li><li> 200 mM deiyonize su ditiyotretol (DTT) çözülür. 100 ul alikotları -20 ° C&#39;de saklayın, çözdürme 8 saat içerisinde tüketilmelidir. Tekrar dondurulmamalıdır olabilir. </li><li> 4 mM HPLC-grade dimetil sülfoksit (DMSO) içinde paklitaksel (PT) eritilir. -80 10 ul alikotları Mağaza ° C Uzun süreli, -20 ° C kısa süreli. Çözdürme 8 saat içinde kullanın. Tekrar dondurulmamalıdır olabilir. </li><li> 120 mg / ml &#39;de deiyonize su içinde çözülür glikoz. -20 ° C&#39;de 100 ul alikotları Mağazası Tekrar dondurulmamalıdır olabilir. </li><li> Dis150 mM, pH 7.0 deiyonize su adenozin trifosfat (ATP) çözmek. -80 5 ul alikotları Mağaza ° C, çözdürme 8 saat içerisinde tüketilmelidir. </li><li> 600 ul toplam analiz tampon katalaz 10.000 adet glukoz oksidaz ve 156,000 adet eriterek 100x oksijen süpürücü stokta 25 hazırlayın. Pelet katı bir mikrosantrifüj kısaca santrifüjleyin; 0,2 mikron şırınga filtresi ile filtre süpernatant. -80 Deposu 4 de uzun bir süre için 10 ul hacimde ° C, ° C ila bir hafta için. </li></ol> 2. Mikrotubul Kayma Testi, Aynı Gün Çözelti Hazırlama Deney gününde 2,1-2,6 içinde çözüm hazırlayın. Birlikte uygulama, çözeltiler 2,2-2,6 akış hücresi yıkama sırasında hazırlanabilir. Aksi belirtilmediği sürece, buz üzerinde stok solüsyonları tutmak. <ol><li> DTT stok 10 ul (2 mM DTT ile AB) ile AB, tahlil tampon 1 ml hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> Biyo-BSA tampon, 40 &amp; Mu hazırlayın, Biyotin-BSA stok ve AB bir 1:1 karışımından l. Oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> 5.5 ul BSA (AB içinde 1 mg / ml BSA) ile AB 645 ul karıştırma BSA tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> 3 ul streptavidin stoku (AB içinde 0.5 mg / ml streptavidin) ile AB arasında 57 ul karıştırma, SA tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> BSA tamponu, 50 ul stok kazein, 15 uM ATP (1 mg / ml α-kazein, 0.8 mg / ml BSA, AB içinde 50 nM ATP) 0.8 ul 200 ul, karıştırma, α-kazein tampon hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> 95 ul α-kazein tampon, 2.5 ul glukoz stok, 1 ul 100x oksijen süpürücü karışımı, 1 ul paklitaksel stok, 1 ul 2-merkaptoetanol (βME) karıştırılması, floresan anti-bleach tamponu hazırlayın. Davlumbaz altında βME ekleyin. Hazırlık 1 saat içinde floresan anti-bleach tampon kullanın DİKKAT:. ΒME son derece zehirlidir ve kötü kokuyor. Sadece davlumbaz altında açmak için emin olun. Mağaza şişeışığın olmaması; ışık βME ve photobleaching azaltmak kabiliyetini düşürür. </li></ol> 3. Mikrotubul Gliding Assay <ol><li> Bir boşluk gibi bir pipet ile bir şırınga sıkılan vakum yağ kullanarak 24 x 60 mm lamel ve 22 x 22 mm lamel arasında dört akışı şerit, yaklaşık Construct. Her akış şeritte hacmi yaklaşık 10 ul (ölçek izleyen birimler buna göre) olmalıdır. </li><li> Her şeride biyo-BSA tampon 10 ul yıkayın. BSA kat cam yüzeyleri sağlamak için 5 dakika inkübe edin. </li><li> Kızak yüzeyi bloke etmeye devam ederken, biyotin-BSA ücretsiz kaldırmak için 15 ul BSA tamponu ile her kulvarın üç kez yıkayın. Hava kabarcıkları akışı odasına gitmek için izin vermemek için emin olmak, akış odasının ters tarafına tampon kaldırmak için bir Kimwipe veya filtre kağıdı kullanın. </li><li> Her şeride 15 ul SA-tampon yıkayın. 