Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Wissenschaft und Technologie Kommission von Shanghai (Grant Nr. 14411961800) und National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81300805).

1. Erkennung von endogenen Rb Sumoylierung in der Frühphase G1 <ol><li>Zell-Kultur und Zellzyklus Synchronisation.
	<ol><li>Pflegen HEK293 Zellen im Dulbecco-haltigem Wachstumsmedium &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 1 % Pen-Strep und 10 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C und 5 % CO 2 in einem Inkubator.</li>
		<li>Synchronisieren der HEK293 Zellen in der G0-Phase.
		<ol><li>Zählen die HEK293 Zellen mit einem Hemocytometer und Samen ~1.5 X 10 7 Zellen in ein 15 cm mit 25 ml Wachstumsmedium für 24 h vor der Behandlung Schüssel. Nach dem Erreichen eines Zusammenfluss von 70-80 %, Absaugen, Medium und waschen die Zellen zweimal mit 5 mL vorgewärmt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
			<li>Fügen Sie 25 mL DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin und die Zellen bei 37 ° C inkubieren Sie für 72 h waschen Sie die Zellen aus der Platte mit 3 mL eiskaltem PBS. Übertragen Sie die Zellen in eine neue 5-mL-Tube.</li>
			<li>Vorbehaltlich Zellzyklus Analyse einen kleinen Teil der Zellen durch Durchflusszytometrie (Schritt 1.2); die verbleibenden Mehrheit der Zellen durch Zentrifugation bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu sammeln, und dann speichern Sie sie in ein Ultra-niedriger Temperatur Gefrierschrank bis zur Analyse der Rb Sumoylierung.</li>
		</ol></li> <li>G1-Phase zu erhalten am Ende des Synchronisierungsprozesses G0-Zellen, die DMEM entfernen und hinzufügen wieder frische Wachstumsmedium, wodurch die HEK293 Zellen der Zellzyklus erneut eingeben zu müssen. Dann sammeln die Zellen in verschiedenen Phasen G1 (frühen G1: 30 min; G1: 2 h) für Zellzyklus Analyse und weitere SUMO assay.</li>
		<li>Synchronisieren der HEK293 Zellen in der S-Phase mit der Doppel-Thymidin-Block-Methode.
		<ol><li>Wachsen HEK293 Zellen eine Konfluenz von 50 % und waschen Zellen mit vorgewärmte PBS. Fügen Sie dann Wachstumsmedium ergänzt mit 2,5 mM Thymidin für 18 h (erster Block).</li>
			<li>Das Thymidin-haltigen Medium zu entfernen und dann die Zellen zweimal mit vorgewärmte PBS waschen. Fügen Sie frisches Wachstumsmedium für 14 h, die Zellen freizugeben.</li>
			<li>Das Medium mit einer Pipette zu verwerfen und fügen Wachstumsmedium ergänzt mit 2,5 mM Thymidin für eine weitere 18 h (2. Block) vor der Durchführung einer Analyse des Zellzyklus und Rb Sumoylierung.</li>
		</ol></li> <li>Für G2/M-Synchronisation, Platte ~1.5 × 10 7 HEK293 Zellen auf einen 15 cm Teller mit 25 mL Wachstumsmedium für 24 h. Fügen Sie Nocodazole auf das Medium, bis eine Endkonzentration von 400 ng/mL erreicht ist. Zu guter Letzt die Zellen für 16 h vor der Durchführung der Analysis des Zellzyklus und Rb Sumoylierung inkubieren.</li>
	</ol></li> <li>Zellzyklus Analyse von Durchflusszytometrie.
	<ol><li>Wieder aussetzen der synchronisierten HEK293 mit PBS-Puffer und dann fix die Zellsuspension mit eiskalten 70 % Ethanol für 2 h bei 4 ° c beachten Sie, dass zu minimieren, clustering-Zelle, die Zellsuspension tropfenweise hinzufügen das eiskalte 100 % Ethanol, eine Endkonzentration von zu erhalten 70 % Ethanol während sanft aufschütteln.</li>
		<li>Die Zellen für 5 min bei 500 X g Zentrifugieren dann sorgfältig überstand verwerfen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Wiederholen Sie den Schritt Zentrifuge.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL PBS mit 50 µg/mL-Nukleinsäure Fleck Propidium Jodid, 0,1 % Triton X-100 und 1 µg/mL RNase A zu den Zellen und gut mischen. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei 37 ° c</li>
		<li>Speichern die Proben bei 4 ° C bis zur Analyse von Durchflusszytometrie.</li>
	</ol></li> <li>Immunopräzipitation des endogenen Rb-Proteins.
	<ol><li>Bereiten die HEK293 Zelle Lysates.
