Name: in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells at JoVE.com

Bu çalışmada bilim ve teknoloji Komisyonu Shanghai (Grant No. 14411961800) ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (Grant No. 81300805) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

1. algılama, endojen Rb SUMOylation erken G1 faz <ol><li>hücre kültür ve hücre döngüsü eşitleme.
	<ol><li>Büyüme orta Dulbecco içeren hücrelerde korumak HEK293 &#39; s % 1 kalem-Strep ve % 10 fetal sığır serum (FBS) 37 ° C ve % 5 CO 2 bir kuluçka adlı ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).</li>
		<li>HEK293 hücreleri G0 aşamasında eşitleyin.
		<ol><li>Sayısı 15 cm hemasitometre ve tohum ~1.5 x 10 7 hücreleri kullanarak HEK293 hücreleri ile tedavi öncesi 24 h için 25 ml büyüme orta çanağı. Orta ve yıkama % 70 - % 80, aspiratı izdiham ulaştıktan sonra hücreleri iki kez 5 mL ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) prewarmed.</li>
			<li>Ekle 25 mL % 1'i içeren DMEM penisilin-streptomisin ve 72 h. yıkamak için hücreleri 3 mL buz gibi PBS kullanarak plaka dışına 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Hücreleri yeni bir 5 mL tüp içine transfer.</li>
			<li>Akış Sitometresi (Adım 1.2) tarafından hücre döngüsü analizi için hücreleri küçük bir bölümünü konu; 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de Santrifüjü tarafından kalan çoğunluk hücre toplama ve sonra onları analiz kadar bir ultra-düşük sıcaklık dondurucuda saklayın Rb SUMOylation,.</li>
		</ol></li> <li>G1-faz elde etmek için hücreleri G0 eşitleme işleminin sonunda DMEM kaldırın ve geri taze büyüme orta, böylece HEK293 hücreleri hücre döngüsü yeniden girmek izin ekleyin. Daha sonra farklı G1 aşamaları, hücreleri toplamak (erken G1: 30 dk; G1: 2 h) analizi ve daha fazla SUMO hücre döngüsü için tahlil.</li>
		<li>HEK293 hücre çift-timidin blok yöntemini kullanarak S aşamasında eşitleyin.
		<ol><li>Bir confluency % 50 ve yıkama hücrelere büyümek HEK293 hücre prewarmed PBS ile. Daha sonra büyüme orta ile 2.5 mM timidin 18 h (ilk blok) için takıma ekleyin.</li>
			<li>Timidin içeren orta kaldırın ve sonra hücreleri iki kez prewarmed PBS ile yıkayın. Taze büyüme orta hücreleri serbest bırakmak 14 h için eklemek.</li>
			<li>Bir pipet ile orta atmak ve hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce büyüme orta 2.5 mM timidin için başka bir 18 h (ikinci blok) ile takıma ekleyin.</li>
		</ol></li> <li>G2/M için senkronizasyon, plaka ~1.5 × 10 7 HEK293 hücreleri ile 25 mL büyüme orta 24 h için 15 cm çanak için. 400 ng/mL nihai bir konsantrasyon elde edilir kadar nocodazole Orta olarak ekleyin. Son olarak, hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce 16 h için hücreleri kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Hücre döngüsü analizi Akış Sitometresi ile.
	<ol><li>Eşitlenmiş HEK293 PBS içinde yeniden askıya alma ve buz gibi % 70 etanol için 2 h 4'te kullanarak hücre süspansiyon düzeltin Bu hücre kümeleme en aza indirmek için hücre süspansiyon dropwise son bir konsantrasyon elde etmek için buz gibi % 100 etanol ekleyin unutmayın ° C. Yavaşça vortexing ise % 70 etanol.</li>
		<li>Hücreleri, 500 x g, 5 min için santrifüj kapasitesi sonra dikkatle süpernatant atmak ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Santrifüj adımı yineleyin.</li>
		<li>Ekle 500 µL PBS içeren 50 µg/mL nükleik asit propidium iyodür, %0,1 Triton X-100 ve 1 µg/mL RNase A hücrelere leke ve iyice karıştırın. 15 dk 37 için hücreleri kuluçkaya ° C.</li>
		<li>4 ° C'de örnekleri analiz kadar Akış Sitometresi tarafından depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitation endojen Rb protein.
	<ol><li>Hazırla HEK293 hücre lysates.
		<ol><li>Lyse yavaşça onları buz gibi radyo-immunoprecipitation tahlil (RIPA) lizis arabellek (Tablo 1) 1 ml taze içeren yeniden askıya eşitlenmiş HEK293 hücreleri 20 mM N-Ethylmaleimide, olabilir bir isopeptidase inhibitörü eklendi SUMO proteaz engellemek ve SUMO conjugates stabilize.</li>
			<li>Daha fazla buz Dounce Homojenizasyon, sonication veya sadece 10 kat 2 mL şırınga üzerinde bağlı 21 G iğne üzerinden geçerek hücrelerdeyse lunaparkçı. Sonra buz 5 dakika süreyle hücrelerdeyse kuluçkaya 
			Not: Rb protein ve diğer arasında kovalent olmayan etkileşim türetilir belirsiz SUMO sinyal ortadan kaldırmak gibi RIPA arabellekte Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) Rb-SUMO, daha sonra belirlenmesi için çok önemlidir Non-Rb türler-SUMO.</li>
		</ol></li> <li>Hücre lysates 18.000 x g 30 dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C. Transfer supernatants yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için. 
		Not: Protokol burada duraklatılmış. Proteinler-80 ° C'de en az 6 ay süreyle saklanabilir.</li>
		<li>Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yukarıda açıklanan süpernatant küçük bir bölümünü kurtarmak-e doğru yeni tüp ve-80 mağazasında ° C.</li>
		<li>Yukarıdaki supernatants için 1 µg G non-spesifik fare immünglobulin (IgG) aynı tür ve izotip monoklonal Rb antikor ve 20 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. O zaman, nazik rotasyon ile 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi 3000 x g 3 dk de örnekleri 4'te ° C. dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için aktarabilirsiniz. Her örnekleri, 5 µL Rb birincil antikor ve 40 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. Sonra bir gecede nazik rotasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Boncuk Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından toplamak ve dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın. Boncuk kaybını önlemek için dikkat edin, boncuk kuru Aspire değil.</li>
		<li>Boncuk dört kez RIPA arabelleği 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de onlara 4 ° C'de 15 dakika süreyle toplamak döndürme tarafından düşük hızlı Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından boncuk mix ve supernatants atın.</li>
		<li>Supernatants son yıkama servisinden kaldırdıktan sonra Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) yükleme arabellek (Tablo 1) x 30 µL 1 boncuk yeniden askıya alma ve iyice karıştırın.
		10 dk santrifüj kapasitesi için örnekleri boncuk cips için 1 dakika için 12.000 x g de <ol><li>Incubate bir sıcakta 100 ° C'de tüpler engelleyin. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için transfer.</li>
		</ol></li> <li>Analiz örnekleri tarafından % 4 - % 20 degrade SDS-sayfası jel ve Western blot veya bunları-20 ° c daha sonra kullanmak üzere saklamak.</li>
	</ol></li></ol> 2. 6XHis öğesini eksojen Rb SUMOylation insan hücrelerinde analizi <ol><li>hücre kültür ve transfection.
	<ol><li>Tohum ~ 6 × 10 6 HEK293 hücreleri 10 cm çanak ve % 75-%85 Konfluent hücreleri elde etmek için normal hücre kültür koşullarda büyüme ortamda 24 h için kuluçkaya. Transfection önce büyüme orta kaldırmak ve prewarmed düşük serum orta 6 mL ekleyin (Tablo malzemeleri görmek) ve bulaşık kuluçka makinesi geri yerleştirin.</li>
		<li>İçin Rb bünye SUMOylation tahlil, eklemek 6XHis öğesini Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT ve Ubc9-C93S Plazmidler her 15 µg içinde 500 µL düşük serum 1,5 mL mikro-santrifüj tüpler, ortamda anılan sıraya göre.
		SUMO-konjugasyon vahşi türü Rb ve onun SUMOylation-arızalı mutant analiz etmek, ya da 6XHis öğesini Rb-WT veya Rb-K720R plazmid GFP-SUMO1 birlikte 10 µg mix <ol><li>(10 µg) 500 µL serum ortamda 1,5 mL mikro-santrifüj azaltılmış 13 tüpler.</li>
		</ol></li> <li>Bu arada, ayrı bir tüp içinde 50 µL transfection reaktif mix (Tablo malzemeleri görmek) 500 µL serum orta azaltılmış ve 5 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
		<li>Tam olarak yukarıda açıklanan iki ayrı tüp birleştirmek ve 15 dk. Ekle transfection oda sıcaklığında reaktif/plazmid kompleksleri hücrelere kuluçkaya ve kültür 8 için devam 37 ° c de % 5 CO 2 s</li>
		<li>İle büyüme orta düşük serum orta yerine ve hücreler normal kültür koşullar için 48 saat altında transfection sonra kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Nikel 6XHis öğesini Rb protein benzeşme yıkmak.
	<ol><li>Transfected HEK293 hücreleri parçalayıcı ve toplam protein açıklanan bölüm 1.3.1 ayıklamak.</li>
		<li>Santrifüj hücre lysates 18.000 x g de 30 dk 4 ° C. dikkatle supernatants toplamak ve temiz tüpler transfer. 
		Not: Protein bu noktada-80, 6 aydan fazla donmuş olabilir ° C.</li>
		<li>Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yeni tüp ve-80 mağazasında için yukarıda açıklanan supernatants küçük bir bölümünü kaydedin ° C.</li>
		<li>Yıkama 25 µL % 50 nitrilotriacetic asit (Ni-NTA) özel boncuk RIPA arabelleği iki kez her örnek için bir 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü ile nikel. 4 3 dk 3000 x g de Santrifüjü tarafından boncuk toplamak ° C.</li>
		<li>Ekleyin 1 M imidazole 10 mM son bir konsantrasyon elde etmek için her örnek için. Sonra her örnek hazır Ni-NTA özel boncuk içeren tüp ekleyin.</li>
		<li>Boncuk ve nazik rotasyon ile 4 ° C'de 2 h için lysates kuluçkaya. Boncuk 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de spin ve pipetting tarafından supernatants dikkatli bir şekilde çıkarın. Boncuk kayıplarını önlemek için boncuk kuru Aspire edin değil.</li>
		<li>Boncuk yıkama arabelleği 20 mM imidazole (Tablo 1) içeren 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de rotasyon 15 dk. toplamak için 4 ° C'de tarafından boncuk iplik 4 ° C'de 3 dk 3000 x g de tarafından karıştırın ve supernatants atın.</li>
		<li>Son yıkama sonra elüsyon 30 µL arabellek içeren 250 mM imidazole (Tablo 1) her örnek için ekleyin ve karıştırarak hafifçe vur. O zaman, proteinler elute 4 ° c 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Her örnek 6 × SDS-sayfa yükleme arabellek (Tablo 1) ile karıştırın. Sonra bir ısı blok için 10 dk. içinde 100 ° C'de tüpler kuluçkaya</li>
		<li>Santrifüj 12.000 x g boncuk cips için 1 dakika için. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve örnekleri 1,5 ml mikro-santrifüj tüpleri için transfer. Western blot tarafından analiz veya daha sonra kullanmak için-20 ° C'de depolanan örnekleri.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western Blot <ol><li>immunoprecipitation yük veya % 4-20 degrade SDS-sayfa jelleri üzerine önceki adımlardan gelen elde edilen örnekler aşağı çekin. Elektroforez 120 V proteinler ayırmak 90 dk için kuralları.</li>
	<li>Transfer proteinler jel bir polivinilidin difluoride (PVDF) membran tarafından electroblotting vasıl 300 mA tank aktarım yöntemini kullanarak 4 ° C'de 90 dk için. Oda sıcaklığında 1 h için %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabellekte PVDF membran engellemek.</li>
	<li>Incubate membran ile birincil antikor antikor seyreltme arabelleği % 3 sığır serum albumin (BSA) (Tablo 1) içeren bir 4 ° C'de gecede Birincil antikorlar için bir çalışma konsantrasyonu olarak 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antikor) veya 1:2000 (anti-Rb ve anti-tübülin antikorları) veya 1:5,000 (anti-GFP ve anti-O'nun antikor) bir seyreltme kullanın.</li>
	<li>Yıkama membran 3 x 10 dk 1 x tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik ile ara (TBST) tampon (Tablo 1) kullanarak her zaman için. Membran türler belirli Horseradish peroksidaz HRP Birleşik ikincil antikorlar seyreltilmiş 1:5,000 %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabelleği ile kuluçkaya. Membran 3 yıkama x 10 dk 1 x TBST tampon kullanarak her zaman için.</li>
	<li>Membran çözüm çalışma gelişmiş Kemiluminesan ile (ECL) kuluçkaya. Plastik wrap ile membran kapak ve sinyal gücüne bağlı olarak X-ray film maruz kalmaktadır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases.">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G1+cell-cycle+control+and+cancer.">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control.">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li><li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RB+and+cell+cycle+progression.">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li><li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene.">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li><li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rb/chromatin+connection+and+epigenetic+control:+opinion.">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li><li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria.">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li><li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+within+the+pRb+pathway:+is+there+a+code+of+conduct.">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li><li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function.">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li><li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+(pRb)+by+cyclin+D:Cdk4/6+complexes+results+in+active+pRb.">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li><li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor.">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+SUMO-2/3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways.">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li><li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase.">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li><li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+in+sumoylation:+a+decade+on.">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li><li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation:+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease.">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li><li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer.">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li><li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation.">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li><li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+(RB)+and+Lamin+A/C+interaction+and+stabilization.">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li><li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+(UFDS):+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation.">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2/3.">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li><li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues.">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu kağıt algılayabilir ve Rb endojen SUMOylation insan hücrelerinde çözümlemek için bir protokol açıklar. Bu yöntem özellikle küresel sinyal SUMO ile ilgili herhangi bir değişim olmadan endojen Rb protein üzerinde duruldu gibi Rb-SUMO değişiklik tamamen doğal fizyolojik koşullar altında soruşturma için önemli bir araçtır.
Bu amaca ulaşmak için unutmayın ki bu: 1) SUMO dört izoformlarının (SUMO1-4, her farklı genler tarafından kodlanmış) ubiquitination ile ka...

