Bu eser Sapienza Roma Üniversitesi ve İtalyan Kistik fibrozis araştırma Vakfı (proje Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny ve Pavia FFC heyetleri tarafından benimsenen FFC #11/2014) fon tarafından desteklenmiştir. Bu eser parçası da FILAS Grant Prot FILAS-RU-2014-1020 tarafından desteklenmiştir.
Bronş epitel hücreleri sağlamak için Dr Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, İtalya) için minnettarız.

1. hücre hazırlık
<ol><li>Tohum 2.5x106 hücre 10 ml, en az gerekli orta (2 mM glutamin (MEMg), ile desteklenmiş MEM) % 10 fetal sığır serum (FBS), antibiyotik (penisilin ve streptomisin 0.1 mg/mL) ve puromisindir (0,5 µg/mL seçimi ve bakımı için hücre satırı) bir T75 şişesi içinde. 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye 2 gün kuluçkaya. Deneme başlamadan önce kesiştiği yerde ters bir mikroskop altında hücre kontrol. Not: deneme için kullanılan ölümsüzleştirdi insan bronş epitel hücreleri puromisindir direnci veriyor lentiviral bir vektör ile transduced hücrelerdir. Stabil bir işlevsel CFTR14,15hızlı.</li>
	<li>Hücre izdiham 90-%100 ulaşmıştır sonra şişeye ortamından Aspire edin ve biyolojik güvenlik kabin sınıfı II altında bir atık şişe içine atın. 6 mL tamponlanmış fosfat hücrelerle serum kalsiyum ve magnezyum (CMF-PBS) yıkayın. Yavaşça şişeye el ile kaya ve CMF-PBS atın. Not: pipet ile hücre monolayer dokunmamaya dikkat et.</li>
	<li>CMF-PBS 10 mL ekleyin ve 10 dk 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya.</li>
	<li>CMF-PBS Aspire edin ve o atın. Sonra tripsin/EDTA 2 mL şişe için ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça tamamen hücreleri ceket ve hücreleri gözle görülür bir mikroskop altında müstakil kadar 10 dk 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya çözüm sağlayan şişesi, rock. Not: kuluçka süresi sonunda, yuvarlak ve değil bağlı plastik yüzey hücreleri görünmelidir. Hücreleri de müstakil değilseniz, manuel ajitasyon gerekli olabilir.</li>
	<li>MEMg artı % 10 10 mL ekleyin FBS tripsin devre dışı bırakın ve şişeye alt yıkayarak hücreleri toplamak için. Birimin bir konik 50 mL tüp içine aktarın.</li>
	<li>Tüp 80 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve MEMg artı % 10 6 mL hücrelerde yeniden askıya FBS. Tekrar tekrar herhangi bir kümeleri kadar kırmaya pipet.</li>
	<li>Bir micropipette ile hücre süspansiyon 10 µL çıkar ve birimin kapak daha önce Burker veya Neubauer odası üzerinde koymak cam altında enjekte.</li>
	<li>Hücre sayısı.</li>
</ol>2. hücre kültüründe tohum ekler
<ol><li>12-şey plaka her kuyuya, kültür Ekle steril cımbızla (şekil 1) aktarın. Plaka yüzeyine düzeltmek için ekler kenarları boyunca basın için cımbız kullanın. Not: Yapışma sağlar bir yapışkan alt ekler var.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> Resim 1 : Düzgün bir 12-şey plaka kuyu koymak silikon kültür ekler, şematik gösterimi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="2"><li>Düzgün hücre süspansiyon MEMg artı % 10 oranında seyreltin FBS. Her Bölmesi ekleme hücre süspansiyon (yaklaşık 3.5x104 hücreleri/odası), 70 µL ile doldurun. Not: Her kompartımanda uygulanan hücre yoğunluğu hücre türüne göre değişir. Bu izdiham 24 h içinde tamamlamak için yol açar bir hücre yoğunluğu kullanmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Mikroskop altında Hücre Ekle bölmeleri sızıntı değil ve 37 ° C ve % 5 CO224 h 12-şey plaka kuluçkaya kontrol edin.</li>
</ol>3. sözde yara iyileşme tahlil
<ol><li>Kuluçka sonra hücreleri Konfluent hücre monolayers oluşmuş doğrulamak için ters mikroskop altında görselleştirin.</li>
	<li>Test bileşikler (Örneğin, amper) 1 mL MEMg yeniden askıya alma. Not:-20 ° C'de depolanan stok çözüm başlayarak taze amper dilutions hazırlamak</li>
	<li>Yavaşça ekler tarafından steril cımbız kaldırmak. Hücre monolayers kırmamaya dikkat et. Ekler emici kağıt üzerine aktarın. Not: aynı ekler yeniden kullanmak için onlara en az 3 h için % 70 etanol içinde sterilize. Bu daha sonra çöpe önerilir.</li>
	<li>Yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için iyi bir micropipette kullanarak başına MEMg 1 mL ekleyin. Plaka kapatın ve yavaşça salla. Not: Orta kendi kesintileri önlemek için doğrudan hücre monolayers üstüne eklemeyin.</li>
	<li>Orta Aspire edin ve MEMg 1 mL de başı ile değiştirin. Plaka kapatın ve bir video kamera ile donatılmış 4 X büyütme, ters mikroskop altında (ekler tarafından oluşturulan) boş hücre boşlukları görselleştirmek. Görüntüleri (T0) zaman sıfır ve bir .jpg biçiminde kaydedebilirsiniz.</li>
	<li>Orta kuyulardan kaldırmak, PBS ile 1 mL yıkar ve o atın.</li>
	<li>(3.2 noktada hazır) test bileşikler wells için ekleyin. Tedavi edilmemiş kontrol örnekleri için MEMg 1 mL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>15, 20 ve 24 h tedavi sonra 4 X büyütme, mikroskop altında hücre göç gözlemlemek ve görüntüleri. Not: Bu adım sırasında esir alma imge T0 gelince aynı alanlarda çalışın. Hangi imge esir alma zaman aralıkları seçim hücre geçiş hızına bağlıdır.</li>
	<li>Bazı seçmeli inhibitörleri, Yani AG1478, hücre göç, etkisini incelemek için ekler kaldırmadan önce her INSERT bölmesi ortamından Aspire edin.<ol>
<li>Her bölmesi taze MEMg ile yıkayın ve MEMg AG1478 ile desteklenmiş 70 µL ile doldurun.</li>
		<li>3.3 noktasından açıklandığı gibi kuluçka 37 ° C ve %5 CO230 dk sonra devam. Not: çamaşır adım ve hücre monolayers belirli inhibitörleri ile ön sırasında ekler kaldırmak değil dikkatli olun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. görüntü analizi
<ol><li>Üzerinde ikmal-in deneme, görüntüleri çeşitli deneysel grupları en iyi temsil eden örnekleri seçin ve T0, T15, T20 ve T24 h tek görüntüleri içeren bir ZIP dosyası oluşturun. Not: Tek görüntüleri tüm örnekleri için seçilen zaman aralıklarında alınır. Triplicates en az üç kez tekrarlanan her deneme için çalıştırın. Sonunda, tüm deneysel grupları, en az 3 fotoğraf ("a", "b", "c", her bağımsız deneyden türetme vb,) için her zaman noktası analiz edilir.</li>
	<li>Belgili tanımlık fermuar eğe içine otomatik olarak seçilen zaman noktalarda (yüzde) olarak cep kaplı ve kazı bölgelerinden deneysel verileri içeren bir elektronik tablo Özet dosya e-posta yoluyla sağlayan görüntü analiz yazılımı yükleyin. Not: Öncü ve gap alanının tanınması büyük ölçüde kenar algılama yöntemi (hangi keskin görüntü parlaklığını değiştirir noktaları belirlenmesi amaçlı) temel alır.</li>
	<li>Verileri kaydetmek ve onları toplamak. Ortalama değer açısından tüm verilerin zaman sıfır normalleştirmek. Her zaman noktası ve göreli standart hata (SEM) tüm çoğaltır normalleştirilmiş veri ortalama değerini hesaplamak. İki yönlü Varyans analizi (ANOVA) kullanarak, uygun istatistik yazılımı ile istatistiksel analiz yapmak. Peptid tedavi grupları ve farklı zaman aralıklarında kontrol grubu arasında farklılıklar istatistiksel olarak signiﬁcant bir piçin olmak olarak kabul edilir < 0,05.</li>
	<li>Elde edilen verileri seçili zaman aralıkları tüm örnek gruplar karşı hücre bölgeyi yüzdesini gösteren bir çubuk grafik, bir grafik çizmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+epithelial+wound+detection.">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li><li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complicated+skin,+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens?.">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?.</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).</li><li>Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients:+an+update.">Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update.</a> Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).</li><li>Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+wound+healing:+biological+and+therapeutic+considerations.">Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations.</a> Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).</li><li>Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+stem+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing.</a> Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).</li><li>Hu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+repair+in+wound+healing.">Tissue engineering and regenerative repair in wound healing.</a> Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).</li><li>Ramot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PPARgamma-mediated+signalling+in+skin+biology+and+pathology:+new+targets+and+opportunities+for+clinical+dermatology.">The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology.</a> Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).</li><li>Lai, Y., Gallo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPed+up+immunity:+how+antimicrobial+peptides+have+multiple+roles+in+immune+defense.">AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense.</a> Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).</li><li>Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+of+multicellular+organisms.">Antimicrobial peptides of multicellular organisms.</a> Nature. 415, 389-395 (2002).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).</li><li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frog+skin-derived+antimicrobial+peptide+esculentin-1a(1-21)NH2+promotes+the+migration+of+human+HaCaT+keratinocytes+in+an+EGF+receptor-dependent+manner:+a+novel+promoter+of+human+skin+wound+healing?.">The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?.</a> PLoS One. 10, e0128663 (2015).</li><li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Amino+acids+incorporation+in+the+frog+skin-derived+peptide+esculentin-1a(1-21)NH2+is+beneficial+for+its+multiple+functions.">D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions.</a> Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).</li><li>Cappiello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esculentin-1a-derived+peptides+promote+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+internalized+in+bronchial+cells+of+cystic+fibrosis+patients+and+lung+cell+migration:+biochemical+properties+and+a+plausible+mode+of+action.">Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).</li><li>Bebok, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+cAMP+agonists+to+activate+rescued+deltaF508+CFTR+in+CFBE41o-+airway+epithelial+monolayers.">Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers.</a> J Physiol. 569, 601-615 (2005).</li><li>Trinh, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue.">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li><li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806.">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li><li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37.">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li><li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li><li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus.">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Hücre göç yara iyileşmesi, embriyonik gelişim ve kanser metastaz dahil olmak üzere birçok fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli bir süreçtir. Hücre göç vitro çalışma temel yordamı içerir: (i) bir hücre monolayer, (ii) hücreleri, Konfluent tabakası sözde bir yarada üretimi oluşturulması (III) yara kadar farklı zaman aralıklarında görüntüleri yakalama kapatma ulaştı , (iv) seçilen hücreleri geçiş hızını ölçmek için görüntü sırası analizi.
Sonuçlarımız kültür ekler uygulanması objektif ve hücre geçiş özellikleri kantitatif değerlendirilmesi için güvenilir deneysel teknik olduğunu göstermiştir. Bu tahlil temel laboratuvar ekipmanları ile herhangi bir araştırma grubu tarafından gerçekleştirilebilir. Ancak, bazı kritik adımlar Protokolü'nün tekrarlanabilirlik ulaşmak için düşünülmelidir. Örneğin, pilot deneyler, tohum izdiham tüm bireysel örneklerde aynı ölçüde almak için her yerde hücrelere tam sayısını tarafından tanımlamak önemlidir. Bu amaç için bir eşitlenmiş döngüsü aşama hücrelerle olan ve tohum önce hücre kümeleri kaçınmak önemlidir. Topaklanma en aza indirmek için mümkün bir şekilde hücre süspansiyon bir şırınga iğnesi ile nazik bir geçiştir. Ancak, örnekleri boyutunu artırarak önemli ölçüde değişkenlik hücreleri arasında düşmesine katkıda bulunacaktır.
Buna ek olarak, tüm örnekleri iyi tanımlanmış bir genişliğe sahip bir boşluk oluşturulması çok önemlidir. Bu amaçla, silikon ekler iki kat daha fazla yeniden kullanılmamalıdır. Ayrıca, silikon ayrılık duvar altında hücrelerinin büyümesini kaçınılmalıdır. Bu sorunları önlemenin, yumuşak basınç INSERT, üstüne bir kez yerleştirilen amacına plaka/iyi, el ile eklemek için plastik yapışma artırmak için steril cımbız vasıtasıyla uygulanabilir. Dikkatli eklemek kaldırılması da boş hücre yüzey genişleme hücre monolayer bozulma ile engel olacaktır.
Ancak, bir kez eklemek doğru yerinden ve sahte bir yara mükemmel üretilen, bazı hücre hatları özellikle serum veya Takviyeler Vitaminler, amino asitler ve büyüme faktörleri gibi olmadan ortamda inkübe Eğer plastik yüzeyden bağlantısını kesin. Hücre kültürü ortamında bu faktörler yokluğu onlar yara iyileşmesi teşvik faaliyetle test bileşiklerin engelleyebilir gerçeği tarafından dikte. Bu sorunu aşmak için kültür orta kompozisyon rasyonel seçim önerilir.
Bir kritik adım yordam Şifa Bu yarayı ayarlamadan önce düşünün için farklı hücre türleri arasında bulunan farklı geçiş hızıdır. Ayrıca bu durumda, ön deneyler görüntüleri yakalanması gerekiyor doğru zaman aralıkları belirlemek amacı ile planlanmış olması gerekir. Bu yöntem ile ilişkili bir sınırlama böyle kültür ekler geçiş süspansiyon (örneğin polimorfonükleer lökositler) yetişen hücre eğitimi için istihdam olamaz düşünün gereklidir.
Yara iyileşmesi deneyleri gerçekleştirilen rağmen silikon kültürü ile ekler daha klasik kazı kazan tahlil daha pahalıdır, onlar hücre göç faaliyete veri hızlı ve doğru üreme sağlar. Sistem Kurulum olduğunda, önemlisi, bu etkinlik endojen veya eksojen faktörler tarafından uyarılan şifa yara temel moleküler mekanizması üzerinde genişletmek için kullanılabilir. Bu amaçla, hücre monolayers belirli molekülleri (Örneğin, inhibitörleri) ile Önarıtma sözde yara oluşturmadan önce yapılabilir. Bir örnek Önarıtma amper tarafından indüklenen "yaralı" alan kapatılması doğrulamak için hücre bölünmesi oranı20 veya (ii) metalloprotease inhibitörleri tarafından etkilenir olup olmadığını keşfetmek için (i Hücre proliferasyonu engelleyici mitomycin C içeren hücrelerin şöyle verilir: katkısını metalloproteases içinde harekete geçirmek EGFR aracılı sinyalleşme yolu12.
Önemlisi, yara kapatma işlemi sırasında örnekleri olabilir sabit ve sitoiskeleti ve çekirdekleri algılama için uygun lekeleri ile tedavi (phalloidin ve DAPI, sırasıyla) değişiklikleri hücre morfolojik açıdan görselleştirmek için (Örneğin, lamellipodia ön kenarında oluşumu) floresan/confocal mikroskobu tarafından. Ayrıca, tedavi floresan etiketli AMP ile hücre hücresel dağılımı (membran yüzey veya hücre içi/intranuclear Yerelleştirme), farklı zamanlarda hücre göç Etkinlik başlangıcından bu yana görselleştirme sağlayabilir. Ayrıca, bu uçlar yara iyileşme faaliyete polarize ve farklılaştırılmış epitel hücreleri (örneğin, birincil bronş hücreleri hava-sıvı arayüzü muhafaza), onlara uygun transwell yerleştirilen sonra analiz etmek için istismar geçirgen destekler.
Sonuç olarak, açıklanan yöntemi yapisan hayvan hücreleri/epitel doku farklı türde göçmendir özellikleri yanı sıra en umut verici yara iyileşmesi yelpazesi anlayış belirgin şekilde artırmak için önemli potansiyele sahip Organizatör ve/veya inhibitörleri, kısa bir süre içinde ve yüksek doğruluk ile.

Büyük ölçüde hayvanlarda yara iyileşmesi bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma1sonra yeniden kurmak için temel bir süreç olduğu bilinmektedir. Epitel yüzeyleri dış ortama (Örneğin, deri, solunum sistemi ve gastrointestinal yolları) maruz rağmen fiziksel ve kimyasal hakaret üzerinden koruyucu bir bariyer oluşturmak, yara oluşumu kolayca, özellikle sonra oluşabilir cerrahi veya mikrobiyal enfeksiyonlar2. Örnek olarak, akciğer dokusu tarafından Kistik fibrozis (CF) olanlar, özellikle de fırsatçı bakteriyel pathogen Pseudomonas aeruginosa, kolonizasyon sonucu solunum yetmezliği3airways epitel, zarar yol açar, 4. Yara iyileşmesi bir yaralı doku5normal mimarisini geri yüklemek için bir karmaşık ana bilgisayar onarım mekanizmadır. Epithelialization, anjiogenez ve kolajen üretimini ve hücre farklılaşması6,7,8 ile doku remodeling kapsayan bir yenilenme dönemi ardından ilk inflamasyon ile karakterizedir . Epitel bütünlüğünü güvenceye almak için ve mikrobiyal nükleer silahların yayılmasına karşı denetlemek için tüm canlıların savunma molekülleri, antimikrobiyal peptidler (Amper)9,10dahil üretmek. İşlem şifa yara vitro hücre artıkları ve farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler eksikliği nedeniyle benzetimini yapmak çok zordur. Ancak, uyararak sözde bir yara kapatma hızlandırmak için bir peptid vitro yeteneğini epitel hücrelerinin geçiş güvenliği aşılan bir epitel iyileşmek için onun yetenek gösterge. Gerçekten de, hücre göç yara iyileşmesinde hızı sınırlaması olay ve hücre geçiş etkileyen faktörler eğitim geliştirilmiş yara iyileşmesi için hedef tedaviler için yardımcı olacaktır.
Burada, bir çok tekrarlanabilir deneysel tahlil hücre göç içinde vitrodeğerlendirmek için özel silikon kültür ekler göre sağlanır. Konfluent hücre monolayer üzerinde 500 mikron boşluk (sözde yara) oluşturulması dayanmaktadır. Hücreler yapay "yaralı" alanının kenarındaki boş hücre alanına geçiş, yeni hücre-hücre kişiler şekillendirme başlar. Kültür Ekle hızlı yara deneyler şifa için yeni bir araç temsil eder. 500 mikron duvar tarafından ayrılmış iki rezervuarlar sağlanır ve düzgün bir 3 cm tabak tabak içine veya iyi bir 12-şey plaka yerleştirilebilir. Her Bölmesi ekleme bir hücre süspansiyon ile doldurma hücreleri ekleme kaldırma yaklaşık 500 mikron (ayrılık duvar aynı genişlikte) bir temiz boş hücre boşluk doğurmak iken izdiham kadar belirlenmiş her alanda büyümeye sağlar. Bir uygun hücre kültür testi karışımla takıma orta sonra amacına eklenebilir plaka/iyi. Daha sonra boşluğu kapatma ters bir mikroskop, tercihen bir resim alma için bir video kamera ile donatılmış altında farklı zaman aralıklarında görüntülenir. Son olarak, ölçüm değişiklikleri web tabanlı otomatik görüntü analiz programı tarafından cep kaplı alanda yaranın kapanması ve hücre geçiş hızını miktar sağlayacaktır. Genel olarak, bu yöntem klasik tahlil, burada bir çizik bile el ile steril bir iğne ile Konfluent hücre monolayers incising tarafından yapılır veya bir pipet ipucu11ile ilgili bir adım olur. Nitekim, son işlem plastik alt yemeğin yok edebilir plaka/iyi ve kırışıklıkları oluşturma yüzey kaplama. Buna ek olarak, bu son derece iğne/ipucu için araştırmacılar tarafından uygulanan basınç bağlı olarak "yaralı" alan iyi tanımlanmış genişlik boşluğu, tüm uzunluğu boyunca sahip değil. Ayrıca, yerinden çıkar hücreleri çizik kenarları canlı ve ölü hücreleri kümeleri oluşturabilir; Ayrıca, canlı hücreler "yaralı" alanının Yayilim sigara tekrarlanabilir sonuçlar12üreten hücre geçiş hızı ile etkileyebilir.
Ayrıca, sıfırdan görüntü analiz platformu sayesinde kullanıcılar hızla (dakika içinde) ek yazılım edinme gerekliliği olmadan Seçili hücrelerin göç davranışı üzerinde Nicel veri alabilir. Bu platform faz kontrast mikroskobu görüntülerini düşük (~ 5 X), orta (~ 10 X) ve yüksek (~ 20 X) büyütme analiz yeteneğine sahiptir. Görüntülerin (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff biçimi) bir zip dosyası yükledikten sonra analiz otomatik olarak alan hücre örtülü ve Karalama alanı yüzdesini, hem de hücre hızını gösteren bir Özet dosyası oluşturmak için yapılır göç, farklı zaman aralıklarında.
Bu çalışmada, bir kurbağa-cilt AMP-Türev, Yani Esc(1-21) ve onun diastereomer Esc(1-21) - 1 c13ve fonksiyonel CF transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR)14,15ifade bir bronş hücre satırı kullanarak, peptid indüklenen hücre göç tedavi edilmemiş (kontrol) örnekleri ile karşılaştırıldığında bir örnek sağlanmıştır. Hava yolu epitel ve CFTR akciğer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynamak unutmayın ve onarım16yara. Ayrıca, selektif inhibitörü (Örneğin, AG1478)17 epidermal büyüme faktörü reseptör (EGFR) aracılığıyla, geçiş bronş hücre tarafından yukarıda belirtilen peptidler indüklenen kanıt EGFR12aktivasyonu içerir, 18 bildirilir.
Özet olarak, bu yordam nasıl böyle silikon kültür ekler kullanımı doğru göç yapışık hücreleri (Örneğin, bronş epitel hücreleri) ve moleküler belirlemek için hızlı ve kolayca erişilebilen bir tahlil temsil ettiğini göstermek için hedeftir Bu tür olayları kontrol mekanizmaları.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="852">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Minimal essential medium (MEM)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB2071L</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECS0180DH&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Puromycin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypsin/EDTA 1X in PBS</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3052D</td>
			<td>Warm at room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DPBS with calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ibidi Culture-Insert 2 well</td>
			<td style="width:179px;">Ibidi&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Wimasis Image Analysis</td>
			<td style="width:179px;">Ibidi&#160;</td>
			<td style="width:119px;">30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PRISM software&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration

Bu çalışmanın amacı, antimikrobiyal peptidler (Amper), hücre göç teşvik etmek gibi bazı immunomodulatory molekülleri yeteneği değerlendirmek için yeni bir yöntem göstermektir. Önemlisi, hücre geçiş bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma sonra yeniden kurmak için yara iyileşme sürecinde bir hızı sınırlaması olayı değil. Bu yöntemin avantajı üzerinden el ile yapılan bir çizik içinde bir hücre monolayer dayanır, klasik tahlil özel silikon kültür kullanımı iyi tanımlanmış genişlik (500 mikron ile bir boş hücre sözde yara alan oluşturmak için sağlayan iki bölmeleri ekler olduğunu ). Buna ek olarak, bir otomatik görüntü analiz platformu nedeniyle hızla yaranın kapanması ve hücre geçiş hızı üzerinde nicel verileri elde etmek mümkündür. Daha doğrusu, iki kurbağa-cilt amper etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş-ecek var olmak göstermek. Ayrıca, ön bu hücrelerin belirli inhibitörleri ile bu tür olayların altında yatan moleküler mekanizmaları üzerinde bilgi sağlar.

Bu iletişim kuralı etkisi Esc(1-21) ve Esc(1-21) - 1 c fonksiyonel CFTR ifade bronş epitel hücreleri indüklenen hücre göç etkinlik açısından şifa yara belirlemek için kullanıldı. Bu tahlil, kültür ekler bir 12-şey plaka wells yerleştirildi ve her bölmesi MEMg % 10 ile desteklenmiş 35.000 hücreleri ile seribaşı FBS. Hücreleri 24 h içinde tam izdiham sonra ulaştı, bir 500 mikron boşluk oluşturulur ve her şey peptid farklı konsantrasyonlarda içeren MEMg doluydu. Deneme dört kez tekrarlandı. Şekil 2' de gösterildiği gibi hücre monolayer üretilen sözde yara alan neredeyse tamamen kapanmayla sırasıyla ~ 20 h, Esc(1-21) - 1 c ve Esc(1-21), 1 mikron ve 10 mikron en uygun konsantrasyonlarda içinde iki peptidler tarafından akımıdır. Bu Esc(1-21) - 1 c bronş hücrelerdeki sözde bir yara yeniden epithelialization teşvik daha verimli olduğunu gösterir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig2v3.jpg"> Resim 2 : Esculentin-1a etkisini elde edilen amper bronş epitel hücreleri monolayer içinde oluşturulan sözde bir yara kapatılması üzerine. Hücreleri silikon kültür Ekle her kompartımanda tohumlari ve onun kaldırıldıktan sonra hücre için hücre göç 15, 20 ve 24 s kanıt peptidler eklenmesinden sonra çekildi. Hücre bölgeyi noktası hesaplanmıştır her zaman yüzdesi tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Ctrl) karşılaştırıldığında ve y ekseni üzerinde bildirilir. Tüm veriler üzerinden dört bağımsız deneyler ± SEM anlamına gelir ve bir önceki çalışmada14alınır. Kontrol ve tedavi örnekleri arasında testleri için istatistiksel anlamlılık düzeyleri şunlardır: *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, ve ***p< 0,0001. Her peptid, 1 mikron, Denetim ile karşılaştırıldığında konsantrasyonu içeren hücrelerin tedavisinden sonra (T0) önce temsilcisi sonuçları ve 20 h gösterilen filmler de raporlanır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig2v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
EGFR aktivasyonu Esc kaynaklı yara kapatma bir rol oynadı olup olmadığını doğrulamak için bronş hücreleri AG1478, EGFR, selektif inhibitörü ekleme kaldırma önce 30 dakika 5 mikron ile preincubated. Hücre bölgeyi yüzdesi önemli ölçüde peptid indüklenen otelde hücreleri inhibitörü önceki peptid yönetimiyle (şekil 3), bu işaret ön işleme değil bulundu sonuçları için karşılaştırıldığında tüm zaman aralıklarında düşürülmüştür bu yana hücre göç EGFR aktivasyonu içerir. Ancak, daha fazla çalışmaları Esc peptidler (Örneğin, doğrudan EGFR etkinleştirme veya trans-harekete geçirmek membran bağlantılı EGFR ligandlar ayırmak için gösterilen metalloproteases tarafından aracılı tarafından tetiklenen moleküler olayları açıklamak için gerekli olacak 19).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig3v3.jpg"> Şekil 3 : Bronş epitel hücrelerinin peptid kaynaklı geçiş AG1478 önleyici etkisi. Hücreleri ekleme kaldırma önce 5 ile önceden inkübe mikron AG1478 30 dk için ve daha sonra aynı konsantrasyonu tek başına peptid ile tedavi. Tüm veriler üzerinden dört bağımsız deneyler ± SEM anlamına gelir ve bizim önceki iş14alınır. Belirtilen grup örnekleri arasında testleri için istatistiksel anlamlılık düzeyleri şunlardır: *p< 0,05; p< 0,0001. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig3v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration at JoVE.com

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

a-novel-in-vitro-wound-healing-assay-to-evaluate-cell-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

21.6K Görüntüleme.  Sapienza University of Rome. Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Video: A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin<em&gt; İn Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI&#39;nin Gelişimi ve Kimlik<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...