		<ol><li>Lyse der synchronisierten HEK293 Zellen sanft wieder aussetzen sie in 1 mL eiskaltes Radio-Immunopräzipitation (RIPA) Lyse Testpuffer (Tabelle 1) frisch mit 20 mM N-Ethylmaleimide, ein Isopeptidase-Inhibitor hinzugefügt, die konnte SUMO Proteasen zu blockieren und zu stabilisieren SUMO Konjugate.</li>
			<li>Weitere Homogenisierung der Zellen auf Eis durch Dounce Homogenisierung, Beschallung oder Durchreise durch 10 Mal eine Nadel 21 G auf einer 2 mL Spritze. Inkubieren Sie dann die Zellen auf Eis für 5 min. 
			Hinweis: Die anionische Detergenzien Dodecyl Natriumsulfat (SDS) im RIPA Puffer ist entscheidend für die spätere Bestimmung der Rb-SUMO, da es das unspezifische SUMO-Signal beseitigen könnte, das aus der nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen der Rb-Protein und anderen abgeleitet ist nicht-Rb SUMO-Art.</li>
		</ol></li> <li>Zentrifugieren der Zelle Lysates bei 18.000 x g für 30 min bei 4 ° c die Überstände an neuen 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren übertragen. 
		Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proteine können bei-80 ° C für mindestens 6 Monate gelagert werden.</li>
		<li>Um das Eingabesteuerelement jeder Probe der späteren Western-Blot vorzubereiten, speichern Sie einen kleinen Teil der oben beschriebenen Überstand auf eine neue Röhre und speichern bei-80 ° c</li>
		<li>1 µg von unspezifischen Maus Immunglobulin G (IgG) der gleichen Spezies und Isotype Agrega zu den oben genannten Überstände der monoklonalen Antikörper Rb und 20 µL 50 % Protein A/G-Sepharose Gülle. Dann 1 h bei 4 ° C mit sanften Drehung inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C. sorgfältig die Überstände ohne zu stören die Perlen zu sammeln, und übertragen Sie sie auf neue 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren. Jedes der Beispiele fügen Sie 5 µL Rb Primärantikörper und 40 µL 50 % Protein A/G-Sepharose Gülle hinzu. Dann über Nacht bei 4 ° C mit sanften Drehung inkubieren.</li>
		<li>Sammeln die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch pipettieren. Beachten Sie, dass zur Vermeidung von Verlust der Wulst, aspirieren Sie trockenen Perlen nicht.</li>
		<li>Waschen die Perlen viermal mit 1 mL des Puffers RIPA. Jedes Mal, mischen die Rohre gut durch Rotation bei 4 ° C für 15 min. sammeln die Perlen von langsamem Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C und verwerfen Sie die Überstände.</li>
		<li>Nach der Entfernung der letzten Wäsche Überstände, erneut unterbrechen die Perlen in 30 µL 1 x Natrium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) laden Puffer (Tabelle 1) und gut mischen.
		<ol><li>Inkubieren blockieren die Rohre bei 100 ° C in die Hitze für 10 min Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 1 min um die Perlen zu Pellets. Sorgfältig die Überstände ohne zu stören die Perlen zu sammeln, und übertragen Sie sie auf 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.</li>
		</ol></li> <li>Analysieren die Proben von 4-20 % Steigung SDS-PAGE gel und Western blot oder bei-20 ° C für die spätere Verwendung zu speichern.</li>
	</ol></li></ol> 2. Analyse der 6XHis-tagged exogene Rb Sumoylierung in menschlichen Zellen <ol><li>Zell-Kultur und Transfektion.
	<ol><li>Samen ~ 6 × 10 6 HEK293 Zellen in ein 10 cm Schale und inkubieren Sie für 24 h im Wachstumsmedium unter normalen Zelle Kulturbedingungen, 75-85 % konfluierende Zellen zu erwerben. Vor Transfektion, entfernen das Wachstumsmedium und 6 mL vorgewärmte reduzierte Serum-Medium (siehe Tabelle der Materialien) und legen Sie dann das Geschirr wieder in den Inkubator.</li>
		<li>Für Rb konstitutive Sumoylierung Assay, bzw. 15 µg 6XHis-tagged Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT und Ubc9-C93S-Plasmide in 500 µL reduzierte Serum Medium in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren, hinzufügen.
		<ol><li>Zu analysieren, die SUMO-Konjugation der Wildtyp Rb und seine Sumoylierung-defekt-Mutante, 10 µg entweder 6XHis-tagged Rb-WT oder Rb-K720R Plasmid zusammen mit GFP-SUMO1 mischen (10 µg) in 500 µL reduziert Serum Medium in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhrchen 13.</li>
		</ol></li> <li>Unterdessen in einem separaten Rohr mix 50 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) in 500 µL Serum Medium reduziert und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
		<li>Voll kombinieren die zwei separate Röhren, die oben beschriebenen und Inkubation bei Raumtemperatur 15 Minuten hinzufügen die Transfektion Reagenz/Plasmid-komplexe, die Zellen und weiterhin Kultur für 8 h bei 5 % CO 2 und 37 ° c</li>
		<li>Ersetzen Sie reduzierte Serum Medium mit Wachstumsmedium und inkubieren Sie die Zellen unter normalen Kulturbedingungen für 48 h nach Transfektion.</li>
	</ol></li> <li>Nickel Pulldown-Affinität des Rb 6XHis-tagged Proteins.
	<ol><li>Die transfizierten HEK293 Zellen lysiert und die gesamten Proteine als beschriebenen Abschnitt 1.3.1 extrahieren.</li>
		<li>Zentrifuge der Zelle Lysates bei 18.000 x g für 30 min bei 4 ° C. sorgfältig sammeln die Überstände und übertragen Sie sie auf saubere Rohre. 
		Hinweis: Das Protein eingefroren werden kann an dieser Stelle für mehr als 6 Monate bei-80 ° c</li>
		<li>Um das Eingabesteuerelement jeder Probe der späteren Western-Blot vorzubereiten, speichern Sie einen kleinen Teil der Überstände oben beschrieben, eine neue Röhre und speichern bei-80 ° c</li>
		<li>Waschen 25 µL 50 % nickel Nitrilotriacetic Säure (Ni-NTA) Agarose Korne mit RIPA Puffer zweimal in einem 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen für jede Probe. Sammeln Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° c</li>
		<li>Add 1 M Imidazol zu jeder Probe, eine Endkonzentration von 10 mM zu erhalten. Fügen Sie dann jede Probe in das Röhrchen mit der vorbereiteten Ni-NTA Agarose Korne.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Perlen und die Lysates für 2 h bei 4 ° C mit sanften Drehung. Drehen Sie die Perlen bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C, und entfernen Sie vorsichtig die Überstände durch pipettieren. Aspirieren Sie um Perlen zu vermeiden, nicht die Perlen trocken.</li>
		<li>Waschen die Perlen mit 1 mL Waschpuffer mit 20 mM Imidazol (Tabelle 1). Jedes Mal, mischen die Rohre gut durch Rotation bei 4 ° C für 15 min. sammeln die Perlen von Spinnen bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C und verwerfen die Überstände.</li>
		<li>Nach dem letzten Waschen jede Probe 30 µL Elution buffer mit 250 mM Imidazol (Tabelle 1) hinzu und wechseln Sie um zu mischen. Dann 20 min bei 4 ° C, die Proteine eluieren inkubieren.</li>
		<li>Mischen jede Probe mit 6 × SDS-PAGE laden Puffer (Tabelle 1). Dann, brüten die Rohre bei 100 ° C in einem Hitze-Block für 10 min.</li>
		<li>Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min um die Perlen zu Pellets. Sorgfältig die Überstände ohne zu stören die Perlen zu sammeln, und die Proben auf 1,5 ml Mikro-Zentrifuge Rohre übertragen. Die Proben von Western-Blot analysiert oder bei-20 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden können.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western-Blot <ol><li>laden die Immunopräzipitation oder pull-down Proben aus den vorherigen Schritten auf 4-20 % Steigung SDS-PAGE Gelen. Durchführung von Elektrophorese bei 120 V für 90 min um die Proteine zu trennen.</li>
	<li>Übertragen die Proteine aus dem Gel auf eine Membran Polyvinylidene Difluoride (PVDF) von Elektroblotting bei 300 mA für 90 min bei 4 ° C mit der Tank-Transfer-Methode. Blockieren die PVDF-Membran in mit 5 % Magermilch (Tabelle 1) für 1 h bei Raumtemperatur-Blockpuffer.</li>
	<li>Inkubation der Membran mit Primärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper enthält 3 % Rinderserumalbumin (BSA) (Tabelle 1) über Nacht bei 4 ° C. Verwenden Sie für primären Antikörper eine arbeiten-Konzentration von 0,5 µg/mL (Anti-SUMO1 Antikörper) oder einer Verdünnung von 1: 2000 (Anti-Rb und Anti-Tubulin Antikörper) oder 1:5,000 (Anti-GFP und Anti-His Antikörper).</li>
	<li>Waschen die Membran 3 X für 10 min jeweils mit 1 x Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween (TBST) Puffer (Tabelle 1). Inkubieren Sie die Membran mit Arten bestimmten Meerrettich Peroxidase HRP-konjugierten Sekundärantikörper verdünnten 1:5,000 in Blockpuffer, enthält 5 % Magermilch (Tabelle 1). Waschen Sie die Membran 3 X für 10 min jeweils mit 1 Puffer X TBST.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Lösung arbeiten. Die Membran mit Plastikfolie abdecken und setzen Sie es je nach Signalstärke Röntgenfilm.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases.">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G1+cell-cycle+control+and+cancer.">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control.">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li><li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RB+and+cell+cycle+progression.">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li><li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene.">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li><li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rb/chromatin+connection+and+epigenetic+control:+opinion.">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li><li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria.">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li><li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+within+the+pRb+pathway:+is+there+a+code+of+conduct.">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li><li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function.">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li><li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+(pRb)+by+cyclin+D:Cdk4/6+complexes+results+in+active+pRb.">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li><li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor.">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+SUMO-2/3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways.">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li><li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase.">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li><li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+in+sumoylation:+a+decade+on.">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li><li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation:+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease.">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li><li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer.">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li><li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation.">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li><li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+(RB)+and+Lamin+A/C+interaction+and+stabilization.">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li><li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+(UFDS):+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation.">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2/3.">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li><li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues.">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll zum erkennen und analysieren der endogenen Sumoylierung Rb in menschlichen Zellen. Da diese Methode speziell auf das endogene Rb-Protein ohne jede Abwechslung der globalen SUMO-bezogenen Signal ausgerichtet ist, ist es ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von Rb-SUMO Modifikation unter völlig natürlichen physiologischen Umständen.
Um dieses Ziel zu erreichen, ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass: 1) Obwohl SUMO vier Isoformen (SUM...

Die genaue Steuerung der Zellzyklus Progression in eukaryontischen Zellen beruht auf einer engen regulatorischen Netzwerk sorgt dafür, dass bestimmte Ereignisse in einer geordneten Art und Weise1,2stattfinden. Einer der wichtigsten Akteure in diesem Netzwerk ist das Retinoblastom (Rb)-Protein, das erste geklonte Tumorsuppressor1,3. Das Rb-Protein wird angenommen, dass ein negativer Regulator der Zellzyklus Progression, vor allem für die G0/G1 S Phasenübergang und Tumor Wachstum4,5. Ausfall der Rb führt entweder direkt auf die am häufigsten verwendeten intraokularen Bösartigkeit bei Kindern, Retinoblastom, oder trägt zur Entwicklung von vielen anderen Arten von Krebs5. Darüber hinaus engagiert sich die Rb in viele zelluläre Signalwege einschließlich der Zelldifferenzierung, Chromatin umgestalten und Mitochondrien-vermittelten Apoptose3,6,7.
Post-translationalen Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des RB Funktion8,9. Phosphorylierung ist eine solche Änderung, und es führt in der Regel zu Rb Inaktivierung. In ruhenden G0-Zellen ist Rb aktiv mit einem niedrigen Phosphorylierung. Fortschritt durch G0/G1-Phase Zellen, ist Rb sequenziell hyper phosphoryliert durch eine Reihe von cyclin-abhängige Proteinkinasen (CDKs) und Cyclin, z. B. cyclin E/CDK2 und cyclin D/CDK4/6, die Rb zu inaktivieren und seine Fähigkeit, Zellzyklus unterdrücken zu beseitigen im Zusammenhang mit gen-Ausdruck4,10. RB konnte auch durch kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO)11,12,13geändert werden.
SUMO ist ein Ubiquitin-wie Protein, das eine Vielzahl von Zielproteinen kovalent verbunden ist. Es ist wichtig für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich der Regulierung des Zellzyklus, Transkription, Protein zellulären Lokalisation und Abbau, Transport und DNA-Reparatur14,15,16, 17 , 18. der SUMO Konjugation Weg besteht aus dimeres SUMO E1 aktivierende Enzym SAE1/UBA2, der einzigen E2 conjugating Enzym Ubc9 und mehrere E3 Ligases SUMO-spezifische Proteasen. Im Allgemeinen müssen im Entstehen begriffenen SUMO Proteine proteolytisch verarbeitet werden, um die ältere Form zu erzeugen. Reife SUMO ist durch E1-Heterodimer aktiviert und dann auf das Enzym E2 Ubc9 übertragen. Schließlich die C-terminale Glycin Sumo ist kovalent an die Ziel-Lysin eines Substrats konjugiert, und dieser Prozess wird in der Regel durch E3 Ligases erleichtert. Das SUMO Protein kann durch spezifische Proteasen aus dem modifizierten Substrat entfernt werden. Eine frühere Studie von den Autoren dieses Papiers ergab, dass Sumoylierung Rb die Bindung an CDK2 erhöht, führt zu hyper-Phosphorylierung bei der frühen G1-Phase, ein Prozess, der für Zellzyklus Fortschreiten13notwendig ist. Wir zeigten auch, dass der Verlust der Rb Sumoylierung eine verminderte Zellvermehrung verursacht. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass die Sumoylierung Rb proteasomalen Umsatz, das Rb-Protein schützt somit die Erhöhung des Rb-Protein in Zellen19. Daher spielt Sumoylierung eine wichtige Rolle bei Rb-Funktion in verschiedenen zellulären Prozessen. Weiter zu studieren der funktionalen Konsequenz und physiologische Relevanz von Rb Sumoylierung, ist es wichtig, eine wirksame Methode um die SUMO-Status der Rb in menschlichen Zellen oder Geweben Patienten analysieren zu entwickeln.
Sumoylierung ist eine reversible, hoch dynamischen Prozess. So ist es in der Regel schwer zu erkennen, die SUMO-modifizierte Proteine vollständig endogenen Bedingungen. Dieses Papier stellt eine Methode, um endogene Rb Sumoylierung zu erkennen. Außerdem zeigt es, wie exogene Rb Sumoylierung Wildtyp Rb und seine SUMO-defizienten Mutation11erkannt. Jacobs Et Al. beschrieben vor allem eine Methode, um die SUMO-Änderung eines bestimmten Substrats speziell von Ubc9 unter der Regie von Fusion Sumoylierung (UFD)20erhöhen. Basierend auf dieser Methode, beschreibt dieses Protokoll die erzwungene Sumoylierung Rb und seiner funktionellen Konsequenzen zu analysieren. Da die Hunderte von SUMO Substrate bisher beschrieben worden sind und weitere vermeintliche SUMO Substrate aus vielen Proteomic basierende Assays identifiziert wurden, kann dieses Protokoll angewendet werden, um die SUMO-Modifikation dieser Proteine in menschlichen Zellen zu analysieren.

<table style="border-collapse:collapse;width:695pt" width="927">
	<colgroup>
		<col style="width:275pt" width="366" />
		<col style="width:206pt" width="275" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11995065</td>
			<td class="xl68" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Opti-MEM&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">31985070</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140079</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010023</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25200056</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Thymidine</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">T9250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nocodazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M1404</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">propidium iodide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">P3566</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Triton X-100&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">694</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">RNase A&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">EN0531</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">N-Ethylmaleimide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">E3876&#160;</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M107</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M158</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">protease inhibitor</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Roche</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">5892970001</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2025</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Rb antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Cell Signaling Technology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">#9309</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Protein A/G-Sepharose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2003</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Lipofectamine-2000&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">11668019</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Qiagen</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">30230</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Imidazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">I0250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">BIO-RAD</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">4561096</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Millipore</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">IPVH00010</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tween-20</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M147</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tubulin antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M30109</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">SUMO1 antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">33-2044</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">GFP antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M20004</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">715-035-150</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">32106</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells

Die post-translationalen Modifikationen von Proteinen sind entscheidend für die richtige Regulierung der intrazellulären Signaltransduktion. Unter diesen Änderungen ist kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) ein Ubiquitin-wie Protein, das die Lysin-Rückstände verschiedener Zielproteine zu regulieren zelluläre Prozesse wie Gentranskription, DNA-Reparatur, Protein kovalent verbunden ist Interaktion und Abbau, subzelluläre Transport und Signaltransduktion. Die gängigste Methode zur Erkennung von Protein Sumoylierung basiert auf den Ausdruck und die Reinigung von rekombinanten tagged Proteinen in Bakterien, so dass für eine in-vitro- biochemische Reaktion, die ist einfach und eignet sich für den Umgang mit mechanistischen Fragen. Aufgrund der Komplexität des Prozesses der Sumoylierung in Vivoist es jedoch schwieriger zu erkennen und zu analysieren, Protein Sumoylierung in Zellen, vor allem unter endogenen Bedingungen. Eine aktuelle Studie von den Autoren dieses Artikels ergeben, dass endogene Retinoblastom (Rb) Protein, ein Tumorsuppressor, die entscheidend für die negative Regulierung des Zellzyklus Progression, speziell sumoyliert in der frühen G1-Phase. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Analyse von Rb Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen. Dieses Protokoll eignet sich für die phänotypische und funktionelle Untersuchung der SUMO-Änderung der Rb, sowie viele andere SUMO-gezielte Proteine in menschlichen Zellen.

Um endogene Rb Sumoylierung während Zellzyklus Progression zu erkennen, synchronisiert diese Studie zunächst HEK293 Zellen in fünf verschiedenen Phasen des Zellzyklus (G0, frühe G1, G1, S und G2/M), wie im Abschnitt "Protokoll" dieses Artikels beschrieben. Die Qualität der Synchronisation wurde bestätigt, indem die Nukleinsäure-Fleck mit Propidium Jodid gefolgt von Flow-Zytometrie-Analyse (Abbildung 1). Als nächstes wurden die Zellen gesammelt und dur...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells at JoVE.com

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) Familie Proteine sind an Lysin-Reste von Zielproteine, verschiedene zelluläre Prozesse regulieren konjugiert. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von Retinoblastom (Rb) Protein Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen.

In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

7.2K Aufrufe.  Eye and ENT Hospital of Fudan University. Kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) Familie Proteine sind an Lysin-Reste von Zielproteine, verschiedene zelluläre Prozesse regulieren konjugiert. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von Retinoblastom (Rb) Protein Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen.

Serie: In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Forschung

Biologie

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...