Bu çalışma kısmen İsrail Kanser Araştırma Fonu&#39;ndan Ar-Ge Kariyer Geliştirme Ödülü, İsrail Ulusal Nanoteknoloji Girişimi ve Helmsley Bağışlı Güven&#39;den Kişiselleştirilmiş Teröristler için Nano Dedektifler (VP-K) için bir Odaklı Teknoloji Alanından hibe tarafından desteklendi ve Ulusal Sağlık yardımı enstitüleri R01GM076360 (XC&#39;ye).

<ol><li>Padler-Karavani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aiming+at+the+sweet+side+of+cancer%3A+Aberrant+glycosylation+as+possible+target+for+personalized-medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine.</a> Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).</li>
<li>Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+in+immune+recognition+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Glycans in immune recognition and response.</a> Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).</li>
<li>Häuselmann, I., Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+tumor-cell+glycosylation+promotes+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis.</a> Front Oncol. 4, (2014).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+uptake+and+incorporation+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+into+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells.</a> J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+specificity%2C+abundance%2C+and+composition+of+anti-Neu5Gc+antibodies+in+normal+humans%3A+potential+implications+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease.</a> Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+xeno-autoantibodies+against+a+non-human+sialic+acid+serve+as+novel+serum+biomarkers+and+immunotherapeutics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer.</a> Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).</li>
<li>Cao, H., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+consideration+on+sialic+acid+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">General consideration on sialic acid chemistry.</a> Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).</li>
<li>Deng, L., Chen, X., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+sialic+Acid+diversity+and+biology+using+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays.</a> Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).</li>
<li>Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoside+Arrays%3A+New+Synthetic+Strategies+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Curr+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications.</a> Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).</li>
<li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+of+fluorescently-tagged+natural+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans.</a> Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).</li>
<li>Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays%3A+powerful+tools+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery.</a> Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).</li>
<li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+analysis+of+glycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation and analysis of glycan microarrays.</a> Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).</li>
<li>Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/cs/c2cs35401b#!divAbstract">Carbohydrate microarrays.</a> Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).</li>
<li>Struwe, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+sample+preparation+guidelines+for+reliable+reporting+of+glycomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets.</a> Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. , (2016).</li>
<li>Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mono-O-acetylated+N-acetylneuraminic+acids+in+human+and+rat+sera+by+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography.</a> Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-comparison+of+protein+recognition+of+sialic+acid+diversity+on+two+novel+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays.</a> J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).</li>
<li>Padler-Karavani, V., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+impact+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+on+transplant+rejection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk.</a> Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).</li>
<li>Samraj, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+meat-derived+glycan+promotes+inflammation+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).</li>
<li>Pearce, O. M., Läubli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+cancer+biology+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in cancer biology and immunity.</a> Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).</li>
<li>Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+risk+of+diseases+associated+with+red+meat+intake%3A+Analysis+of+current+theories+and+proposed+role+for+metabolic+incorporation+of+a+non-human+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid.</a> Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).</li>
<li>Pearce, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+hormesis+of+cancer+growth+mediated+by+narrow+ranges+of+tumor-directed+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).</li>
<li>Pham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+novel+human-specific+xeno-auto-antibody+response+against+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium.</a> Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).</li>
<li>Reuven, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immunogenic+Neu5Gc+in+bioprosthetic+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves.</a> Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).</li>
<li>Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+presence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+recombinant+therapeutic+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Başarılı bir glikan mikroarray üretimi dikkatli planlama gerektirir ve protokolde birkaç önemli adımı içerir. Bunlar arasında şunlar bulunur: (1) sonraki tüm parametreleri tanımlayan blok ve plaka düzenlerini planlama ( ör. Mesafeler, aralık, numune miktarı ve baskı); (2) piksellerin temizlenmesi ve nokta homojenliğini kontrol etmek için kritik olan pin bütünlüğünün sağlanması; (3) baskı esnasında yüksek nem oranının korunması, spot homojenliğinden ödün verebilecek uzun basılmalar sırasında numunenin buharlaşmasını önlemek için kritik önem taşır; (4) sonuçları etkileyebilecek uygun hizalama ve analiz parametrelerini seçme ( örneğin, arka plan çıkarma yöntemi, eşik ve nokta boyutu esnekliği). Yöntem, belirli deneysel tasarım ve hedefleri karşılamak üzere daha da modifiye edilebilir. Örneğin, ön lekelenme sayısı dizide basılacak her malzeme türüne daha iyi uyacak şekilde değiştirilebilir. Sırasında iğne yıkama adımıBaskı, farklı basılı materyallere uyacak şekilde, kısa veya uzun yıkama döngüleri ile optimize edilebilir. Ayrıca, bir dübel başına bir pimin yazdırdığı lekelerin miktarı, daha fazla veya daha az nokta içermek üzere değiştirilebilir, ancak dizi üzerinde kullanılan her malzeme türü için ayrı kalibrasyon gerektirir. Floresan işaretleyicinin türü ve konsantrasyonu, konjügasyon için uygun kimyasal grubu ( yani, epoksi kaplı slaytlar için birincil amin) içerdiği sürece modifiye edilebilir. STD eğrilerinin konsantrasyonları ve türleri genişletilebilir ( örn., Insan / fare / diğer organizma IgG, IgM, IgA, vb. ). Tampon koşulları, artmış arka plana neden olacak, diziye spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için, tercihen, primer amin içeren materyalden yoksun olan farklı materyallere uyacak şekilde optimize edilebilir. Önemli bir husus, Neu5Gc&#39;yi optimal olarak saptamak için, biyolojik bloke edici reaktif Neu5Gc içermemelidir ( örn., BSA amd sütünden kaçının), bu, Neu5Gc-sialoglikan algılanmasını azaltabilir ve iArt arda 19 , 20 . Birincil ve ikincil saptama konsantrasyonları, yüksek arka plan ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için optimize edilmelidir. Buna ek olarak, tarama parametreleri ( örneğin güç, kazanç ve çözünürlük) arka planı azaltmak veya alçak sinyalleri geliştirmek için değiştirilebilir. Son olarak, hizalama ve analiz parametreleri, yüksek arka plana veya farklı şekillendirilmiş özelliklere uyacak şekilde değiştirilebilir. Glikan mikroarray verilerini raporlamak için önerilen standartlarla ilgili daha fazla bilgi ve yönergeler son zamanlarda en sonunda veri paylaşımı ve yorumlanmasını kolaylaştırabilir MİRAGE girişimi 17 tarafından tarif edilmiştir. Özet olarak, glikan mikrodizileri, glikan-biyomolekül etkileşimlerini araştırmak için sağlam bir araç sağlar ve çeşitli biyolojik örneklere adapte edilebilir. Anti-Neu5Gc antikorları, insan hastalığında farklı roller oynamaktadır 23 . Örneğin, kanserde, Anti-Neu5Gc antikorları ikili rol oynamaktadır: bir yandan potansiyel biyolojik belirteç olarak hizmet ederken diğer yandan potansiyel terapötikler 7 , 21 ve 24 olarak görev yapmaktadırlar. Bu antikorlar aynı zamanda ateroskleroza 25&#39;in şiddetlenmesine, ksenon- transplantasyonun etkinliğine 20 , 26 ve glikozillenmiş biyoterapötiklerin etkisine katkıda bulunur 27 . Bu nedenle, çeşitli insan örneklerinde anti-Neu5Gc antikorlarının profillendirilmesi giderek artan bir ilgi göstericidir ve burada açıklanan gibi yüksek verimli testler, insan sağlığı ve hastalıklarındaki rollerini anlamamıza katkıda bulunabilir.

Sias, hücre yüzeyi glikoproteinleri üzerindeki glıkan zincirlerini ve omurgalılardaki glikolipitleri kapsayan asidik şekerlerdir. Sia kanser hücrelerinde 1 değiştirilebilir ve ilerlemesi ve / veya metastaz 2, 3 ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Memelilerdeki başlıca Sia formlarından ikisi Neu5Ac ve onun hidroksillenmiş formu Neu5Gc 2&#39;dir . İnsanlar CMAH enzimini kodlayan genin belirli bir inaktivasyonu nedeniyle Neu5Gc&#39;yi sentezleyemez. Bu insan dışı Sia metabolik diyet Neu5Gc zengin besinler (örneğin kırmızı et) den &quot;kendini,&quot; menşeli 4, 5 gibi insan hücrelerine sahiptir. Neu5Gc, insan epitelinin ve endotelin hücre yüzeylerinde düşük seviyelerde bulunur, ancak özellikle karsinomalarda birikir. Neu5Gc, insan humoral bağışıklık sistemi 2 , 6 tarafından yabancı olarak tanınır.Neu5Gc-glıkanların antijenik karmaşıklığı, insanlardaki anti-Neu5Gc antikor cevabının karmaşıklığı tarafından yansıtılan, Neu5Gc modifikasyonu, bağlanma, altta yatan glıkanlar ve iskeleler ve bunların yoğunluğu da dahil olmak üzere çoklu seviyelerde ortaya çıkabilir 6 . Bu antikorlardan bazıları karsinom biyolojik belirteçleri ve potansiyel immünoterapötikler 7 olarak kullanılır . Farklı sialoglikanlar 8&#39;in kemoenzimatik sentezinin ortaya çıkışı, bu tür antikorların daha derinlemesine analizine yol açtı, bu da glıkan mikroarray teknolojisi 9 , 10 kullanılarak kolaylaştırıldı. Bu nedenle, doğal ve sentetik karbonhidratların büyük kütüphanelerinin kolaylaştırılmış hazırlanması ve manipülasyonu ile, glıkan mikrodizileri karbonhidratların sayısız biyomoleküllerle olan etkileşimlerini araştırmak için güçlü, yüksek verimli bir teknoloji haline geldi 10 , 11 , </sup12 , 13 . Bir dizi formatında, az miktarda malzeme kullanılır ve biyolojik olarak ilgili glıkanların bu çok-değerli gösterimi, tek bir deneyde binlerce bağlanma etkileşiminin araştırılmasını sağlar. Önemli olan, bu teknoloji aynı zamanda biyomarkır bulguları ve çeşitli numunelerde 7 , 12 bağışıklık yanıtlarını izlemek için de uygulanabilir. Başarılı glıkan mikrodizi imalatı, üç önemli hususu göz önüne alır: yazıcı robot tipi, glikan konjugasyon kimyası ve tespit optiği. Baskı aleti konusuna gelince, iki teknik mevcuttur: temaslı ve temassız yazıcılar. Temas baskıda, 1-48 çelik pim, glikan solüsyonu içeren çok iyi kaynak plakasına daldırılır ve cam sürgü yüzeyine doğrudan temas ederek işlevselleştirilmiş cam slaytlar üzerinde lekelenir. Çözelti miktarı deSlayta gömülmüş olan, slayt yüzeyinde kalıcı sürenin bir fonksiyonudur. Genellikle, numuneler önce kaygan yüzey üzerine basılmadan önce bir cam blok üzerine (homojen noktalere ulaşmak için) önceden lekelenir. Temassız yazıcılarda ( örn., Piezo elektronik yazıcı), glikanlar, kontrollü elektrik sinyalleri kullanılarak bir cam kılcalından basılır. Kontak baskıya kıyasla daha hassas baskı elde etmek için elektrik sinyali hassas bir şekilde kalibre edilebilir. Noktaların boyutu ve morfolojisi de nispeten daha homojen. Ek bir avantaj, numunenin baskıdan sonra kaynak plakasına geri döndürülmesidir. Bununla birlikte, piezo elektronik yazıcıların en büyük dezavantajı baskı ucu sınırlaması (4 veya 8) olup, kayma kararlılığı, sıcaklık, nem ve numunenin buharlaşmasına özel dikkat gerektiren çok uzun bir yazdırma süresi sağlar. Temassız inkjet yazıcı 14 daha büyük numune hacimleri gerektirir. <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; Yazdırma yöntemleri için mevcut sınırlı seçeneklerin aksine, glikan konjugasyon kimyası, daha pek çok seçeneğe sahip daha karmaşık bir sorundur. Seçilen immobilizasyon kimyası, hem glikanlardaki aktif grupları hem de slayt yüzeyinin reaktivitesini açıklamak zorundadır. Belirli bir mikrodizinin yüzeyinde, sentetik olarak sentezlenen veya doğal olarak izole edilen glikanlar, hepsi aynı reaktif grubu gerektirir. Buna ek olarak, glikanlar saf ve homojen olmalı. Öte yandan, immobilizasyon yüzeyi ve kimyası tekrarlanabilirlik ve güvenilir bağlanma yoğunluğu sağlamalıdır. Çoklu immobilizasyon yöntemleri, kovalent veya kovalent olmayan (fiziksel absorpsiyon) ataşman 10 , 11 , 12 , 13 ile geliştirilmiştir . Baskın glikan mikroarray teknolojisi ile ilgili son derece detaylı bilgi almak içinD araştırmacı, bu mükemmel değerlendirmeleri 13 , 15 bakın . Önemlisi, bir Glikomik Deney (MIRAGE) inisiyatifi için gereken son Minimum Bilgi, numune hazırlama 16 için ve bu büyüyen alanda standartları iyileştirmek için glıkan mikrodizi analizleri 17&#39;den veri raporlama talimatlarını açıklar. Burada, 16 yuvalı bir formatta belirli bir kontaklı nano-yazıcı kullanarak sialoglikan mikrodizilerinin imalatı için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Glikanlardan her biri, epoksi ile aktive edilen cam slaytlarına kovalent bağlantısına aracılık eden bir birincil amin içerirler. Ayrıca çeşitli insan sera örneklerini, antikorları ve Sia bağlayıcı bitki lektinlerini kullanarak bir slaytın gelişimini ve analizini açıklıyoruz. Siyaloglikan mikroarray tahlilleri, dizi imalatı, işlenmesi, geliştirilmesi ve analizi içeren birkaç ana aşamayı içerir. Dizi üretiminde armanın planlanması gerekirRay düzeni, glikanlar ve kaynak plakası hazırlanması, nano yazıcının programlanması ve slaytların basılması. Daha sonra, slaytlar işlenir, geliştirilir ve analiz edilir ( Şekil 1 ).