Ökaryotik hücrelerde hücre döngüsü progresyon doğru kontrolü belirli olaylar gerçekleşecek bir sıralı şekilde1,2sağlar sıkı bir düzenleyici ağ temel alır. Retinoblastom (Rb) protein, ilk klonlanmış Tümör baskılayıcı1,3bu ağda önemli oyuncularından biri. Rb protein S faz geçiş ve tümör büyüme4,5G0/G1 için özellikle hücre döngüsü progresyon negatif bir regülatör olduğu düşünülmektedir. Ya doğrudan Rb işlev başarısız olur, çocuklarda en sık görülen göz içi malignite için Retinoblastom, ya da kanser5diğer birçok türde katkı sağlıyor. Ayrıca, Rb hücre farklılaşması, Kromatin remodeling ve mitokondri-aracılı apoptosis3,6,7de dahil olmak üzere birçok hücresel yollar ilgilenmektedir.
Translasyonel modifikasyonlar RB işlevi8,9yönetmelikte önemli bir rol oynamaktadır. Fosforilasyon böyle bir değişiklik olduğunu ve genellikle Rb inactivation için yol açar. Durgun G0 hücrelerde, Rb düşük fosforilasyon düzeyiyle etkindir. İlerleme G0/G1 evresi boyunca hücreleri Rb sırayla hiper-fosforile siklin bağımlı protein kinaz (CDKs) ve Rb devre dışı bırakın ve hücre döngüsü bastırmak yeteneğini ortadan siklinlere, siklin E/CDK2 ve siklin D/CDK4/6 gibi bir dizi olduğu gen ifadesi4,10ile ilgili. RB da küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO)11,12,13tarafından değiştirilmiş olabilir.
SUMO hedef proteinlerin çeşitli kovalent bağlı bir Ubikuitin benzeri proteindir. Hücre döngüsü Yönetmeliği de dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçler için önemlidir, transkripsiyon, protein Hücrede yerleşimi ve bozulması, taşıma ve DNA tamir14,15,16, 17 , 18. SUMO konjugasyon yolu dimerik SUMO E1 aktive enzim SAE1/UBA2, tek E2 conjugating enzim Ubc9, birden çok E3 ligazlar ve SUMO özgü proteaz oluşur. Genel olarak, yeni doğmakta olan SUMO proteinler proteolytically olgun formu oluşturmak için işlenmesi gerekir. Olgun SUMO E1 heterodimerdir tarafından etkinleştirilir ve E2 enzim Ubc9 transfer. Son olarak, SUMO C-terminal glisin kovalent bir substrat hedef lizin Birleşik ve bu işlem genellikle E3 ligazlar tarafından yönetilir. SUMO protein değiştirilmiş substrat belirli proteaz tarafından kaldırılabilir. Bu kağıt yazarlar tarafından bir önceki çalışma Rb SUMOylation hiper-fosforilasyon için erken G1 faz, hücre döngüsü ilerleme13için gerekli olan bir işlem önde gelen CDK2, onun bağlama artırır saptandı. Biz de Rb SUMOylation bir azalma hücre çoğalması kaybolmasına neden olduğunu gösterdi. Ayrıca, son zamanlarda Rb SUMOylation Rb protein proteasomal işlemlerinden, böylece artan Rb protein hücreleri19düzeyini korur gösterilmiştir. Bu nedenle, SUMOylation çeşitli hücresel süreçler Rb işlevinde önemli bir rol oynar. İleri çalışmalar için işlev sonucu ve Rb SUMOylation, fizyolojik alaka Rb insan hücreleri veya hasta dokuların SUMO durumunu analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirmek için önemli.
SUMOylation tersine çevrilebilir, son derece dinamik bir süreçtir. Böylece, genellikle tamamen endojen koşullar altında SUMO modifiye proteinleri tespit etmek zordur. Bu kağıt endojen Rb SUMOylation tespit etmek için bir yöntem sunar. Ayrıca eksojen Rb SUMOylation vahşi tipi Rb ve SUMO-eksik mutasyon11algılamak gösterilmiştir. Özellikle, Jacobs ve ark. özellikle Ubc9 füzyon Yönetmen: SUMOylation (UFDS)20tarafından verilen bir substrat SUMO modifikasyonu artırmak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem üzerinde bağlı olarak, bu iletişim kuralını zorla SUMOylation Rb ve fonksiyonel sonuçları analiz açıklar. Verilen bu SUMO yüzeylerde yüzlerce daha önce tarif var ve daha fazla sözde SUMO yüzeylerde birçok proteomik tabanlı deneyleri tespit edilmiştir, bu iletişim kuralı bu proteinler insan hücrelerinde SUMO modifikasyonu analiz etmek için uygulanır.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E3876&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G-Sepharose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>SUMO1 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>GFP antibody</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells

Translasyonel modifikasyonlar proteinlerin hücre içi sinyal iletimi uygun düzenlenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu değişiklikler arasında küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) hedef proteinlerin hücresel süreçler, gen transkripsiyon, DNA tamiri, protein gibi düzenlemek için çeşitli lizin artıkları kovalent bağlı olduğu bir Ubikuitin benzeri proteindir etkileşim ve bozulması, hücre altı taşıma ve sinyal iletimi. Protein SUMOylation tespit için en yaygın yaklaşım ifade ve bırakmak için basit ve uygun mekanik adresleme için bir vitro biyokimyasal reaksiyon bakteri, rekombinant tagged proteinlerin saflaştırılması dayanır sorular. Ancak, SUMOylation vivosürecinin karmaşıklığı nedeniyle, öyle algılamak ve protein SUMOylation hücrelerde endojen koşullar ne zaman altında özellikle çözümlemek için daha zor. Bu kağıt yazarlar tarafından yapılan bir çalışmada endojen Retinoblastom (Rb) protein, hücre döngüsü ilerleme olumsuz düzenlenmesi çok önemlidir bir Tümör baskılayıcı özellikle SUMOylated erken G1 aşamasında saptandı. Bu kağıt algılama ve Rb SUMOylation çözümleme insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı SUMO-değişiklik Rb, aynı zamanda birçok diğer SUMO hedefli protein, insan hücrelerinde phenotypical ve fonksiyonel incelenmesi için uygundur.

Hücre döngüsü ilerleme sırasında endojen Rb SUMOylation algılamak için bu çalışma ilk HEK293 hücreleri hücre döngüsü (G0, erken G1, G1, S ve G2/M) beş farklı aşamalarında bu kağıt Protokolü bölümünde açıklandığı gibi senkronize. Eşitleme kalitesini nükleik asit leke Akış Sitometresi Analizi (şekil 1) tarafından takip propidium iyodür kullanılarak doğrulandı. Daha sonra hücreleri toplanmış ve RIPA arabellek denaturin...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells at JoVE.com

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) aile proteinler hedef proteinlerin çeşitli hücresel süreçler düzenleyen lizin kalıntıları Birleşik. Bu kağıt Retinoblastom (Rb) protein SUMOylation insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda tespiti için bir protokolünü açıklar.

Vivo Algılama ve Rb Protein SUMOylation insan hücrelerinde analizi

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

7.2K Görüntüleme.  Eye and ENT Hospital of Fudan University. Küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) aile proteinler hedef proteinlerin çeşitli hücresel süreçler düzenleyen lizin kalıntıları Birleşik. Bu kağıt Retinoblastom (Rb) protein SUMOylation insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda tespiti için bir protokolünü açıklar.

Video: In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biyokimya

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

Karaciğer Kanserinde SUMO Proteomunun Zenginleştirilmesi, İzolasyon, Tanımlama ve Karakterizasyonu Için Araçlar Olarak SUMO Bağlayıcı Varlıklar (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biyoloji

Her Yerde Bulunan, SUMOile Edilmiş ve ADP-Ribosile Edilmiş DNA-Protein Çapraz Bağlarının Ölçülmesi

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Yazar Spotlight: DNA Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Vivo Algılama ve Rb Protein SUMOylation insan hücrelerinde analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Karaciğer Kanserinde SUMO Proteomunun Zenginleştirilmesi, İzolasyon, Tanımlama ve Karakterizasyonu Için Araçlar Olarak SUMO Bağlayıcı Varlıklar (SUBEs)

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Protein Ubikitinasyon Tespiti

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği