Bu çalışmada bilim ve teknoloji Komisyonu Shanghai (Grant No. 14411961800) ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (Grant No. 81300805) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

1. algılama, endojen Rb SUMOylation erken G1 faz <ol><li>hücre kültür ve hücre döngüsü eşitleme.
	<ol><li>Büyüme orta Dulbecco içeren hücrelerde korumak HEK293 &#39; s % 1 kalem-Strep ve % 10 fetal sığır serum (FBS) 37 ° C ve % 5 CO 2 bir kuluçka adlı ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).</li>
		<li>HEK293 hücreleri G0 aşamasında eşitleyin.
		<ol><li>Sayısı 15 cm hemasitometre ve tohum ~1.5 x 10 7 hücreleri kullanarak HEK293 hücreleri ile tedavi öncesi 24 h için 25 ml büyüme orta çanağı. Orta ve yıkama % 70 - % 80, aspiratı izdiham ulaştıktan sonra hücreleri iki kez 5 mL ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) prewarmed.</li>
			<li>Ekle 25 mL % 1'i içeren DMEM penisilin-streptomisin ve 72 h. yıkamak için hücreleri 3 mL buz gibi PBS kullanarak plaka dışına 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Hücreleri yeni bir 5 mL tüp içine transfer.</li>
			<li>Akış Sitometresi (Adım 1.2) tarafından hücre döngüsü analizi için hücreleri küçük bir bölümünü konu; 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de Santrifüjü tarafından kalan çoğunluk hücre toplama ve sonra onları analiz kadar bir ultra-düşük sıcaklık dondurucuda saklayın Rb SUMOylation,.</li>
		</ol></li> <li>G1-faz elde etmek için hücreleri G0 eşitleme işleminin sonunda DMEM kaldırın ve geri taze büyüme orta, böylece HEK293 hücreleri hücre döngüsü yeniden girmek izin ekleyin. Daha sonra farklı G1 aşamaları, hücreleri toplamak (erken G1: 30 dk; G1: 2 h) analizi ve daha fazla SUMO hücre döngüsü için tahlil.</li>
		<li>HEK293 hücre çift-timidin blok yöntemini kullanarak S aşamasında eşitleyin.
		<ol><li>Bir confluency % 50 ve yıkama hücrelere büyümek HEK293 hücre prewarmed PBS ile. Daha sonra büyüme orta ile 2.5 mM timidin 18 h (ilk blok) için takıma ekleyin.</li>
			<li>Timidin içeren orta kaldırın ve sonra hücreleri iki kez prewarmed PBS ile yıkayın. Taze büyüme orta hücreleri serbest bırakmak 14 h için eklemek.</li>
			<li>Bir pipet ile orta atmak ve hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce büyüme orta 2.5 mM timidin için başka bir 18 h (ikinci blok) ile takıma ekleyin.</li>
		</ol></li> <li>G2/M için senkronizasyon, plaka ~1.5 × 10 7 HEK293 hücreleri ile 25 mL büyüme orta 24 h için 15 cm çanak için. 400 ng/mL nihai bir konsantrasyon elde edilir kadar nocodazole Orta olarak ekleyin. Son olarak, hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce 16 h için hücreleri kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Hücre döngüsü analizi Akış Sitometresi ile.
	<ol><li>Eşitlenmiş HEK293 PBS içinde yeniden askıya alma ve buz gibi % 70 etanol için 2 h 4'te kullanarak hücre süspansiyon düzeltin Bu hücre kümeleme en aza indirmek için hücre süspansiyon dropwise son bir konsantrasyon elde etmek için buz gibi % 100 etanol ekleyin unutmayın ° C. Yavaşça vortexing ise % 70 etanol.</li>
		<li>Hücreleri, 500 x g, 5 min için santrifüj kapasitesi sonra dikkatle süpernatant atmak ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Santrifüj adımı yineleyin.</li>
		<li>Ekle 500 µL PBS içeren 50 µg/mL nükleik asit propidium iyodür, %0,1 Triton X-100 ve 1 µg/mL RNase A hücrelere leke ve iyice karıştırın. 15 dk 37 için hücreleri kuluçkaya ° C.</li>
		<li>4 ° C'de örnekleri analiz kadar Akış Sitometresi tarafından depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitation endojen Rb protein.
	<ol><li>Hazırla HEK293 hücre lysates.
		<ol><li>Lyse yavaşça onları buz gibi radyo-immunoprecipitation tahlil (RIPA) lizis arabellek (Tablo 1) 1 ml taze içeren yeniden askıya eşitlenmiş HEK293 hücreleri 20 mM N-Ethylmaleimide, olabilir bir isopeptidase inhibitörü eklendi SUMO proteaz engellemek ve SUMO conjugates stabilize.</li>
			<li>Daha fazla buz Dounce Homojenizasyon, sonication veya sadece 10 kat 2 mL şırınga üzerinde bağlı 21 G iğne üzerinden geçerek hücrelerdeyse lunaparkçı. Sonra buz 5 dakika süreyle hücrelerdeyse kuluçkaya 
			Not: Rb protein ve diğer arasında kovalent olmayan etkileşim türetilir belirsiz SUMO sinyal ortadan kaldırmak gibi RIPA arabellekte Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) Rb-SUMO, daha sonra belirlenmesi için çok önemlidir Non-Rb türler-SUMO.</li>
		</ol></li> <li>Hücre lysates 18.000 x g 30 dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C. Transfer supernatants yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için. 
		Not: Protokol burada duraklatılmış. Proteinler-80 ° C'de en az 6 ay süreyle saklanabilir.</li>
		<li>Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yukarıda açıklanan süpernatant küçük bir bölümünü kurtarmak-e doğru yeni tüp ve-80 mağazasında ° C.</li>
		<li>Yukarıdaki supernatants için 1 µg G non-spesifik fare immünglobulin (IgG) aynı tür ve izotip monoklonal Rb antikor ve 20 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. O zaman, nazik rotasyon ile 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi 3000 x g 3 dk de örnekleri 4'te ° C. dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için aktarabilirsiniz. Her örnekleri, 5 µL Rb birincil antikor ve 40 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. Sonra bir gecede nazik rotasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Boncuk Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından toplamak ve dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın. Boncuk kaybını önlemek için dikkat edin, boncuk kuru Aspire değil.</li>
		<li>Boncuk dört kez RIPA arabelleği 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de onlara 4 ° C'de 15 dakika süreyle toplamak döndürme tarafından düşük hızlı Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından boncuk mix ve supernatants atın.</li>
		<li>Supernatants son yıkama servisinden kaldırdıktan sonra Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) yükleme arabellek (Tablo 1) x 30 µL 1 boncuk yeniden askıya alma ve iyice karıştırın.
		10 dk santrifüj kapasitesi için örnekleri boncuk cips için 1 dakika için 12.000 x g de <ol><li>Incubate bir sıcakta 100 ° C'de tüpler engelleyin. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için transfer.</li>
		</ol></li> <li>Analiz örnekleri tarafından % 4 - % 20 degrade SDS-sayfası jel ve Western blot veya bunları-20 ° c daha sonra kullanmak üzere saklamak.</li>
	</ol></li></ol> 2. 6XHis öğesini eksojen Rb SUMOylation insan hücrelerinde analizi <ol><li>hücre kültür ve transfection.
	<ol><li>Tohum ~ 6 × 10 6 HEK293 hücreleri 10 cm çanak ve % 75-%85 Konfluent hücreleri elde etmek için normal hücre kültür koşullarda büyüme ortamda 24 h için kuluçkaya. Transfection önce büyüme orta kaldırmak ve prewarmed düşük serum orta 6 mL ekleyin (Tablo malzemeleri görmek) ve bulaşık kuluçka makinesi geri yerleştirin.</li>
		<li>İçin Rb bünye SUMOylation tahlil, eklemek 6XHis öğesini Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT ve Ubc9-C93S Plazmidler her 15 µg içinde 500 µL düşük serum 1,5 mL mikro-santrifüj tüpler, ortamda anılan sıraya göre.
		SUMO-konjugasyon vahşi türü Rb ve onun SUMOylation-arızalı mutant analiz etmek, ya da 6XHis öğesini Rb-WT veya Rb-K720R plazmid GFP-SUMO1 birlikte 10 µg mix <ol><li>(10 µg) 500 µL serum ortamda 1,5 mL mikro-santrifüj azaltılmış 13 tüpler.</li>
		</ol></li> <li>Bu arada, ayrı bir tüp içinde 50 µL transfection reaktif mix (Tablo malzemeleri görmek) 500 µL serum orta azaltılmış ve 5 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
		<li>Tam olarak yukarıda açıklanan iki ayrı tüp birleştirmek ve 15 dk. Ekle transfection oda sıcaklığında reaktif/plazmid kompleksleri hücrelere kuluçkaya ve kültür 8 için devam 37 ° c de % 5 CO 2 s</li>
		<li>İle büyüme orta düşük serum orta yerine ve hücreler normal kültür koşullar için 48 saat altında transfection sonra kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Nikel 6XHis öğesini Rb protein benzeşme yıkmak.
	<ol><li>Transfected HEK293 hücreleri parçalayıcı ve toplam protein açıklanan bölüm 1.3.1 ayıklamak.</li>
		<li>Santrifüj hücre lysates 18.000 x g de 30 dk 4 ° C. dikkatle supernatants toplamak ve temiz tüpler transfer. 
		Not: Protein bu noktada-80, 6 aydan fazla donmuş olabilir ° C.</li>
		<li>Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yeni tüp ve-80 mağazasında için yukarıda açıklanan supernatants küçük bir bölümünü kaydedin ° C.</li>
		<li>Yıkama 25 µL % 50 nitrilotriacetic asit (Ni-NTA) özel boncuk RIPA arabelleği iki kez her örnek için bir 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü ile nikel. 4 3 dk 3000 x g de Santrifüjü tarafından boncuk toplamak ° C.</li>
		<li>Ekleyin 1 M imidazole 10 mM son bir konsantrasyon elde etmek için her örnek için. Sonra her örnek hazır Ni-NTA özel boncuk içeren tüp ekleyin.</li>
		<li>Boncuk ve nazik rotasyon ile 4 ° C'de 2 h için lysates kuluçkaya. Boncuk 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de spin ve pipetting tarafından supernatants dikkatli bir şekilde çıkarın. Boncuk kayıplarını önlemek için boncuk kuru Aspire edin değil.</li>
		<li>Boncuk yıkama arabelleği 20 mM imidazole (Tablo 1) içeren 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de rotasyon 15 dk. toplamak için 4 ° C'de tarafından boncuk iplik 4 ° C'de 3 dk 3000 x g de tarafından karıştırın ve supernatants atın.</li>
		<li>Son yıkama sonra elüsyon 30 µL arabellek içeren 250 mM imidazole (Tablo 1) her örnek için ekleyin ve karıştırarak hafifçe vur. O zaman, proteinler elute 4 ° c 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Her örnek 6 × SDS-sayfa yükleme arabellek (Tablo 1) ile karıştırın. Sonra bir ısı blok için 10 dk. içinde 100 ° C'de tüpler kuluçkaya</li>
		<li>Santrifüj 12.000 x g boncuk cips için 1 dakika için. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve örnekleri 1,5 ml mikro-santrifüj tüpleri için transfer. Western blot tarafından analiz veya daha sonra kullanmak için-20 ° C'de depolanan örnekleri.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western Blot <ol><li>immunoprecipitation yük veya % 4-20 degrade SDS-sayfa jelleri üzerine önceki adımlardan gelen elde edilen örnekler aşağı çekin. Elektroforez 120 V proteinler ayırmak 90 dk için kuralları.</li>
	<li>Transfer proteinler jel bir polivinilidin difluoride (PVDF) membran tarafından electroblotting vasıl 300 mA tank aktarım yöntemini kullanarak 4 ° C'de 90 dk için. Oda sıcaklığında 1 h için %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabellekte PVDF membran engellemek.</li>
	<li>Incubate membran ile birincil antikor antikor seyreltme arabelleği % 3 sığır serum albumin (BSA) (Tablo 1) içeren bir 4 ° C'de gecede Birincil antikorlar için bir çalışma konsantrasyonu olarak 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antikor) veya 1:2000 (anti-Rb ve anti-tübülin antikorları) veya 1:5,000 (anti-GFP ve anti-O'nun antikor) bir seyreltme kullanın.</li>
	<li>Yıkama membran 3 x 10 dk 1 x tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik ile ara (TBST) tampon (Tablo 1) kullanarak her zaman için. Membran türler belirli Horseradish peroksidaz HRP Birleşik ikincil antikorlar seyreltilmiş 1:5,000 %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabelleği ile kuluçkaya. Membran 3 yıkama x 10 dk 1 x TBST tampon kullanarak her zaman için.</li>
	<li>Membran çözüm çalışma gelişmiş Kemiluminesan ile (ECL) kuluçkaya. Plastik wrap ile membran kapak ve sinyal gücüne bağlı olarak X-ray film maruz kalmaktadır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases.">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G1+cell-cycle+control+and+cancer.">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control.">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li><li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RB+and+cell+cycle+progression.">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li><li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene.">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li><li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rb/chromatin+connection+and+epigenetic+control:+opinion.">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li><li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria.">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li><li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+within+the+pRb+pathway:+is+there+a+code+of+conduct.">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li><li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function.">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li><li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+(pRb)+by+cyclin+D:Cdk4/6+complexes+results+in+active+pRb.">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li><li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor.">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+SUMO-2/3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways.">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li><li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase.">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li><li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+in+sumoylation:+a+decade+on.">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li><li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation:+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease.">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li><li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer.">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li><li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation.">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li><li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+(RB)+and+Lamin+A/C+interaction+and+stabilization.">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li><li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+(UFDS):+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation.">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2/3.">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li><li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues.">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu kağıt algılayabilir ve Rb endojen SUMOylation insan hücrelerinde çözümlemek için bir protokol açıklar. Bu yöntem özellikle küresel sinyal SUMO ile ilgili herhangi bir değişim olmadan endojen Rb protein üzerinde duruldu gibi Rb-SUMO değişiklik tamamen doğal fizyolojik koşullar altında soruşturma için önemli bir araçtır.
Bu amaca ulaşmak için unutmayın ki bu: 1) SUMO dört izoformlarının (SUMO1-4, her farklı genler tarafından kodlanmış) ubiquitination ile karşılaştırıldığında kapsar rağmen SUMO türler daha az bol; 2) çoğu SUMO hedef proteinler için verilen bir protein yalnızca küçük bir bölümünü sabit devlet, SUMO konjugasyon ilgili enzimler arasında sürekli rekabet sonucu ve14,21deconjugation SUMOylated olduğunu; ve 3) SUMO hedefler SUMOylation ve deSUMOylation hızlı döngüleri tabi. Örneğin, son veri geçerli bu kağıt yazarlar tarafından elde Rb-SUMO1 sadece SUMOylation13 tersine çevrilebilir, son derece dinamik bir süreç olduğunu anlayışı ile tutarlıdır erken G1 aşamasında zaman çok kısa bir pencere için var olduğunu göstermek . Tüm bu gerçekler doğrudan verilen bir protein endojen SUMOylation tespit etmek zor olsun. Böylece, başarılı bir şekilde bu algılamak için kesin şartlar altında bu değişiklik oluşur tanımlamak önemlidir. Örneğin, önerilen bu protokol için hücre döngüsü Eşitleme zamanlaması Rb SUMOylation tespiti için çok önemlidir. En iyi duruma getirilmiş deneysel bir işlem için verilen bir protein alt düzey SUMO-modified tür algılama başarılı da önemlidir. Örneğin, uygun sonication veya geçen aracılığıyla iğneler yapışkan ve yapışkan bileşenleri genomik DNA nedeniyle oluşumu engelleyebilir, böylece uygun sonication toplam protein ayıklama kolaylaştırabilir. Ayrıca, hedef protein yüksek afinite ile iyi bir Monoklonal antikor miktarı ve immunoprecipitation özgüllüğü artırmak için yardımcı olabilir. Özet olarak, önerilen yöntem daha da altında endojen Rb SUMOylated, hangi aşağıdaki overexpression tabanlı fonksiyonel testin öncül olduğunu fizyolojik şartlarda keşfetmek için önemlidir.
Belirli bir protein SUMO sinyal yükseltmek için co-overexpress yanı sıra diğer SUMO kaynaklı proteinler (genellikle Ubc9 ve SUMO protein) hücrelerde bu protein için yaygındır. Bir antikor substrat karşı kullanarak basit bir Western blot daha yüksek molekül ağırlıklı, bu proteinin SUMOylated formu bulmak için en kolay yolu olsa da, biz bu yöntemle SUMO-Rb sinyali algılamak başarısız oldu. Böylece, bu kağıt sadece zarlarını eksojen Rb protein SUMO değişimini algılamak için bir yöntem üzerinde duruldu. Ayrıca, bu yöntem nasıl yapay olarak geliştirmek veya SUMO-konjugasyon Rb, ortadan kaldırmak için nitelendirdi. Tek E2 ligaz doğrudan SUMO belirli hedefleri22' ye aktarmak için Ubc9 bulundu. Böylece, Rb C terminaline eritme tarafından Ubc9 önemli ölçüde SUMO-modifikasyonu Rb. bu yöntemi kullanarak teşvik etmektedir, bu kağıt yazarlar başarıyla Rb SUMOylation yeterince onun bağlama artırarak kendi fosforilasyon terfi gösterdi CDK213için. Ayrıca, Rb SUMOylation kaybı fonksiyonel sonuçları çalışmaya, daha önce bildirilen11bir SUMO-eksik Rb yapı yazarlar oluşturulan. Bu geçerli raporda önerilen yöntem kullanarak, bu SUMO-Rb normal hücre döngüsü ilerleme ve Hücre proliferasyonu13için gerekli olduğunu gösterilmiştir.
SUMO1 ek olarak, SUMO2 ve SUMO3 aynı zamanda protein SUMOylation14,17önemli rol oynarlar. Çünkü onlar yakından ilgilidir ve % 97'si kimlik paylaşmak SUMO2 ve SUMO3 SUMO2/3 anılır. SUMO1% 50 benzerlik SUMO2/3 ile paylaşır. Bu yaygın olarak SUMO-2/3 ağırlıklı olarak hücre stres yanıt-e doğru15,17,23' te, söz konusu ise SUMO1 normal hücre fizyolojik fonksiyonları ve bakım, sorumlu olduğunu kabul edilir 24. Rb da bilinmeyen fonksiyon12ile SUMOylated SUMO2/3 tarafından olabilir olduğunu göz önüne alındığında, bu çalışmada önerilen yöntem hala algılama ve Rb bu değişiklik analizi için uygundur. RB ek olarak, yöntem tanımlamak burada yaygın olarak algılama ve hedef proteinler çeşitli SUMOylation fonksiyonel analiz için uygulanabilir.

Ökaryotik hücrelerde hücre döngüsü progresyon doğru kontrolü belirli olaylar gerçekleşecek bir sıralı şekilde1,2sağlar sıkı bir düzenleyici ağ temel alır. Retinoblastom (Rb) protein, ilk klonlanmış Tümör baskılayıcı1,3bu ağda önemli oyuncularından biri. Rb protein S faz geçiş ve tümör büyüme4,5G0/G1 için özellikle hücre döngüsü progresyon negatif bir regülatör olduğu düşünülmektedir. Ya doğrudan Rb işlev başarısız olur, çocuklarda en sık görülen göz içi malignite için Retinoblastom, ya da kanser5diğer birçok türde katkı sağlıyor. Ayrıca, Rb hücre farklılaşması, Kromatin remodeling ve mitokondri-aracılı apoptosis3,6,7de dahil olmak üzere birçok hücresel yollar ilgilenmektedir.
Translasyonel modifikasyonlar RB işlevi8,9yönetmelikte önemli bir rol oynamaktadır. Fosforilasyon böyle bir değişiklik olduğunu ve genellikle Rb inactivation için yol açar. Durgun G0 hücrelerde, Rb düşük fosforilasyon düzeyiyle etkindir. İlerleme G0/G1 evresi boyunca hücreleri Rb sırayla hiper-fosforile siklin bağımlı protein kinaz (CDKs) ve Rb devre dışı bırakın ve hücre döngüsü bastırmak yeteneğini ortadan siklinlere, siklin E/CDK2 ve siklin D/CDK4/6 gibi bir dizi olduğu gen ifadesi4,10ile ilgili. RB da küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO)11,12,13tarafından değiştirilmiş olabilir.
SUMO hedef proteinlerin çeşitli kovalent bağlı bir Ubikuitin benzeri proteindir. Hücre döngüsü Yönetmeliği de dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçler için önemlidir, transkripsiyon, protein Hücrede yerleşimi ve bozulması, taşıma ve DNA tamir14,15,16, 17 , 18. SUMO konjugasyon yolu dimerik SUMO E1 aktive enzim SAE1/UBA2, tek E2 conjugating enzim Ubc9, birden çok E3 ligazlar ve SUMO özgü proteaz oluşur. Genel olarak, yeni doğmakta olan SUMO proteinler proteolytically olgun formu oluşturmak için işlenmesi gerekir. Olgun SUMO E1 heterodimerdir tarafından etkinleştirilir ve E2 enzim Ubc9 transfer. Son olarak, SUMO C-terminal glisin kovalent bir substrat hedef lizin Birleşik ve bu işlem genellikle E3 ligazlar tarafından yönetilir. SUMO protein değiştirilmiş substrat belirli proteaz tarafından kaldırılabilir. Bu kağıt yazarlar tarafından bir önceki çalışma Rb SUMOylation hiper-fosforilasyon için erken G1 faz, hücre döngüsü ilerleme13için gerekli olan bir işlem önde gelen CDK2, onun bağlama artırır saptandı. Biz de Rb SUMOylation bir azalma hücre çoğalması kaybolmasına neden olduğunu gösterdi. Ayrıca, son zamanlarda Rb SUMOylation Rb protein proteasomal işlemlerinden, böylece artan Rb protein hücreleri19düzeyini korur gösterilmiştir. Bu nedenle, SUMOylation çeşitli hücresel süreçler Rb işlevinde önemli bir rol oynar. İleri çalışmalar için işlev sonucu ve Rb SUMOylation, fizyolojik alaka Rb insan hücreleri veya hasta dokuların SUMO durumunu analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirmek için önemli.
SUMOylation tersine çevrilebilir, son derece dinamik bir süreçtir. Böylece, genellikle tamamen endojen koşullar altında SUMO modifiye proteinleri tespit etmek zordur. Bu kağıt endojen Rb SUMOylation tespit etmek için bir yöntem sunar. Ayrıca eksojen Rb SUMOylation vahşi tipi Rb ve SUMO-eksik mutasyon11algılamak gösterilmiştir. Özellikle, Jacobs ve ark. özellikle Ubc9 füzyon Yönetmen: SUMOylation (UFDS)20tarafından verilen bir substrat SUMO modifikasyonu artırmak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem üzerinde bağlı olarak, bu iletişim kuralını zorla SUMOylation Rb ve fonksiyonel sonuçları analiz açıklar. Verilen bu SUMO yüzeylerde yüzlerce daha önce tarif var ve daha fazla sözde SUMO yüzeylerde birçok proteomik tabanlı deneyleri tespit edilmiştir, bu iletişim kuralı bu proteinler insan hücrelerinde SUMO modifikasyonu analiz etmek için uygulanır.

<table style="border-collapse:collapse;width:695pt" width="927">
	<colgroup>
		<col style="width:275pt" width="366" />
		<col style="width:206pt" width="275" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11995065</td>
			<td class="xl68" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Opti-MEM&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">31985070</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140079</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010023</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25200056</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Thymidine</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">T9250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nocodazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M1404</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">propidium iodide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">P3566</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Triton X-100&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">694</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">RNase A&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">EN0531</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">N-Ethylmaleimide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">E3876&#160;</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M107</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M158</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">protease inhibitor</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Roche</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">5892970001</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2025</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Rb antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Cell Signaling Technology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">#9309</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Protein A/G-Sepharose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2003</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Lipofectamine-2000&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">11668019</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Qiagen</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">30230</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Imidazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">I0250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">BIO-RAD</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">4561096</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Millipore</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">IPVH00010</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tween-20</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M147</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tubulin antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M30109</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">SUMO1 antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">33-2044</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">GFP antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M20004</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">715-035-150</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">32106</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells

Translasyonel modifikasyonlar proteinlerin hücre içi sinyal iletimi uygun düzenlenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu değişiklikler arasında küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) hedef proteinlerin hücresel süreçler, gen transkripsiyon, DNA tamiri, protein gibi düzenlemek için çeşitli lizin artıkları kovalent bağlı olduğu bir Ubikuitin benzeri proteindir etkileşim ve bozulması, hücre altı taşıma ve sinyal iletimi. Protein SUMOylation tespit için en yaygın yaklaşım ifade ve bırakmak için basit ve uygun mekanik adresleme için bir vitro biyokimyasal reaksiyon bakteri, rekombinant tagged proteinlerin saflaştırılması dayanır sorular. Ancak, SUMOylation vivosürecinin karmaşıklığı nedeniyle, öyle algılamak ve protein SUMOylation hücrelerde endojen koşullar ne zaman altında özellikle çözümlemek için daha zor. Bu kağıt yazarlar tarafından yapılan bir çalışmada endojen Retinoblastom (Rb) protein, hücre döngüsü ilerleme olumsuz düzenlenmesi çok önemlidir bir Tümör baskılayıcı özellikle SUMOylated erken G1 aşamasında saptandı. Bu kağıt algılama ve Rb SUMOylation çözümleme insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı SUMO-değişiklik Rb, aynı zamanda birçok diğer SUMO hedefli protein, insan hücrelerinde phenotypical ve fonksiyonel incelenmesi için uygundur.

Hücre döngüsü ilerleme sırasında endojen Rb SUMOylation algılamak için bu çalışma ilk HEK293 hücreleri hücre döngüsü (G0, erken G1, G1, S ve G2/M) beş farklı aşamalarında bu kağıt Protokolü bölümünde açıklandığı gibi senkronize. Eşitleme kalitesini nükleik asit leke Akış Sitometresi Analizi (şekil 1) tarafından takip propidium iyodür kullanılarak doğrulandı. Daha sonra hücreleri toplanmış ve RIPA arabellek denaturing tarafından lysed. SUMO proteaz inhibitörü, N-Ethylmaleimide, 20 mM yerli SUMO sinyal deneyler sırasında korumak için son bir konsantrasyon eklenmiştir. Sonra immunoprecipitation denaturing kovalent olmayan belirsiz etkileşim ve bir anti-SUMO1 antikor kullanarak aşağıdaki western blot engellemek için koşullar altında endojen Rb türlerin SUMO sinyal varlığı özellikle de algılandı erken G1 evresi (Şekil 2). Her ne kadar küresel SUMOylation S/G2/M aşamasında zaman noktası, Rb SUMOylation adlı, geliştirilmiş oldu (Şekil 2, giriş paneli) değişiklik olmamıştı. Bu bulgu Rb SUMOylation sade bir şekilde değiştirilmiş küresel SUMO konjugasyon faaliyet sonucu olmadığını göstermektedir. Böylece, bu makalede açıklanan analiz protein immunoprecipitation ve Western blot aşağıdaki sonuçları gösterir SUMOylation endojen Rb protein tespiti için izin verir.