<table><tbody><tr><td>Primary-amine containing sialoglycans</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Contact info@glycohubusa.com for compound requests</td><td>Printed glycans</td></tr><tr><td>Monosodium phosphate monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Printing buffer component</td></tr><tr><td>Disodium phosphate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Printing buffer component</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>Printing buffer/ incubation/washing buffer</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>Printing buffer component</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>Ovalbumin (Grade V)</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Slide Blocking protein</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Slide washing detergent</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marker on array</td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, whole molecule</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Printing component</td></tr><tr><td>Biotinylated- SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>Plant Lectin &amp;ndash; binding Sia-alpha2&amp;ndash;6-linked</td></tr><tr><td>Biotinylated-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>Plant Lectin &amp;ndash; binding Sia-alpha2&amp;ndash;3-linked</td></tr><tr><td>Chicken-anti Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Primary detection</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Biotin binding</td></tr><tr><td>Cy3-anti Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>Secondary detection against human IgG</td></tr><tr><td>Cy3-anti Chicken IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>Secondary detection against chicken IgY</td></tr><tr><td>Human sera samples</td><td>Israeli Blood Bank</td><td></td><td>Primary detection</td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen (Grade 5)</td><td></td><td></td><td>General dusting/drying tool</td></tr><tr><td>Epoxy-coated slides</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>Slides</td></tr><tr><td>Epoxy-coated slides</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 &amp;micro;m size spots.</td></tr><tr><td>384-well microtiter plate</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Printing plate</td></tr><tr><td>VWR lab marker</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Slide labeling</td></tr><tr><td>Staining Tube</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>Slide developing tool</td></tr><tr><td>Staining bath</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>Slide developing tool</td></tr><tr><td>Slides glass holders</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>Slide developing tool</td></tr><tr><td>GenePix Scanner</td><td>Molecular devices</td><td>4000B</td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>Array printer</td></tr><tr><td>Pins</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Printing pins</td></tr><tr><td>ProPlate Module</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Slide developing module</td></tr><tr><td>Distilled water</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>Required for arrayer and humidifier</td></tr><tr><td>Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 &amp;mu;L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td><td>Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate</td></tr></tbody></table>

profiling anti-neu5gc igg in human sera with a sialoglycan microarray assay

Hücreler, kanserde yaygın şekilde değişen ve sialik asit (Sia) ifadesinde değişiklikler içeren karbonhidrat zincirleri (glikanlar) paketi ile kaplıdır. Bunlar, 9-karbon omurgasına sahip olan ve hücre yüzeylerinde omurgalı glıkanları kaplayan asidik şekerlerdir. Memelilerin başlıca Sia formlarından ikisi N- asetilnöraminik asit (Neu5Ac) ve onun hidroksillenmiş formu, N- glikolilneuraminik asit (Neu5Gc) &#39;dir. İnsanlar, sitidin 5&#39;monofosfat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hidroksilaz (CMAH) kodlayan genin inaktivasyonu nedeniyle endojen Neu5Gc üretemez. Yabancı Neu5Gc, kırmızı et ve sütten besin tüketimi yoluyla insan hücreleri tarafından edinilir ve ardından çoğunlukla karsinomalar üzerine biriken hücre yüzeyindeki çeşitli glıkanlarda görülür. Sonuç olarak, insanlar kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı hastalıklarda çeşitli rol oynayan ve potansiyel tanı ve terapötik ta olan dolaşımdaki anti-Neu5Gc antikorlarına sahiptirler.rgets. Burada, bu tür anti-Neu5Gc antikorlarını insan serumunda değerlendirmek için yüksek verimli bir sialoglikan mikroarray deneyi tarif ederiz. Neu5Gc içeren glikanlar ve bunların her biri bir çekirdek primer amin içeren eşleştirilmiş kontrol çiftleri (Neu5Ac içeren glikanlar), epoksi kaplı cam slaytlara kovalent olarak bağlanır. Baskı başına 896 diziye kadar çıkabilen özel bir nano-yazıcı kullanarak 16 slayt formatında 56 slaytın baskısını örnekledik. Her slayt, anti-Neu5Gc antikor özgüllüğünün, yoğunluğunun ve çeşitliliğinin değerlendirilmesi için 16 farklı insan serum örneğini taramak için kullanılabilir. Protokol, bu sağlam aracın karmaşıklığını tanımlar ve bir dizi formatında farklı klinik örneklerde Neu5Gc diyet karbonhidrat antijenine cevabı araştırmayı amaçlayanların temel bir kılavuz sağlar.

Dizi Baskı, Geliştirme ve Analiz: Birden fazla glikan numunesi ve insan IgG STD eğrileri ile 16 farklı bloktaki bir sialoglikan mikroarrayi basmak, tüm numunelerin, slayt başına ve tüm slaytlara aynı baskıda 16 blokta mümkün olduğunca eşit şekilde basılmasını sağlamak için kapsamlı kalibrasyona ihtiyaç duyar. Bu nedenle, spesifik baskı parametreleri belirlenmeden önce, her bir numune türü için tampon kompozisyonu, slayt tipi ve imalat, 384 gözlü plaka tipi, nem seviyeleri, 384 oyuklu plakadaki numune hacmi, ön Her numune tipi, insan IgG STD eğrisi konsantrasyonları ve markör tipi için baskı. Bu baskılı sialoglikan serisi plakaların dayanıklılığı, oda sıcaklığında karanlıkta vakumla sızdırmaz hale getirilmiş bir kutuda 10 ay kadar sürecek şekilde doğrulanmıştır. Her baskı deneyinde, tekdüzelikSia bağlayıcı lektinler ve antikorlar kullanarak kalite kontrol deneyleri ile daha da izlenir ve onaylanır. Gelişmekte olan ve tarama protokolleri aynı baskılardaki slaytlar içindeki ve arasındaki örnekleri karşılaştırarak tekdüzelik ve doğruluk elde etmek üzere optimize edildi. Slaytlar, optimum tıkanma koşulları (kimyasal ve biyolojik), yıkamalar ve kuluçka süreleri kullanılarak bloklar arasında uygun bir şekilde ayrılmayı sağlayan 16 bölmeli bölücü ile geliştirildi. Birincil ve ikincil tespit, minimal arka plan ve spesifik olmayan bağlanma ile maksimum algılama sağlamak için geniş çapta kalibre edildi. Slayt tarama ve analizi üzerine, çıktı sonuçları bir elektronik tablo dosyasına aktarıldı ve her bir noktadaki algılamayı belirlemek için analiz edildi. Her nokta, bir aykırı değer kontrolüne tabi tutuldu ve eğer QC&#39;yi karşılamadıysa atlandı (% CV&gt; 20 ise ve nokta dört replikattan ortalama bir standart sapmanın aralığının dışındaydı). Daha sonra, ortalama sinyal yoğunluğu afteR yerel örneklemin çıkartılması, basılı numuneye göre göreceli flüoresan birimi (RFU) veri noktası üretmek üzere numune başına tekrarlanan noktalar için ortalaması alınmıştır. IgG STD eğrilerinin tekdüzeliği, test edilen tüm bloklarda doğrulandıktan sonra, RFU değerleri ng / μL IgG&#39;ye normalize edildi ve deneyler arasındaki ve deneyler arasındaki numuneleri daha iyi karşılaştırma şansı verdi. Sia-bağlama Yüksek verimli tepki: Sialoglikan dizileri, Sia içeren glikanları bağlayan belirteçleri ( örn., Proteinleri, lektinleri, antikorları, virüsleri, vb. ) Tespit etmek için kullanılabilir. Baskı sonrası QC için, Sia bağlayıcı bitki lektinleri ve anti-Neu5Gc IgY kullanılır 19 . SNA, α2-6 bağlantılı Sia&#39;yı, MALII, α2-3 bağlantılı Sia&#39;yı bağlar ve anti-Neu5Gc IgY, Neu5Gc içeren siyaloglikanları bağlar, ancak Neu5A&#39;ya bağlamazC-içeren siyaloglikanlar 19 , Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi. QC deneyi, dört farklı iğneyi kullanarak basılı bloklar arasında spot baskı ve kimliğin ve değişkenliğin eksikliğini doğrulamayı amaçlıyor. Bloktan bloğa değişkenlik, slayt başına her bir birincil algılama için dört blok geliştirerek ve dört birimin her biriyle aynı ana algılama parçasıyla basılan blokları karşılaştırarak izlenir. Bundan sonra, önemli bir farklılığın bulunmadığından emin olmak için bir karşılaştırma yapılır. İnsan serumu, çeşitli insan hastalıkları 2 , 21 , 22 , 23 için ima edilen çeşitli anti-Neu5Gc antikorları 6 içerir. İnsan sera IgG&#39;sinde sialoglikanın tanımasını değerlendirmek için, sağlıklı insan vericilerinden alınan 12 serum, basılı sialoglikan mikrKürek ve flüoresan etiketli anti-insan IgG ( Şekil 2B ) kullanılarak geliştirildi. Her baskılı blok, tüm bloklarda karşılaştırılabilir ve homojen olan bir insan IgG STD eğrisi içerir ( Şekil 2C ). Her bloğun ( Şekil 2C ) STD eğrilerinin kalitesini doğruladıktan sonra bloktaki eğime göre normalize edilen glikan lekeleri sonuçları ve daha sonra seyreltme faktörü ile çarpılır. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, test edilen tüm insan serumları, Eşleştirilmiş Neu5Ac içeren sialoglikan çiftlerinin neredeyse hiç tanınmadığı çeşitli anti-Neu5Gc IgG seviyelerini ihtiva etmektedir. Ayrıca, anti-Neu5Gc IgG tanıma paternleri, hem yoğunluk hem de çeşitlilik seviyesinde bu 12 farklı serum arasında oldukça çeşitlidir. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56094/56094fig1.jpg" /> Şekil 1: Genel BakışDizi Baskı, Geliştirme ve Görüntü Analizi. ( A ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2, epoksi kaplı cam slaytlara basılan birincil amin ile temsili bir Neu5Gc-ihtiva eden Sia glikanı olarak gösterilir. ( B ) Baskılı diziler, çeşitli Sia bağlayıcı proteinler ile geliştirilir ve ardından uygun bir flüoresan etiketli sekonder antikor ile saptama yapılır. Her alt dizi ayrı ayrı geliştirilebilir. ( C ) Problanan slaydı bir floresan tarayıcıda taramak, tarayıcı görüntü yazılımı kullanılarak daha da analiz edilen bir görüntü üretir. Alt diziler, dizilerdeki her bir noktayı haritalandıran bir ızgarayla örtülür ve her spot için floresan tespit edilir. Sonuçlar daha sonra bir elektronik tablo dosyasına aktarılır. Tek bir kuyudaki tek bir dizi şematik olarak gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56094/56094fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56094/56094fig2v2.jpg" /> Şekil 2: Çeşitli Sia-Bağlayıcı Proteinleri Kullanan Sialoglikan Mikroarray&#39;lerin Profilleri. Slaytlar, her blokta bir tane olmak üzere 16 farklı primer tespit kısmı ile geliştirildi. ( A ) Temsilci, Sia&#39;ya spesifik bitki lektinleri SNA ve MALII&#39;nin ve poliklonal mono-spesifik tavuk anti-Neu5Gc IgY&#39;nin bağlanma modellerini gösteren bir QC slayttan 3 blok. Sonuçlar, her bir blok için ısı haritası formatında RFU olarak sunulan (kırmızı, beyaz ve mavi, 100, 50. temsil ediyordu ve 0. yüzdelik, sırasıyla). ( B ) 12 farklı sağlıklı insan serumu, 1: 100 seyreltmeyle test edildi ve anti-Neu5Gc IgG reaktivitesini profillemek üzere anti-huamn IgG ile saptandı. RFU verileri, her bir değeri, her spesifik bl&#39;de IgG STD eğrisi eğimine bölünerek ng / μL olarak normalize edildiVe daha sonra seyreltme faktörü ile çarpılır. Veri (sırasıyla, te 100, 50. ve 0. yüzdelik temsil beyaz, kırmızı ve mavi) tüm kombine bloklar için ısı haritası formatında temsil edilir. ( C ) Verilerin normalleştirilmesi için kullanılan insan serumu ile geliştirilmiş 12 bloğun insan IgG STD eğrileri. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56094/56094fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Glycan kimliği </td><td colspan="4"> yapı </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2 NH2 </td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2 &lt;/ alt&gt; NH2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2 NH2 </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 7 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2 CH2 NH2 </td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 9 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 11 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 12 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 13 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 14 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 15 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 16 </td><td colaçıklık = &quot;4&quot;&gt; Neu5Gcα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 17 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 18 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 19 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 20 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 21 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 22 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 23 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α6GalNAcαO (CH2) 2 CH2 NH2 </td></tr><tr><td> 24 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 25 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 26 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 27 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 28 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 29 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3GalβO (CH2) 2 CH2 NH2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td colspan="4"&gt; Neu5Gc9Acα3GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 31 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α6GalβO (CH2) 2 CH2 NH2 </td></tr><tr><td> 32 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 33 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 34 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2 CH2 NH2 </td></tr><tr><td> 36 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td&gt; 37 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2 NH2 </td></tr><tr><td> 38 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr><tr><td> 39 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2 NH2 </td></tr><tr><td> 40 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Baskılı Glccan Listesi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Birincil ikincil </td><td> Antikor / Lektin </td><td> Stok konsantrasyonu </td><td> Özgünlük </strong&gt; </td><td> Çalışma Seyreltme / Konsantrasyon </td></tr><tr><td rowspan="4"> Birincil tespit </td><td> Biotinilated-malii </td><td> 1 mg / mL </td><td> Α2-3 bağlantılı sialik asit </td><td> 1:50, 20 ug / mL </td></tr><tr><td> Biotinilated-SNA </td><td> 2 mg / mL </td><td> Α2-6 bağında sialik asit </td><td> 1: 100, 20 ug / mL </td></tr><tr><td> Tavuk anti-Neu5Gc IgY </td><td> ND </td><td> Neu5Gc Sialik asit </td><td> 1: 7.000 </td></tr><tr><td> Insan serumu </td><td> 100% </td><td> Çok sayıda epitop </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td rowspan="3"> İkincil Algılama </td><td> Cy3 Streptavidin </td><td> 0.75 mg / mL </td><td> biyotin </td><td> 1: 500, 1.5 ug / mL </td></tr><tr><td> Cy3-anti tavuk IgY </td><td> 0.75 mg / mL </td><td> Tavuk IgY </td><td> 1: 2000, 0.375 ug / mL </td></tr><tr><td> Cy3-anti İnsan IgG H + L </td><td> 0.6 mg / mL </td><td> HumaN IgG </td><td> 1: 1.500, 0.4 ug / mL </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Birincil ve İkincil Algılama Proteinlerinin Listesi. Ek Göstergeler: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56094/SUPP_040917Leviatan_Ben-Arye_JoVE_Rev1.docx">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay at JoVE.com

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

profiling-anti-neu5gc-igg-human-sera-with-sialoglycan-microarray

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Behavior

9.4K Görüntüleme.  Tel Aviv University.  İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir. 

Video: Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Kimya

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and determine glycan alterations in diseases. Most commercially available biopharmaceutical proteins are glycoproteins. The efficacy of these drugs is affected by glycosylation patterns. Therefore, an in-depth characterization method for the N-glycans is necessary. Here, we present a comprehensive approach for qualitative and quantitative analysis of N-glycans using hydrophilic interaction liquid chromatography equipped with fluorescence detection and tandem mass spectrometry (HILIC-FLD-MS/MS). N-glycans were released from glycoproteins with a facile method and labeled by a procainamide fluorophore tag in the strategy. Subsequently, the procainamide labeled N-glycans were analyzed by a HILIC-FLD-MS/MS technique. In this approach, N-glycan structures were confirmed by the tandem mass spectrometric analysis, whereas fluorescence detection was used for the quantitative analysis. An application for data analysis of the detected N-glycan peaks is described in the study. This protocol can be applied to any glycoprotein extracted from various species.

<meta charset="utf8"></head><body>Hidrofilik Etkileşim ile Glikoproteinlerin N-glikan Profili, Floresan ve Kütle Spektrometrik Tespiti ile Sıvı Kromatografisi

N-glycan profiling of glycoproteins is essential for discovering novel biomarkers and understanding glycan functions in cellular events. Additionally, N-glycan analysis of protein biopharmaceuticals is very important for human use. In this current article, a high-throughput strategy for identifying and quantifying N-glycan structures was presented using the HILIC-FLD-MS/MS technique.

Hidrofilik Etkileşim ile Glikoproteinlerin N-glikan Profili, Floresan ve Kütle Spektrometrik Tespiti ile Sıvı Kromatografisi

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and ...

Biyokimya

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing termini of oligo- and polysaccharides, as well as its unique chemical characteristics, sialic acid is involved in a multitude of different receptor-ligand interactions. By modifying the expression of sialic acid on the cell surface, sialic acid-dependent interactions will consequently be influenced. This can be helpful to investigate sialic acid-dependent interactions and has the potential to influence certain diseases in a beneficial way. Via metabolic glycoengineering (MGE), the expression of sialic acid on the cell surface can be modulated. Herein, cells, tissues, or even entire animals are treated with C2-modified derivatives of N-acetylmannosamine (ManNAc). These amino sugars act as sialic acid precursor molecules and therefore are metabolized to the corresponding sialic acid species and expressed on glycoconjugates. Applying this method produces intriguing effects on various biological processes. For example, it can drastically reduce&#160;the expression of polysialic acid (polySia) in treated neuronal cells and thus affects neuronal growth and differentiation. Here, we show the chemical synthesis of two of the most common C2-modified N-acylmannosamine derivatives, N-propionylmannosamine (ManNProp) as well as N-butanoylmannosamine (ManNBut), and further show how these non-natural amino sugars can be applied in cell culture experiments. The expression of modified sialic acid species is quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and further analyzed via mass spectrometry. The effects on polysialic acid expression are elucidated via Western blot using a commercially available polysialic acid antibody.

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid is a typical monosaccharide-unit found in glycoconjugates. It is involved in a plethora of molecular and cellular interactions. Here we present a method to modify cell surface sialic acid expression using metabolic glycoengineering with N-acetylmannosamine derivatives.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Biyomühendislik

<meta charset="utf8"></head><body>Tek Uçta Boncuk Dizisi (BIST) Kullanarak Otomatik Lektin Bazlı Glikan Profili Oluşturma

Rapid Glyco-Qualitative Assessment of Recombinant Proteins Using a Fully Automated System

Protein glycosylation, a critical post-translational modification, influences the stability, efficacy, and immunogenicity of recombinant proteins, including biopharmaceuticals. Glycan structures exhibit significant heterogeneity, varying with production cell types, culture conditions, and purification methods. Consequently, monitoring and evaluating the glycan structures of recombinant proteins is vital, particularly in biopharmaceutical production. The lectin microarray, a technique complementary to mass spectrometry, boasts high sensitivity and ease of use. However, it typically requires more than a day to yield results. To adapt it to non-glycoscience research or drug product process development, an automated, high-throughput alternative is needed. Therefore, the world's first fully automated lectin-based glycan profiling system was developed, utilizing the "bead array in a single tip (BIST)" technology concept. This system allows for the preparation and storage of lectin-immobilized beads in units of 1,000, with customizable parallel insertion orders for various purposes. This article presents a practical protocol for research involving "glyco-qualified" recombinant proteins. After testing their reactivity against 12 polyacrylamide-glycan conjugates, 15 lectins were selected to increase the system's versatility. In addition, the sample labeling process was optimized by switching from Cy3 to biotin, reducing the overall processing time by 30 min. For immediate data qualification, lectin-binding signals are displayed as a dotcode on the top monitor. The system's reliability was confirmed through day-to-day reproducibility tests, repeatability tests, and long-term storage tests, with a coefficient of variation of &lt;10%. This user-friendly and rapid glyco-analyzer has potential applications in the quality monitoring of endogenous glycoproteins for biomarker evaluation and validation. This method facilitates analysis for those new to glycoscience, thereby broadening its practical utility.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tam Otomatik Bir Sistem Kullanarak Protein Glikozilasyon Araştırmalarını İlerletmek

A system for the automated and rapid analysis of glycans on proteins was previously developed. This article presents the protocol for "glyco-qualitative analysis," optimized for a broad spectrum of users, such as those engaged in analyzing glycan structures in biopharmaceuticals and other glycoconjugate materials.

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Protein glycosylation, a critical post-translational modification, influences the stability, efficacy, and immunogenicity of recombinant proteins, ...

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the individual immune condition determines the success in combating internal and external potential threat signals, but also the existence of a particular pattern of circulating anti-glycan antibodies (and their serological level variation) could be a significant marker of the onset and progression of certain pathological conditions. Here, we describe a Printed Glycan Array (PGA)-based methodology that offers the opportunity to measure hundreds of glycan targets with very high sensitivity; using a minimal amount of sample, which is a common restriction present when small animals (rats, mice, hamster, etc.) are used as models to address aspects of human diseases. As a representative example of this approach, we show the results obtained from the analysis of the repertoire of natural anti-glycan antibodies in BALB/c mice. We demonstrate that each BALB/c mouse involved in the study, despite being genetically identical and maintained under the same conditions, develops a particular pattern of natural anti-carbohydrate antibodies. This work claims to expand the use of PGA technology to investigate repertoire (specificities) and the levels of circulating anti-carbohydrates antibodies, both in health and during any pathological condition.

This work shows the potential of printed glycan array (PGA) technology for the analysis of circulating anti-carbohydrate antibodies in small animals.

Anti-Neu5Gc IgG'yi İnsan Sera'sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

Hidrofilik Etkileşim ile Glikoproteinlerin N-glikan Profili, Floresan ve Kütle Spektrometrik Tespiti ile Sıvı Kromatografisi

Hidrofilik Etkileşim ile Glikoproteinlerin N-glikan Profili, Floresan ve Kütle Spektrometrik Tespiti ile Sıvı Kromatografisi

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği