Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı KARİYER Ödülü (0953583) ve Sağlık NCI / R21-CA116102 Ulusal Enstitüsü NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, tek bir oligonükleotid (RBMB1) bir CF640R muhabir boya 5&#39;-ucunda etiketlenmiştir ve aşağıdaki diziye sahiptir: 5&#39;-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC mUmU-3 &#39;. Saç tokası yapısının oluşumunu tahrik Öz-tamamlayıcı etki, cesur vardır. İkinci oligonükleotid (RBMB2) bir Iowa Siyah RQ-Sp söndürücü ile 3&#39;-ucunda etiketlenmiştir ve sekansına sahiptir: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 &#39;. RBMBs hazırlanması 1. <ol><li> RBMB1 ve RBMB2 oligonükleotidleri içeren bu tüplerin hızlı bir spin gerçekleştirme kurutuldu, oligonükleotid 100 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde DNase ve RNase-içermeyen su içinde tüpünün dibine ve tekrar süspansiyon olduğundan emin olmak için. Örneğin, oligonükleotidin 10 nmol numune su içinde yeniden süspanse 100 ul olmalıdır. </li><li> Ölçümure, UV-vis spektroskopi ile RBMB1 ve RBMB2 stok numuneleri tesisinin konsantrasyonu. <ol><li> Bir mikrosantrifüj tüpü içinde (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 117 ul DPBS RBMB numunenin 3 ul karıştırın. </li><li> DPBS Boş spektrofotometre ve 200-800 nm absorbans ölçümü. Not: Tepe 260 nm&#39;de absorbans 650 nm görülebilir olmalıdır. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak, 260 nm&#39;de (ve RBMB1 için 650 nm) &#39;de abzorbans göre RBMB numunelerin stok konsantrasyonu hesaplanır: Stok Konsantrasyon (M) A 260 260 nm&#39;de absorbans ve seyreltme faktörü 40 olan A 260 * seyreltme faktörü / söndürme katsayısı =. Not: RBMB için söndürme katsayısı oligonükleotid üreticisi tarafından sağlanan özellikler sayfasında bulunabilir. 650 nm&#39;de CF640R söndürme katsayısının 103,000 olan. </li></ol></li><li> 100 uM RBMB1 20 ul, 100 uM RBMB2 30 ul, karışım, 6 ul 10xFosfat tamponu (10x fosfat tampon çözeltisi: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mM KH 2 PO 4, 140 mM NaH 2 PO 4, pH 7.2) ve 4 ul DNase ve RNase-barındırmayan su bulunmaktadır. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. Not: Bu, yaklaşık olarak 50 çalışmaları için yeterlidir. </li><li> Herhangi bir melezleşmemiş RBMB2 oligonükleotidleri kaldırmak hazırlık derecesindeki Superdex 75 kullanılarak bir sıvı kromatografi sütunu hazırlayın. Karma probların küçük hacimli saflaştırmak için bir ~ 4 ml yatak hacmi ile 8 mL (0.7 x 20 cm), sıvı kromatografi sütunu kullanın. </li><li> Yıkama, 0.6 ml / dk bir akış oranında bir akış hızında çalışan bir şırınga pompası kullanılarak ~ 1x fosfat tamponu, 50 ml Superdex dengelenmesi ve. Sıvının tümü yatak hacimli girmeden önce, şırınga pompası durdurmak ayırmak ve geriye kalan sıvı yerçekimi ile sütun geçelim. </li><li> Kromatografi kolonuna RBMB karışımı (60 ul) yükleyin. <ol><li> RBMB örnek tamamen sahiptir sonrayatak girdi yavaşça bütün örnek tamamen sütun girdiğini sağlamak için yatağın üst 1x fosfat tampon başka bir 250 ul. </li><li> 1x fosfat tampon maddesi ile jant sütunu doldurun. Üst kapatın ve şırınga pompası başlamak - şırınga ile doldurulmalıdır ~ 50 ml PBS 1x ve 0.6 ml / dk bir akış hızında gerçekleştirilmiştir. </li><li> RBMB sütunun alt yaklaştığında kere - RBMB numunesi tipik kolayca probu içerisine dahil boyanın rengine bağlı olarak görselleştirilebilir - mikrosantrifüj tüpü başına 2 damla (1.5 mi) akış yoluyla toplayın. Mikrosantrifüj tüpleri içinde renk açık hale geldikten sonra bir numunenin alınması durdurun. </li></ol></li><li> Genellikle 5-6 tüpleri - - renkli RBMB örneği içeren tüpler birleştirin ve bir santrifüj filtre cihazı (10.000 MW kesme) yüklenemedi. 20 dakika boyunca ya da istenen hacme kadar 10000 RCF santrifüjleyin. Not: Bu hızları ve süreleri, tipik~ 30 ul&#39;lik nihai bir hacim elde edildi. </li><li> UV-Vis spektroskopisi yoluyla saflaştırılmış RBMB numunenin tam konsantrasyonu ölçümü. <ol><li> Konsantre RBMB numunenin 3 ul alın ve bir mikrosantrifüj tüp içinde 117 ul DPBS ile karıştırın. </li><li> DPBS Boş spektrofotometre ve 200-800 nm absorbans ölçümü. Not: Tepe 260 nm&#39;de absorbans 650 nm görülebilir olmalıdır. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak, 650 nm&#39;de absorbans göre melezleştirilmiş RBMB stok konsantrasyonu hesaplanır: Hazır Konsantrasyon (M) bir 650 650 nm&#39;de emicilik olan bir 650 x seyreltme faktörü / sönmüş katsayısı = seyreltme faktörü 40&#39;tır. Not: 650nm de CF640R için yok olma katsayısı 103,000 ve Iowa siyah RQ söndürme katsayısının ~ 20000. Söndürme katsayısı katkı maddesi olan ve melezleştirmeyi duyarlı değildir. Bu nedenle, örnek stok RBMB approximatel birleştirilmiş bir sönüm katsayısının650 nm&#39;de Y 123,000. </li></ol></li><li> Gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de adı ve konsantrasyon ve mağaza ile uygun tüp etiketleyin. </li></ol> 8 oyuklu odacıklı coverglass Kaplı poli-D-lisin 2. Hazırlık <ol><li> Steril bir ortamda sterilize edilmiş 25 ml su içinde Poly-D-lisin (liyofilize edilmiş tozu, G-irradyasyona maruz bırakılmış), 5 mg çözülmesiyle poli-D-lizin, 0.2 mg / ml çözelti hazırlayın. </li><li> Steril bir ortamda bir 8 oyuklu odacıklı coverglass her çukuruna 0.2 mg / mL poli-D-lisin çözeltisinin 200 ul ilave edin. </li><li> Hücre kültürü kaputu 16-18 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Poli-D-lisin aspire ve steril damıtılmış su ile oyuk 3 kez yıkayın. Not: Kaplanmış bölmeli lamlar 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 3. Probe Teslimat Not: en az 4 ardışık olarak bağlanan RNA eksprese eden bir entegre bir gen yapısını içermelidir ikinci hücre sistemini3&#39;-tercüme edilmemiş bölge (UTR) için siteler RBMB ing. Hedef sekansları, RBMB uzanımına göre tamamlayıcı olmalıdır. Bir negatif kontrol olarak, aynı hücre çizgisi, aynı gen yapısını ifade etmek için tavsiye fakat birbiri ardına dizilmiş tekrar temin etmemektedir. Bu protokol, insan fiberli sarkoma hücre çizgisi, HT1080, 3&#39;-UTR RBMB hedef dizinin 96 tandem tekrarı ile GFP RNA&#39;yı ifade etmek için üretilmiştir. Kontrol hücre çizgisi, vahşi tip GFP RNA&#39;yı ifade etmek için üretilmiştir. <ol><li> Bir gün sonda teslimattan önce% 40-50 confluency bir T25 şişesi Levha hücreleri. Kültür,% 1 pen / strep,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM ortamı, hücreleri, ve% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, microporator açın ve 950 V, 2 bakliyat, 25 msn mikrogözeneklendirme parametrelerini ayarlamak. Bu parametreler, HT1080 hücreler için optimize edilmiştir, ancak bağımlı hücre tipidir ve adjus olabilir: Notted diğer hücre türleri için üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi. </li><li> 4 mi elektrolitik tamponu ile gözeneklendirilmesinde tüp doldurun ve gözeneklendirme istasyonu üzerine yerleştirin. </li><li> Saflaştırılmış RBMB stok örnek çıkarın ve buzunu. 1x fosfat tampon maddesi ile 12 uM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar birkaç mikrolitre seyreltin. 1 ul her mikroporasyonu için gereklidir. </li><li> Pipet FBS ile, ancak bir mikrosantrifüj tüpü içine, antibiyotikler olmaksızın kültür ortamı 1 mi. Not: Bu sefer olmak için, mikrogözeneklendirme cihazın yakınında, mikroporasyonu hemen sonra hücrelerin askıya kullanılacak ve kenara olabilir. Kültür ortamında antibiyotik dahil mikroporasyonu sonra hücre canlılığını azaltır. </li><li> Bir kere 1 mi Ca 2 + 2 + ve Mg-free DPBS Hücreleri yıkamak, işlenmiş HT1080 hücreler (% 60-80 ortak akışlı) hücre kültür ortamını çıkarın ve 1-2 dakika boyunca 1 ml tripsin ile inkübe edin. </li><li> Trypsinizatio durdurunantibiyotik ve fenol kırmızısı olmaksızın,% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 1 mi DMEM ortamı, ekleme ve iki adet 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine hücreleri aktarırlar: n. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de mikrosantrifüj tüpü içinde hücreleri aşağı dönerler. Süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın ve 1 ml DPBS nihai hacimde hücre pelletleri birleştirir. </li><li> Iyi karıştırılmış hücre süspansiyonundan 10 ul ve al hücreleri sayın. </li><li> Emin onlar da dağılır yapmak ve yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine DPBS ile 300.000 hücreleri aktarmak ve 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de spin yukarı ve aşağı birkaç kez hücreleri pipetle. </li><li> Hücre pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, süpernatantı. Hücreler, disperse olmasını sağlamak için 11 ul resüspansiyon tamponu ve pipet ve aşağı yukarı birkaç kez pelletini. Herhangi bir hava kabarcıkları üretmek için değil emin olun. Not: Hava kabarcıkları mikroporasyonu sırasında bir kıvılcıma yol ve fakir RBMB teslimat ve hücre ölümüne neden olur. </li><li> Seyreltilmiş RBMB (12 mM) 1 ul ekleyin ve pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice karıştırın. Yine herhangi bir hava kabarcıkları üretmek için dikkatli olun. </li><li> Aspire RBMB-hücre karışımı, 10 ul, mikro-gözeneklendirmeden pipet kullanılarak ve mikro-gözeneklendirmeden tüp içine pipet yerleştirin. Gözeneklendirilmesinin başlatmak için start düğmesine basın. Not: ucunda hiçbir görünür hava kabarcığı olmalıdır. </li><li> Microporator ekran tamamlanmasını gösterdiğinde, FBS&#39;li ancak antibiyotik olmadan 1 ml kültür ortamı ile, daha önce hazırlanan mikrosantrifüj tüpe 10 ul karışımı sınırdışı istasyonundan pipet kaldırmak. Tüp yan-yan birkaç kez sallanan hafifçe karıştırın. </li><li> 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri Spin ve hücrelere verilebilir değil bir RBMBs kaldırmak için FBS ile antibiyotikler olmadan 1 mi fenol kırmızı içermeyen kültür ortamı içinde hücreleri iki kere yıkayın. FBS ile ancak olmadan 400 ul fenol kırmızı içermeyen kültür ortamı ile yeniden süspanseantibiyotikler. </li><li> Plaka oyuk başına ya da istenen birbirine karıştığında, 200 ul 8 oyuklu odacıklı coverglass kaplanmış poli-D-lisin içine microporated hücreleri. </li><li> İsteğe bağlı: bu çekirdeği görüntüye arzu edilir ise, 0.01 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda, hücrelere Hoescht 33342 ekleyin. </li><li> Bir hücre kültür inkübatör içine odacıklı coverglass yerleştirin. Hücreler coverglass yüzeyinde yerleşmek için yeterli zaman var, böylece önce görüntüleme 1-2 saat inkübe hücreleri. Not: Görüntüleme 30 dakika sonra mikroporasyonu kısa sürede gerçekleştirilebilir. </li></ol> 4. Görüntü Alma <ol><li> Canlı hücre aşamada üst kuluçka sisteminde açın ve 37 ° C,% 5 CO 2 ve% 75 nem ulaşıncaya kadar dengelenmeye. </li><li> Mikroskop ve floresan ışık kaynağı açın ve Metamorph yazılımını açın. Not: mikroskop kontrolü ve görüntü alımı için diğer benzer yazılım paketleri de kullanılabilir. </li><li> Için İmmersol yağı sürünhedefi. </li><li> Canlı hücre aşamada üst inkübasyon sistemine microporated hücreleri ile odacıklı coverglass aktarın. Sıcaklığına kadar sahne üst sistemini inkübe ve CO 2 düzeyleri stabilize edilir. </li><li> Metamorph yazılım, Edinme sekmesini açın. , Alanı bulmak için Show Canlı düğmesini tıklatın beyaz ışık altında odağı ayarlamak ve Stop Live düğmesini tıklatın. </li><li> Edinme sekmesinde, tıklayın ve dere satın alma pop-up düğme açın ve istenen film satın parametrelerini ayarlamak. Cy5 / CF640R filtre kullanarak 150 kare Edinme ve sabit diskinize kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Dictenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+fluorescent+RNA+ensures+a+bright+future+for+visualizing+nucleic+acid+dynamics.">Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics.</a> Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).</li><li>Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+pulsing+of+a+developmental+gene.">Transcriptional pulsing of a developmental gene.</a> Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).</li><li>Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+nascent+RNA+dynamics+reveals+distinct+types+of+transcriptional+pulse+regulation.">Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).</li><li>Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+endogenous+RNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila.">Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).</li><li>Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+bicoid+mRNA+in+late+oocytes+is+maintained+by+continual+active+transport.">Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport.</a> Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).</li><li>Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+beta-actin+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+a+living+cell.">Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell.</a> Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).</li><li>Fusco, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mRNA+molecules+demonstrate+probabilistic+movement+in+living+mammalian+cells.">Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).</li><li>Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+endogenous+mitochondrial+RNA+in+single+living+cells.">Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells.</a> Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).</li><li>Daigle, N., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LambdaN-GFP:+an+RNA+reporter+system+for+live-cell+imaging.">LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging.</a> Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).</li><li>Bogaard, P. T., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacons+to+study+dispersal+of+mRNPs+from+the+gene+locus.">Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus.</a> Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).</li><li>Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+transport+in+the+nucleus.">Mechanism of mRNA transport in the nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).</li><li>Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+bimolecular+beacons+for+the+sensitive+detection+of+RNA+in+single+living+cells.">Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+shared-stem+and+conventional+molecular+beacons.">Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+kinetics+and+thermodynamics+of+molecular+beacons.">Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).</li><li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction.">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).</li><li>Ainger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+and+localization+of+exogenous+myelin+basic+protein+mRNA+microinjected+into+oligodendrocytes.">Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes.</a> J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li><li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells:+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs.">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).</li><li>Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+visualization+in+live+bacterial+cells+using+fluorescent+protein+complementation.">RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation.</a> Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Chen, A. K., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+RNA+in+living+cells+with+molecular+beacons:+current+perspectives+and+challenges.">Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FRET+molecular+beacons+for+mRNA+detection+in+living+cells.">Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).</li><li>Altman, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

Dr Mark Behlke ve Dr Ling Huang, metin içinde tarif edilen bileşiklerin bazıları Benzer İkinci oligonükleotidleri sağlamadığı IDT çalışmaktadır. IDT ancak, halka açık bir şirket, ve onlar bizzat IDT / sermaye hisse sahibi yok.

Bilinen bir geniş alan mikroskop kullanılarak canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri yeteneği, her bir RNA transkripti ve bağlanmayan flüoresan kaynaklanan düşük bir floresan arka plan ile ilişkili bir parlak ve ışığa karşı kararlı floresan sinyali gerektirmektedir. Bu yöntemde, parlak bir flüoresan sinyal, her bir RNA transkripti üzerine (96 kadar) birden fazla oligonükleotid bazlı flöresanlı sondalar örneğin, RBMBs hibritleme ile elde edilir. Bununla birli...