10 dakika, ya da en fazla 2 saat bekleyin. Streptavidin yüzey-bağlı biyotin-BSA bağlanır. </li><li> Kızak yüzeyi bloke etmeye devam ederken serbest SA kaldırmak için 15 ul BSA tamponu ile her kulvarın üç kez yıkayın. </li><li> 15 ul α-kazein tamponu ile her kulvarın yıkayın. α-kazein daha cama spesifik olmayan kinesin bağlayıcı ve mikrotübüller engellenmesine yardımcı olur. </li><li> Α-kazein tamponunda 10 nM kinesin seyreltin ve bu kinesin 15 ul her kulvarın yıkayın - α-kazein çözüm. Yüzeye bağlı streptavidin özellikle bağlamak biotinlenmiş kinesin için 15 dakika (veya bir saat kadar) bekleyin. Kinesin motor alanlarla bind mikrotübüle serbest kalacak. </li><li> Oda sıcaklığında 40 uM α-kazein arabelleğe paklitaksel seyreltin ve ücretsiz kinesin yıkayın ve depolimerizasyon gelen mikrotübüller önlemek için paklitaksel çözümü ile her bir akış odasının ön-yüklemek için bu çözüm 15 ul her kulvarın yıkayın. Soğuk ayrıca mikrotübüller depolymerizes, böylece oda sıcaklıkları ile oda sıcaklığında bu adımları ortaya emin olunçözümleri yeniden. </li><li> Floresan 1 mM ATP ile floresan anti-bleach tampon mikrotübüllerinde 1:100-1:1,000 etiketli seyreltin. Tek şeride 15 ul yıkayın ve 30 dakika içinde gözlemlemek. </li></ol> 4. Veri Toplama <ol><li> Floresan mikroskobu kullanarak mikrotübül kayma gözlemleyin; böyle bir ticari veya ev-yapı TIRF ayar olarak tek floroforlar çözebileceklerdirler mikroskop 26 (Şekil 2) gereklidir. Mikrotübüller sıcaklığına bağlı olarak, yaklaşık 0.5 um / s de alt tabaka üzerinde kinesin motoru tarafından tahrik edilebilir olmalıdır. Mikroskop alanında-of-view 50 mikron ise, bireysel mikrotübüller yaklaşık 100 saniye boyunca görünür olmalıdır. Tek floroforlar daha hızlı 100 sn&#39;den photobleach kalmamak aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Lazer uyarma kullanıyorsanız, yaklaşık 3-5 mW güç ayarı uygundur. </li><li> Analiz için görüntü dizilerini toplayın. 600 görüntüleri5 Hz (2 dk toplam) iyi çalışıyor. Yeterince uzun mikrotübüller tüm alan-of-view geçiş olduğunu dizilerini kullanın. </li></ol> 5. Veri Analizi Bir IDL rutin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> ektedir. Bu rutin belirli bir görüntü dizisi tüm mikrotübüller kayma dayalı bir sebat uzunluğu değeri döndürür. Ya sizin özel mikroskop kurulum bağlı olarak yoğunluğu parametrelerini değiştirerek, her bir görüntü dizisi bu rutin çalıştırmak veya aşağıdakileri yapın: <ol><li> Fluorofor yörüngeleri oluşturmak için bir mikrotübül bağlı her fluorofor izleyin. </li><li> Görüntü dizisi içinde her bir mikrotübül (Şekil 3) için tekrar; genel bir mikrotübül yörünge içine belirli bir mikrotübül üzerinde florofor tüm yörüngeleri birleştirin. </li><li> Yörünge boyunca her noktasına teğet açısı (Şekil 4) hesaplayınVe hesaplama &lt;cos θ s&gt; Denk. (Şekil 5) bir yol uzunluğu s noktalar ile ayrılan her çifti için açı farkı kosinüs ortalaması alınarak 1. Θ s&gt; Eşitlik uydurma &lt;cos tarafından mikrotübül tek mikrotübül veya grup için sebat uzunluğu bulun. 1, ağırlık ortalama hesaplamak için kullanılır çünkü θ s, bağımsız değerlerin sayısı ile uyum içinde ayrı veri noktaları. </li></ol>

<ol>
	<li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+microtubules.">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li><li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length.">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li><li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model.">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102 (2008).</li><li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length.">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li><li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape.">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li><li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking.">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li><li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness.">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li><li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers.">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li><li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity.">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li><li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements.">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li><li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Gliding+assays"+for+motor+proteins:+A+theoretical+analysis.">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li><li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics.">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627 (2011).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea.">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li><li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential.">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li><li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+tensegrity+in+cell+mechanics.">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li><li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness.">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li><li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps.">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li><li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations.">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li><li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories.">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li><li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical biology of the cell. , (2008).</li><li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments.">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li><li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific,+high-precision+label+of+microtubules.">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li><li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+modified+tubulins.">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li><li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curve+reconstruction+from+unorganized+points.">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li><li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li><li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence.">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li><li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty.">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li><li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport.">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Sebat uzunluk ölçümleri bireysel biyopolimerlerin mekanik özelliklerinin iyi bir karakterizasyon vardır. Bu yazıda, mikrotübül sebat uzunluk ölçüm yöntemi tanımlamışlardır. Girişte belirtildiği gibi, bu yöntem, sadece kolayca kayma deneyi, 3.9, en son adım olarak, reaktiflerin, sıcaklık veya viskozite değiştirmek sureti ile polimerize etmek veya mikrotübüller, adım 1.1, tarafından çeşitli koşullar mikrotübül mekanik özelliklerinin incelenmesi için genişletilmiştir farklı koşullar altında. Tekniği kendini gerçekleştirmek için hızlı. Stok çözeltileri, vaktinden önce (aşama 1) hazırlandı sonra, bir kayma tahlil deney, tek bir mikroskop lamı üzerinde koşullarda dört varyasyonlar (adım 3.1 &#39;de dört şeritli)&#39; e kadar da dahil olmak üzere 2-3 saat içinde gerçekleştirilebilir. Birçok mikrotübüller her denemede incelenebilir; laboratuarımızda tipik deney koşulu başına 100 mikrotübüller (yaklaşık 10 görüntü sequenc incelemekdizisi başına 10 mikrotübüller) ile her kulvar için es,. Büyük veri kümelerinin analizi aynı şekilde oldukça hızlı. Uygulama ile, 10 görüntü dizileri modern bir PC ile bir öğleden sonra ya da öylesine sebat uzunluğu için analiz edilebilir. Analizinde hız sınırlayıcı adım bireysel floroforlar izlemek zaman; yeni izleme yöntemleri büyük ölçüde 27 Bu hızını artırmak için söz veriyorum. Yöntem, belirli bir mikrotübül bağlı tek bir florofor izleme gerektirdiğinden, izleme hassas tek foton toplanarak ile sınırlıdır, ve nanometre 22, 25 ölçeğinde olabilir. Birçok floroforlar verileri dahil ederek, hassasiyet daha da geliştirilebilir. Potansiyel olarak, yüksek hassasiyet mikrotübül için, bu tür kuantum noktalar olarak çok parlak floresan nesneler takılarak ulaşılmıştır. Bireysel yörüngelerin hassas, sebat le belirsizliği oldukça iyi olsa daBu tekniği (tek mikrotübül için ±% 50 ölçekte) ile ölçülen ngths hala önemli olduğunu. Sebat uzunluğu ölçümleri hassas anahtar sınırlaması cos θ ler ortalama yer istatistikleri. L mikrotübül yörünge uzunluğu L / s, okudu gibi noktalar, s artar çiftleri arasındaki kontur uzunluğu gibi, θ ler bağımsız ölçümlerin sayısını azaltır. Mikrotübül yörüngeleri uzunluğunu artırmak sebat uzunluğu ölçümleri geliştirilmiş hassasiyet için izin verecek. Bu yöntem için ikinci bir sınırlama biotinlenmiş kinesin-1 mikroskop slaytlar kinesin belirli eki için kullanılacak olması gerekliliğidir. Biotinlenmiş kinesin (bizim durumumuzda E. Coli &#39;dan itibaren) arındırılmalıdır ve sadece raftan satın alınamaz. Bununla birlikte, modifiye edilmiş bir kayma deneyi kullanılarak unbiotinylated akrabaesin 28 kullanılabilir, bu yöntem için uygun olabilir kinesin ağır zincirli protein Sitoiskelet (KR01) dan ticari olarak temin edilebilir. Bu alternatif kinesin kullanmak kayma testi değiştirilmesi herhangi bir şekilde mikrotübül eğilme rijitliği etkilemez olmaz, ve böylece rekombinant kinesin proteini erişimi olmayan gruplara bu yöntemi kullanmak için izin istiyorum.

Hücre iskeleti, çoğu ökaryotik hücrelerde bulunan biyopolimerlerin bir ağ, hücresel organizasyon, hücre içi ulaşım, ve hücre mekaniği bir rol oynar. Hücre iskeleti (öncelikle aktin ve mikrotübüller) ve biyopolimerlerin mekanik özellikleri de, bir bütün olarak 12 hücre mekanik özelliklerini belirlemede önemli bir rol oynamaktadır. Tüm hücre mekaniği, sağlıklı ve hastalıklı hücrelerin 13,14 karakterize edebilir ve hücresel motilite 15 dahil olduğundan, altta yatan sitoskeletal bileşenlerin mekanik özellikleri son yirmi yılda 1 için çalışma aktif alan olmuştur. Biyopolimerlerin esneklik (veya sertliği) kalıcılığı uzunluğu, ortam sıcaklığında, ısı dalgalanmaları altında yaklaşık bir radyan tarafından eğilir polimer uzunluğu ile karakterize edilir. Bir dizi teknik examp için sebat uzunluğu 16, ölçmek için geliştirilmiştirhidrodinamik akış, optik tuzakları, ya da elektrik alanları 4,17,18, ve çözüm 5,6 ücretsiz polimerlerin dalgalanmaları ölçmek pasif teknikleri kullanarak polimer bükme içeren le aktif teknikleri. Aktif ölçümler, ancak özel kurulumları mikrometre ölçekte bilinen kuvvetler uygulamak gerektirir ve serbest dalgalanma ölçümleri kullanılan mikroskop odak düzlemi difüzyon dışarı nedeniyle zor olabilir. Bu yazıda, mikrotübül sebat uzunluğu, sitoskeletal polimer ölçmek için tamamlayıcı, pasif, tekniği açıklar. Tekniği polimer daima 19 odak düzlemi kalmasını sağlamak kayma testleri, içerir. Ayrıca, polimer boyunca belirli yerlerde de karakterize edilir, böylece ilgi polimer ile kalıcı olarak bağlanmış tek bir izleme floroforlar, içerir. Yöntemin özel bir çizgi Figür gösterilire 1. Kinesin mikrotübül + sonuna doğru özellikle hareket, yani bir kayma tayininde mikrotübül tek yönlü tahrikli. Mikrotübül yapının önde gelen ucunu, ekli son kinesin ötesinde, çevreleyen bir çözelti termal kuvvetler altında dalgalanma serbesttir. Mikrotübül ileri itilir gibi, uç cam slayt üzerinde daha ileri bir yeni kinesin molekül bağlama kadar belirli bir dalgalanma, donar dalgalanır. Kinesin çok güçlü mikrotübüller ekler Çünkü, mikrotübül lider sonu yolunu takip sınırlıdır. Bu nedenle, mikrotübül yörünge donmuş istatistiksel dalgalanmalar mikrotübüllerin 11 serbest uç bölgesinin istatistiksel dalgalanmalar aynıdır, ve bu yüzden 20 göre süreklilik uzunluk hesaplamak için de kullanılabilir <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; l p mikrotübülün sebat uzunluğu nerede, θ s kontur uzunluğu s ayrılmış yörünge için teğet arasındaki açı olup, &lt;&gt; temsil eder bir kontur uzunluğu s ile ayrılmış pozisyonları tüm çiftleri üzerinde bir ortalama. Kayma testi kendisi özel bir streptavidin biotin bağlantı yoluyla cam slayt bağlı coiled coil 21&#39;de kinesin biotinlenmiş kullanır. Bu eki motora etki bağlamak ve mikrotübüller itmek için ücretsiz sağlar. Mikrotübül yörüngeleri takip etmek için, mikrotübüller seyrek organik floroforlar 22,23 ile etiketlenir - etiketler tek floroforlar tek bir molekül floresan mikroskobu kullanılarak çözülebilir olması yeterli seyrek olmalıdır. Tek floroforlar IDL yazılmış görüntü analiz rutinleri kullanılarak izlenir. Her fluorofor yörüngeleri belirli bir mikrofon bağlırotubule otomatik 24 bileşik mikrotübül yörünge birleştirilir. Bir yörünge boyunca her noktasına θ teğet açıları hesaplanır; bu teğet açılardan &lt;cosθ s&gt; değeri, her kontur uzunluğu ler için hesaplanır. Son olarak, bu veriler Denk sığdırılır. 1. Belirli bir mikrotübül için bir kalıcılık uzunluk elde etmek için, ya da aynı kayma tahlil içinde çok mikrotübüller için. Yöntem koşullarının geniş bir çeşitliliği (bağlı mikrotübül ilişkili protein (MAP), ya da viskoz bir dizi çözüm ile, mikrotübül bağlı farklı stabilizasyon ajanları ya da diğer küçük moleküllerin) &#39;de hazırlanan mikrotübüller birlikte çalışmak için yeterince sağlamdır. Bizim laboratuvarda, teknik farklı dengeleyici maddeler ile mikrotübüllerin ve mikrotübüller boyunca uzunluğunun bir fonksiyonu olarak mikrotübül kalıcılığı uzunluk karakterize etmek için kullanılmaktadır. Ana sınırlamadır mikrotübül hala zorunluluk olduğunuupport kinesin motilitesi. Kinesin bir sağlam motor enzim olduğundan, bu oldukça gevşek bir sınırlamadır. Bir miyozin aile enzimi ile aktin ve kinesin ile mikrotübüller değiştirerek, aktin sebat uzunluğu aynı tekniği kullanılarak ölçülebilir.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reaktifler</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Potasyum klorür</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Magnezyum klorid</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126.615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinlenmiş BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-kazein</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptavidin</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ditiyotretol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paklitaksel</td&gt;<td&gt; LC Laboratuvarları</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glukoz oksidaz</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Katalaz</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glukoz</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-merkaptoetanol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Zehirlidir. Az miktarda satın alın.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24X60 mm No 1 1/2 cam kapak</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22 mm No 1 cam kapak</td&gt;<td&gt; Altın Mühür</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Yüksek Vakum Gresi</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Ekipman</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF mikroskop</td&gt;<td&gt; Birçok</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Bu yöntemde kullanılan TIRF mikroskop ev yapımı.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (yazılım)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; MATLAB, ImageJ veya diğer görüntü analiz yazılımı yerine olabilir.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