Rb protein, oluşturulan bu çalışmada zorla SUMOylation algılamak için bir kurucu SUMOylated Rb oluşturmak Ubc9, onun C-terminal verimli ve seçici SUMOylation, Rb için (şekil 3A) izin vermek için tek SUMO E2 ligaz eritme tarafından. Ubc9, C93S, işlev kaybı mutasyon aynı zamanda C-Terminal bir denetimi (şekil 3A) hizmet için Rb, eritilmiş olan. Daha fazla SUMO-Rb sinyal özgüllük güçlendirmek için Ubc9 yalnız olmayan erimiş de inşa edildi. 20 mM ile N-Ethylmaleimide takıma RIPA arabelleği lysed önce O'nun öğesini Plazmid dört 48 h HEK293 hücre içine transfected. Tüm proteinler sonra tahlil, yıkmak için bu kağıt Protokolü bölümünde açıklandığı gibi tabi tutuldu. Eluted Rb proteinler Western blot tarafından analiz edildi. Ubc9 fusion yönetmen-Ubc9 arızalı mutasyon, C93S, bu sinyali üretmek başarısız oldu, ancak Rb SUMOylation bir anti-SUMO1 antikor (şekil 3B, SUMO1 paneli), kullanarak tespit edildi. Not bile daha yüksek molekül ağırlıklı Wataha götürür Ubc9-füzyon tarafından neden olduğu yüksek verimli SUMO değişikliği doğrudan Rb antikor kullanarak tespit edilebilir ve SUMO sinyal (şekil 3B, Rb paneli) karşılık gelir. Ayrıca, Ubc9 yalnız herhangi bir SUMO konjugasyon daha fazla Rb özel SUMOylation (şekil 3B) teyit neden olmadı.
SUMO1 Rb protein11720 lizin Birleşik çünkü Rb SUMOylation daha ileri düzeyde çözümlemek için bu çalışmada bir SUMO-eksik mutasyon bir arginin (K720R) ile bu lizin kalıntı değiştirerek oluşturulur. SUMO-fiil iki geçici ifade Rb proteinlerin algılama kolaylaştırmak için bir GFP-SUMO1 yapısı hücre içi SUMO sinyal artırmak için eklendi. Etiketli onun yaban türü veya mutant Rb HEK293 hücrelere GFP-SUMO1, tahlil ve Rb-SUMO1 fiil yeteneği analiz aşağı çekme ardından birlikte ortak transfected. Gibi K720R mutant Rb Rb SUMOylation (şekil 4) tespit etmek için önerilen yöntemin yeteneği daha da güçlendirilmesi, SUMO modifikasyonu tamamen kaldırıldı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56096/56096fig1.jpg"> 
Resim 1 : Hücre döngüsü eşitleme tahlil Akış Sitometresi tarafından doğrulanmasını. HEK293 hücreler kültürlü ve G0, erken G1 G1, S ve G2/M aşamaları hücre döngüsünün bu protokol için açıklanan senkronize. Hücre döngüsü Dağılımları (FACS) sıralama Floresans aktif hücre tarafından belirlenmiştir. Kantitatif analiz FACS testin bir örneği temsil veri gösterilir (n = 1). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56096/56096fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56096/56096fig2.jpg"> 
Resim 2 : Rb's SUMOylated erken G1 aşamasında. HEK293 hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında bu protokol için açıklandığı gibi senkronize. Hücreleri toplanmış ve 20 mM ile N-Ethylmaleimide takıma RIPA tampon lysed. Giriş denetimleri üzerinde bir % 4 - % 20 SDS-sayfa degrade jel dolu, transfer ve anti-SUMO1 ve anti-tübülin ile belirtildiği şekilde deyimiyle. Kalan hücre lysates sonra 1: 200 bir dilüsyonu anti-Rb antikor kullanılarak immunoprecipitation tabi tutuldu. Elde edilen eluents % 4 - % 20 SDS-sayfa degrade jel ve anti-SUMO1 antikor ve anti-Rb antikor kullanarak immunoblotted tarafından ayrı kaldık. Bu deney ile aynı sonucu iki kez tekrarlandı. Bu rakam izni13ile değiştirildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56096/56096fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56096/56096fig3.jpg"> 
Şekil 3 . Rb-Ubc9 füzyon protein SUMO modifikasyonu tespiti. Ubc9 fusion Yönetmen: SUMOylation (UFDS) yapıları, Rb. (B) kurucu SUMOylation, UFDS tarafından neden olduğu Rb,(a)diyagramı. HEK293 hücreleri geçici onun etiketli UFDS yapıları ile transfected RIPA arabelleği 20 mM N-Ethylmaleimide ile lysed. Her örneği lysate toplam O'nun öğesini Rb-Ubc9 füzyon protein veya (negatif kontrol kullanılan), Ubc9 sırasıyla aşağı çekmek için Ni-NTA özel boncuk ile inkübe. Saf protein % 4 - % 20 SDS-sayfa degrade jel ve immunoblotted anti-SUMO1 ve anti-O'nun antikorlar tarafından ayrı kaldık. O'nun-Rb: Rb-Ubc9 füzyon protein 6XHis öğesini; O'nun-Ubc9: 6XHis Ubc9 sadece etiketledi. RB-Ubc9: değiştirilmemiş Rb-Ubc9; RB-Ubc9-S: SUMOylated Rb-Ubc9; Hyper-sorun-Ubc9: hiper fosforile Rb-Ubc9. Şekilde gösterilen üç bağımsız denemelerin temsilcisi sonuçlarıdır. Bu rakam izni13ile değiştirildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56096/56096fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56096/56096fig4.jpg"> 
Şekil 4 . Rb SUMOylation SUMO-eksik K720R mutasyon azaltır. HEK293 hücreleri geçici işbirliği GFP-SUMO1 birlikte vahşi türü veya mutant Rb-O'nun yapıları ile transfected. Hücreleri toplanmış ve 20 mM ile N-Ethylmaleimide takıma RIPA tampon lysed. Lysates küçük bir bölümünü doğrudan Western tarafından analiz edildi leke giriş denetimi. Lysates kalan bu protokol için açıklandığı gibi O'nun öğesini Rb proteinler aşağı çekmek için Ni-NTA özel boncuk ile inkübe ve anti-SUMO1 ve anti-O'nun antikorlar ile immunoblotted idi. Rb 720, lizin arginin mutasyon tot NotAlly bu proteinin SUMO modifikasyonu onuntemsilcilerini yasakladı Deneme bir kez buna benzer bir sonuç daha önce11rapor ile yapılmıştır. Bu rakam izni13ile değiştirildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56096/56096fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Çözüm</td>
			<td>Bileşenleri</td>
			<td>Yorumlar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lizis arabellek</td>
			<td>50 mM Tris, pH = 8.0; 150 mM NaCl; % 1 NP-40; % 1 sodyum deoxycholate; %0.1 SDS</td>
			<td>Proteaz inhibitörü kokteyl ve N-ethylmaleimide kullanımdan hemen önce ekleyin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yıkama arabellek</td>
			<td>50 mM NaH2PO4 pH 8.0; = 300 mM NaCl; 20 mM imidazole</td>
			<td>Sadece tahlil çekme için kullanılan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elüsyon arabellek</td>
			<td>50 mM NaH2PO4 pH 8.0; = 300 mM NaCl; 250 mM imidazole</td>
			<td>Sadece tahlil çekme için kullanılan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabellek yükleme x 6</td>
			<td>0,5 M Tris, pH 6.8; = % 30 gliserol; % 10 SDS; %5 β-mercaptoethanol; %0.1 bromphenol mavi</td>
			<td>Mağaza-20 ° c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabellek çalıştıran x 10</td>
			<td>0.25 M Tris, pH 8,6; 1.9 M glisin; % 1 SDS</td>
			<td>1 x çalışan tampon yapmak için: 100 ml 10 çalışan arabellek x 900 mL GKD2ile O karıştırmak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x Aktarım arabellek</td>
			<td>0.25 M Tris, pH 8.3, 1.9 M glisin</td>
			<td>1 x Aktarım arabellek yapmak için: 100 mL 10 x 200 ml metanol ile Aktarım arabellek ve 700 mL GKD2O karıştırmak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x TBS arabellek</td>
			<td>GKD2O: 24,08 g Tris pH 7.4 1 L içinde; 80 gr NaCl</td>
			<td>1 x TBST tampon yapmak: 900 mL GKD2O ve ara-20 1 mL 100 mL 10 x TBS arabellek karıştırın</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabellek engelleme</td>
			<td>%1 5 yağsız kuru süt ile x TBST</td>
			<td>Arabellek kullanımdan hemen önce hazırlamak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antikor seyreltme arabellek</td>
			<td>1 ile %3 BSA ve %0.02 sodyum azid x TBST</td>
			<td>Bu arabellek 4 ° C'de en az 6 ay için saklanan olabilir</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Çözümler ve arabellekleri.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells at JoVE.com

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) aile proteinler hedef proteinlerin çeşitli hücresel süreçler düzenleyen lizin kalıntıları Birleşik. Bu kağıt Retinoblastom (Rb) protein SUMOylation insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda tespiti için bir protokolünü açıklar.

Vivo Algılama ve Rb Protein SUMOylation insan hücrelerinde analizi

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

7.2K Görüntüleme.  Eye and ENT Hospital of Fudan University. Küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) aile proteinler hedef proteinlerin çeşitli hücresel süreçler düzenleyen lizin kalıntıları Birleşik. Bu kağıt Retinoblastom (Rb) protein SUMOylation insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda tespiti için bir protokolünü açıklar.

Video: In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Biyoloji

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...