RNA transkript ifadesi ve düzenlenmesi hücre davranışlarını ve kaderini kontrol etmek için büyük ölçüde sorumlu olan bir karmaşık ve dinamik bir süreçtir. Dikte hücre fonksiyonunda RNA önemi bir süredir bilinmesine rağmen, bu iki en RNA analiz araçları gibi transkripsiyon ve çatlama gibi önemli düzenleyici bir etkinlik yakalamak için gerekli mekansal ve zamansal çözünürlüğü olmadığından, RNA arasında açık bir bağlantı çizmek zordur kaçakçılığı ve lokalize RNA işlenmesi. Bu, her RNA transkriptleri 1 gerçek zamanlı olarak canlı hücreler ile görselleştirilebilir olanak sağlayan çeşitli tekniklerin gelişmesiyle yol açmıştır. Belki de, bu tekniklerin en önemli 3&#39;-UTR 2,3 MS2 olarak bağlanma alanının tandem tekrarını içeren işlenmiş olan RNA&#39;yı hedef GFP MS2 füzyon proteinini kullanır. Yakın içine birden GFP molekülleri getirerek, bireysel RNA transkript gibi parlak floresan noktalar görünürfloresan mikroskobu ile. GFP-MS2 sistemi doğrudan görselleştirme ve transkripsiyon ölçümleri 4,5 patlama, benzersiz alt hücresel lokalizasyonu ve işleme 6-9 tespiti, ve RNA ulaşım 10 gerçek zamanlı görüntüleme, RNA davranış içine görülmemiş içgörü, sağlamıştır. Ancak, GFP-MS2 sisteminin muazzam potansiyele rağmen, bağlanmamış GFP-MS2 füzyon proteinleri bu tekniğin çok yönlülük ve dinamik aralığı sınırlar yüksek arka plan floresan sinyal oluşturabilir. Çeşitli yaklaşımlar subselüler bağlanmamış GFP-MS2 10 compartmentalization, protein fragmanı tamamlayamamakta 11, ve alternatif RNA bağlayıcı proteinler dahil, bu arka plan sinyali sınırlamak için geliştirilen ve 12 hedef oylandı. Ancak, bu yaklaşımların her RNA hedefinin ve GFP-MS2 füzyon proteinin nispi ifade toplam duyarlıdır. Bir a olarakGFP-MS2 sistemlere lternative moleküler işaretçileri de 3&#39;-UTR 13,14 tamamlayıcı bağlanma bölgesinin birbiri ardına dizilmiş tekrar mühendislikten RNA transkriptlerini algılamak için kullanılmıştır. Moleküler yol gösterici bir söndürücü ile bir ucunda ve bir flüoresan raportör diğer ucunda etiketlenmiştir saç tokası oluşturan oligonükleotid probları bulunmaktadır. RNA söndürücü flüoresan raportör hedef ve bağlı olmayan zaman düşük floresan hali ile sonuçlanarak, yakın kalır. Melezleme üzerine, floresan raportör ve söndürücü birbirinden ayrılır ve floresan restore edilmiştir. GFP-MS2 sistemi, floresan mikroskobu ile tespit edilebilir parlak florasan noktada bir tek RNA transkripti sonuçlar üzerine çok sayıda moleküler işaretçileri bağlanmasını benzer; Ancak, plan floresan nedeniyle bağlanmamış moleküler işaretlerinin söndürüldü yapılandırmasına, çok daha düşük olması beklenmektedir. Ne yazık ki, akıllı aktivasyon mekanizması rağmen bu m dahil edilirolecular işaret tasarımı, canlı hücre içine sokulduğunda bir saç tokası konformasyonunda kalmaz moleküler işaretleri melezleşmemiş giderek artan kanıtlar vardır. Sonuç olarak, belirgin bir sinyal-arka azaltan bir yanlış pozitif bir sinyal üretir. 15,16; Bu eksikliği gidermek için, biz son zamanlarda canlı hücreler, rasyometrik bimoleküler fenerler (Şekil 1A RBMBs) görüntüleme RNA için yeni bir sentetik sonda geliştirdi. RBMBs kısa saç tokası RNA (shRNA) ve moleküler işaretleri hem özelliklere sahip bir hibrid yapı oluşturan iki 2&#39;-O-metil oligonükleotid şerit oluşur. 3&#39;-UU çıkıntı ve uzun süreli etki, iki iplikçikli shRNA daha karakteristik ise döngü ve floresan aktivasyon mekanizması, moleküler işaret benzerdir. ShRNA özellikleri az gözlemlenebilir bozulması ile biz&gt; 24 saat için yükseltmektedir içi ömür bulduk nükleer ihracat, sürücü tasarlanan vedöngüsünün spesifik olmayan açılmasını önler. Sonuç RBMBs moleküler işaretleri önemli ölçüde daha yüksek bir sinyal-arka plan gösterirler gibi. RBMBs RNA esasına dayalı sondalar olarak aynı nükleer ihracat yetenekleri sahip olmayan DNA-temelli probları, çünkü DNA oligonükleotidleri kullanılarak hazırlanabilir edilemez Belirtilmelidir. Yapısal olarak, RBMB köprüsü tipik olarak RNA, melezleşme üzerine özgüllük ve seçicilik arasında bir denge oluşturmak için, 15 ve 21, uzun bazlar arasında olması tasarlanmıştır. İki kendi kendini tamamlayan etki oluşturan kısa bir kök, genellikle 4 bazlar arasında olacak şekilde tasarlanmıştır. Daha uzun bir sap seçilirse, RBMB döngü ve hedef RNA ile hibritleşmenin hızı önemli ölçüde 17,18 yavaşlatılır. Daha kısa bir sap dizisi seçildiğinde Tersine, erime sıcaklığı, yüksek bir zemin sinyali yol açan, 37 ° C &#39;de sap-halka yapısını sürdürmek için çoğu zaman çok düşüktür. RBMB spesifikliği de kırmızısap uzunluğu olarak kısaltılır uced. Ayrıca RBMB performansını etkileyebilir RBMB kök döngüsünün dizisi için, dikkatle 19 seçilmelidir. Özellikle, doğru döngü diziler, en az bir ikincil yapı olması gereken minimum sekonder yapısı ile RNA sekansları ile hibridize olan, protein bağlama siteleri önlemek ve bağlanma hedef dışı kaçının. RBMB ve RNA ikincil yapısının her ikisinin tahminlerin mfold 20 gibi yazılımları kullanılarak elde edilebilir. Tamamlayıcı hedef dışı siteler bir nükleotid Temel Yerel Atama Arama Aracı (ŞOK) kullanılarak tespit edebilirsiniz. Ancak, model tahminleri ve protein-bekliyorumdur bölgelerinin tanımlanmasında zorluk tutarsızlıklar, tüm RBMBs özgüllüğü sonuçta deneysel doğrulanması gerekir. Eğer arzu edilirse, hibridizasyon durumuna karşı duyarsız olan söndürülmemiş referans boya RBMB 15 eklenebilir. Referans boyanın eklenmesi için prsistemi teslimat için bir işaretleyici Ovide ve toplam hücresel floresans daha kesin olarak ölçülmesi gereken eğer oran ölçer görüntüleme için kullanılabilir. Referans boyalar ölçüm teslimat hücre-hücre değişiklikleri nedeniyle arka farklılıkların ayarlanmasını sağlar. Bununla birlikte, tek tek RNA görüntülerken, belirli referans boya gerekli değildir transkript. Özellikle, bazı referans boyalar çekirdeğinde biraz daha yüksek bir arka plan sinyali yol çekirdekten RBMBs ihracat engelleyebilir. Doğru tasarlandığında hedef RNA en az dört RBMB bağlama sahası (Şekil 1B) 16 ihtiva edecek şekilde ise, RBMBs, tek bir canlı hücrelerde tek tek görüntü RNA transkriptleri için kullanılabilir. RBMBs verimli hücre canlılığı 21 az veya hiç etkisi ile mikroporasyonu yoluyla hücre türleri geniş bir aralığı içine teslim edilebilir, ve gen ifadesinin niceliksel ölçümler olabilir30 dakika içinde edinilmiş. Ilişkisiz RBMBs flüoresan verimli söndürülür Dahası, metodoloji, RBMB konsantrasyon ve hedef RNA düzeyleri oldukça duyarsızdır. Burada RBMBs hazırlamak ve saflaştırmak için kullanılan metodolojinin detaylı açıklamasını, yanı sıra mikroporasyonu üzerinden canlı-hücre içine RBMBs teslimat için genel bir prosedür ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkript görüntüleme sağlamak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="977">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">AM9932</td>
			<td style="width:244px;">no DEPC-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DPBS</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No Ca2+ and Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:207px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P284-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">S381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;">22364111</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Chromatography Column</td>
			<td style="width:207px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:220px;">420400-0720</td>
			<td>0.7x20cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Superdex 75 Prep Grade</td>
			<td style="width:207px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:220px;">17-1044-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:207px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:220px;">BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe</td>
			<td style="width:207px;">BD</td>
			<td style="width:220px;">301035</td>
			<td>60mL, Luer-lok tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">UFC501096</td>
			<td>Mw 10,000 cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge 5418</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">P7280-5MG</td>
			<td>lyophilized powder, g-irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">8-well chambered coverglass</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">155409</td>
			<td>Working volume 0.2-0.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HT1080</td>
			<td style="width:207px;">ATCC</td>
			<td style="width:220px;">CCL-121</td>
			<td>Human Fibrosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">430639</td>
			<td>25cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">11965084</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM without Phenol Red</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">21063029</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F2442-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penecillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Trypsin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Neon transfection system</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon transfection system kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">02-671-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IX-81 Inverted fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Olympus</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">SOLA light engine</td>
			<td style="width:207px;">Lumencor</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metamorph</td>
			<td style="width:207px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td>Software controlling microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol oil 518F</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">12-624-66B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

Her iki gen ifadesinin zamansal ve mekansal düzenleme hücre fonksiyonu üzerinde önemli sonuçları olabilir büyüyen gerçekleşme tek bir canlı hücrelerin içindeki bireysel RNA transkriptleri görselleştirmek için çeşitli tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Son zamanlarda tarif edilmiştir ümit verici bir teknik 3&#39;-çevrilmemiş bölgesinde RBMB hedef dizinin en az dört tandem tekrarını ihtiva edecek şekilde, RNA transkriptlerini algılamak için bir oligonükleotid esaslı optik sonda, rasyometrik bimoleküler işaret fan (RBMB) kullanmaktadır. RBMBs tamamlayıcı RNA ile özel olarak melezleşme üzerine parlak bir flüoresan sinyal verecek şekilde tasarlanmış olan, ancak aksi takdirde söndürüldü kalır. Bu yaklaşımda, bir sentetik probunun kullanılması kırmızıya doğru kayar, ışığa karşı sağlar ve yüksek yayım organik boyalar görüntüleme için kullanılır. Bir geniş alan floresan mikroskop altında bakıldığı zaman farklı floresan noktalar işlenmiş olan RNA transkriptleri sonuçlar çok RBMBs bağlanması. Sonuç olarak, bireysel RNA transkript hareket hazır floresan görüntüleri bir zaman serisi alarak gerçek zamanlı olarak görülebilir. Burada mikroporasyonu hücrelere hazırlanması ve saflaştırılması RBMBs bölgesinin verilmesi tanımlanır ve canlı hücre tek RNA transkript görüntüleme.

Geniş alan floresan mikroskobu (Şekil 2) ile görüntülendi zaman kısa bir süre RBMBs varlığında HT1080 hücrelerinin gözeneklendirilmesinin takiben, işlenmiş olan bireysel RNA transkriptleri, 3&#39;-UTR birden RBMB bağlanma mevkilerini ihtiva edecek şekilde parlak noktalar floresan görülür. Gibi sadece dört RBMB bağlanma bölgeleri ile ayrı RNA transkriptleri canlı hücreler olarak görüntülenebilir birlikte, 3&#39;-UTR bağlanma yerleri daha RBMB, güçlü flüoresan sinyal. Nede...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons at JoVE.com

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Görüntüleme.  University of Pennsylvania.  Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar. 

Video: Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Biyoloji

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Genetik Kodlanmış Floresan Nitrik Oksit Uygulama (• NO) Tek Hücrelerde YOK • Sinyallerin Gerçek zamanlı Görüntüleme için sondalar, geNOps,

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Aurora kinazının Gerçek Zamanlı İzlenmesi Canlı Hücrelerde Konformasyonsal FRET Biyosensörleri Kullanılarak Aktivasyon

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...