Mikrotübüller sitoskeletal hücre bölünmesinde rol polimerler, hücre mekaniği, ve hücre içi taşıma vardır. Bu fonksiyonların her biri sert ve hücre çapı önemli bir kısmını kapsayan düz yeterli mikrotübüller gerektirir. Sonuç olarak, mikrotübül kalıcılık uzunluğu, sertlik ölçüsü, aktif son yirmi yılda 1 için incelenmiştir. Kısa mikrotübüller uzun mikrotübüller 2-4 den 10-50 kat daha sert, ve hatta uzun mikrotübüller büyüklükte 5-9 sipariş göre farklılık sebat uzunlukları ölçüldü: Bununla birlikte, açık sorular kalır. Burada, mikrotübül sebat uzunluğunu ölçmek için bir yöntem mevcut. Yöntem bir kinesin tahrik mikrotübül kayma deneyi 10 dayanır. Mikrotübül bağlı bireysel floroforlar tek parçacık izleme, glidin bireysel mikrotübül seyrek floresan etiketleme birleştirerekTek mikrotübüller g yörüngeleri nanometre seviyesinde hassasiyet ile izlenir. Yörüngesel süreklilik uzunluğu 11 kullanılan şartlar altında mikrotübülün kalıcılığı uzunluğu ile aynıdır. Bir otomatik izleme rutin bireysel mikrotübüller bağlı floroforlar gelen mikrotübül yörüngeleri oluşturmak için kullanılır ve bu yörünge sebat uzunluğu IDL yazılmış rutinleri kullanılarak hesaplanır. Bu teknik hızla uygulanabilir, ve deney bir gün içinde 100 mikrotübül sebat uzunluğu ölçme yeteneğine sahiptir. Yöntem mikrotübüller boyunca uzunluğunun bir fonksiyonu olarak süreklilik uzunluk dahil çeşitli koşullar altında kalıcılık uzunluğunu ölçmek için genişletilebilir. Ayrıca, kullanılan analiz rutinleri yanı aktin filamentler sebat uzunluğunu ölçmek için, miyozin tabanlı etkili kayma deneyleri için uzatılabilir.

Bir kayma testte bir anlık Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. İyi bir mikrotübül yoğunluk görüş alanı başına 1-10 mikrotübüller olduğunu; mikrotübüller birbirlerine çapraz olarak önemli ölçüde daha mistracking neden olacaktır. Şekil 2 &#39;de kayma testte 11 mikrotübül yörüngesel bir grafiği Şekil 3&#39; de gösterilmiştir. Tipik yörüngeleri 10 ila 30 mikron uzunluğunda; tek mikrotübül başka kestiği yerlerde bazı yörüngeleri boşluklar var. Bu yörüngeleri analizi atılabilir. Tek uzun mikrotübül yörünge yörünge boyunca iki pozisyon itibariyle örnek tanjant açısı ile, Şekil 4A &#39;de gösterilmiştir. Sabit bir mesafe ile ayrılmış tanjant açısı arasındaki fark kalıcılık uzunluğu ile ilgilidir, mikrotübül yörünge boyunca konumunun bir fonksiyonu olarak tanjant açısı Şekil 4B &#39;de gösterilmiştir. Teğet açısı verileriBirçok mikrotübül yörüngeleri, belirli bir deneydeki tüm mikrotübüller için tek bir kalıcılık uzunluk hesaplamak için birleştirilir. Şekil 5, Şekil 2&#39;nin kayma tayini için &lt;cos θ s&gt; karşı çevre uzunluğu sn &#39;lik bir şemasını göstermektedir. Büyük kontur uzunluğu değerleri ise, cos θ çok az değerleri ölçülür; dolayısıyla ortalaması oldukça değişkendir. Ağırlıklı uygun kısa s uygun, daha yakından daha yüksek kesinlik verilerinin uzun s, düşük duyarlıklı veri. Bu 11 yörüngeleri arasından sebat uzunluğu, 500 ± 40 mikron (ortalama ± standart hata), değeri nispeten kısa mikrotübüller 2 için sebat uzunlukları temsilcisidir. Benzer deneyler 300 ve 1000 mm arasında kalıcılık uzunluklarda bir dizi verir. Sorun Giderme Mikrotübüller artışlarla, tamamen eksik iseAdım mikrotübül ase konsantrasyon 3,9-0,5 mg / ml idi. Mikrotübüller hala eksikse, yeniden polimerize mikrotübüller. Emin paklitaksel mikrotübül mikrotübüller depolymerize, aksi takdirde içine seyreltilir her çözüm mevcut olduğundan emin olun. Mikrotübüller serbestçe çözüm difüzyon ama yüzeye bağlayıcı değilse, adım 3.7 &#39;kinesin konsantrasyonunu artırmak ve kinesin dönüşümsüz mikrotübüller bağlar sağlamak yerine ATP AMP-PNP kullanın. Mikrotübüller hala bağlamak istemiyorsanız, yeni biyotin-BSA tampon ardından yeni streptavidin stok ve tampon yapmak. Son olarak, yeni biotinlenmiş kinesin arındırmak. Mikrotübüller bağlamak ama hareket yoksa, taze ATP ATP stok solüsyonu değiştirin. Floroforlar çok hızlı photobleach varsa, aydınlatma yoğunluğunu azaltır. Floroforlar hala çok hızlı photobleach ise, taze stok ile oksijen süpürücü sistemi değiştirin. Eğer fluorophores, çok loş aydınlatma yoğunluğunu artırır. <img src="/files/ftp_upload/50117/50117fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Mikrotübül kayma testin Karikatür. Kinesin enzimler özellikle biotin streptavidin bağı ile lamel bağlanmıştır. Mikrotübüller seyrek organik floroforlar ile etiketlenir. ATP ilavesi üzerine, mikrotübüller kinesin motorlar tarafından itilir. Mikrotübül en önde gelen serbest uç çözelti içinde termal kuvvetleri nedeniyle değişiklik gösterir, bu dalgalanmaları mikrotübül kalıcılık uzunluk hesaplamak için kullanılır. Bu deneyler tarafından tanınacak mikrotübül uzunluğu ölçekli serbest ucunun uzunluğu. <img src="/files/ftp_upload/50117/50117fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. TIRF mikroskop aracılığıyla alınan bir kayma testi tipik mikroskop anlık. Mikrotübüllerle<html> bules seyrek tek floroforlar ile dekore edilmiştir. Ölçek çubuğu 5 mikron. <img src="/files/ftp_upload/50117/50117fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Görüntü dizisi, Şekil 3. Mikrotübül yörüngeleri, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Her mikrotübül yörüngesi birçok tek fluorofor yörüngeleri (ortalama 10) birleştirir ve 100 nm başına bir noktaya inceltilmiş edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/50117/50117fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Bir yörünge için teğet açıları hesaplanıyor. Gösterilen örnekte tanjant açısı (θ) ile bir mikrotübül (A) Yörünge. Mikrotübül yörünge boyunca konumunun bir fonksiyonu olarak (B) tanjant açısı. Bu veriler, Denklem kullanılan ortalama açı hesaplamak için kullanılır. 1. ays &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50117/50117fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. Teğet açılardan sebat uzunluğu hesaplanıyor. Şekil 3&#39;te gösterilen 11 yörüngeleri için &lt;cos θ s&gt; karşı çevre uzunluğu s (nokta) arsa. (Düz çizgi) Denk sığdır. 1. Mikrotübül Bu grup için, sebat uzunluğu 500 ± 40 mikron. Uzun kontur uzunlukları (10 mikron ya da öylesine üzeri) için, veri nedeniyle sınırlı istatistiklere oldukça değişkendir.

Watch this Scientific Journal Video about Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays at JoVE.com

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Sebat uzunluğu veya biyopolimerlerin eğilme rijitliği ölçmek için bir yöntem tarif edilmiştir. Yöntem deneysel olarak bireysel mikrotübül kalıcılığı uzunluğunu belirlemek için bir kinesin tahrik mikrotübül kayma deneyi kullanmaktadır ve aktin bazlı kayma deneyleri için uyarlanabilir.

Kayma Tahliller kullanma Biyopolimerler eğilme Katılığı Ölçümleri

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Görüntüleme.  Lawrence University. Sebat uzunluğu veya biyopolimerlerin eğilme rijitliği ölçmek için bir yöntem tarif edilmiştir. Yöntem deneysel olarak bireysel mikrotübül kalıcılığı uzunluğunu belirlemek için bir kinesin tahrik mikrotübül kayma deneyi kullanmaktadır ve aktin bazlı kayma deneyleri için uyarlanabilir.

Video: Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Akustik Membran mikropartikül Teknoloji Geliştirme Özel Çin Hamsteri Yumurtalık-host Hücre Proteini Tahliller

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Biyomühendislik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Mikro Kan akış hızı Profil ölçümleri için mikro-parçacık imaj velosimetri

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Moleküler Dolaşıklık Biyopolimerlerin Electrospinnability

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Kurutma Hava-LC Arayüz üzerinde Megamolecular Biyopolimerlerin Kendinden entegrasyonu için Yöntemler

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Laboratuvar ölçekte karıştırılmış Biyoreaktörler güç giriş ölçümlerde

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Deniz sünger Spicules mekanik özelliklerini ölçmek için bir milimetre ölçek bükülme test sistemi

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.