Name: characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
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Finanzierung für diese Arbeit wurde durch die American Heart Association (16SDG29870005) und der North Carolina State University Research und Innovation Seed-Finanzierung zur Verfügung gestellt.

1. Tag1: Zelle und Reagenz Vorbereitung Hinweis: alle Zell- und Reagenz Vorbereitung sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank gegen Kontamination der Proben durchgeführt werden.
<ol><li>Warm gefiltert Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM), fetale bovine Serum (FBS), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin in einem 37 ° C Wasserbad.</li>
	<li>Vorbereiten Neugeborenen menschlichen dermalen Fibroblasten (HDFn) Medien durch Ergänzung erwärmt DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin.</li>
	<li>Tauwetter ein Fläschchen mit gefrorenen HDFns und Zentrifuge für 8 min. bei 200 X g Kryokonservierung Medium zu entfernen. Zellen in vorbereitete HDFn Medien bei einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen/mL und Samen in einer T-75 Kultur Flasche aufzuwirbeln.</li>
	<li>Ort Kolben in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO 2) erlauben Zellproliferation.</li>
	<li>Store HDFn Media bei 4 ° c</li>
	<li>Pro und anti migratory Reagenzien vorzubereiten, wie gebraucht.</li>
</ol> 2. 3. Tag: Sphäroid Vorbereitung <ol><li>führen Sie die folgenden in eine Kultur-Haube, Kontamination der Proben zu verhindern.</li>
	<li>Wenn Zellen erreichen 80 % Konfluenz aspirieren Sie Medien und Hinzufügen von 0,25 % 5 mL Trypsin-EDTA. Shop-Kolben in einem Inkubator 37 ° C für 5 min, Zellen von der Oberfläche der Küvette vollständig zu lösen.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL erwärmten Medien in den Kolben, die Trypsin neutralisieren.</li>
	<li>In einem Microcentrifuge Schlauch mischen, 10 μL Trypan blau und 10 μl Zellsuspension.</li>
	<li>Zentrifuge der ursprünglichen Zellsuspension für 8 min bei 200 X g.</li>
	<li>Während die Zellsuspension zentrifugiert wird, ist ein Hemocytometer 10 μl Zellsuspension Trypan Blau hinzu, und führen Sie eine Zellzahl.</li>
	<li>Nach Zentrifugation, Aspirieren Medien ohne verdrängen die Zelle Pellet. Aufschwemmen der Zelle Pellet in einer Konzentration von 1,25 x 10 5 Zellen/mL.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL sterilem Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf den Boden einer 10 cm Petrischale Erhalt eine hydratisierte Umgebung während des Wachstums der Sphäroid.</li>
	<li>Drehen Sie den Deckel der Petrischale. Fügen Sie mehrere 20 μL Tropfen der Zellsuspension auf der inneren Oberfläche des Deckels Petrischale.</li>
	<li>Schnell den Deckel wieder umkehren und legen Sie sie wieder auf den Boden der Schale, ohne dabei die hängenden Tropfen zu verdrängen. Abbildung 1 zeigt erfolgreich gebildete hängenden Tropfen.</li>
	<li>Vorsichtig legen Sie die Schale in einem 37 ° C Inkubator und lassen Sphäroide wachsen in einer hängenden Tropfen Kultur für einen Zeitraum von 72 h.</li>
</ol> 3. 6. Tag: Einbettung Sphäroide in 3D Matrix <ol><li>führen Sie die folgenden in eine Kultur-Haube, Kontamination der Proben zu verhindern.</li>
	<li>Für die Bildung der ersten Schicht Fibrin, erstellen eine Gerinnsel Lösung ausreichend Volumen hinzufügen 100 μL Gerinnsel Lösung pro Bohrloch für so viele Brunnen wie erforderlich (1 Sphäroid pro Well). Klumpen bestehen aus 10 % 10 X HEPES Puffer nach Volumen (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), 2 mg/mL menschlichen Fibrinogen und 0,1 U/mL menschliches alpha Thrombin. Der Rest des Bandes Gerinnsel besteht aus hochreinem Wasser.
	<ol><li>Add Thrombin zuletzt und schnell hinzufügen Lösung zur gewünschten Brunnen in einem 48-Well-Platte um Klumpen zu vermeiden dadurch vor dem Brunnen hinzugefügt wird.</li>
	</ol></li> <li>Sanft schütteln/Tap-well-Platte um sicherzustellen, dass Fibrin Gerinnsel Mischung auch die gesamte Beschichtung ist, und platzieren Sie well-Platte in den Inkubator für 1 h Gerinnsel Unterschicht zu polymerisieren zu ermöglichen. Schütteln Sie well-Platte hart genug, um Blasenbildung zu induzieren nicht; einfach Felsplatte als nötig, bis die Gesamtheit des Brunnens beschichtet ist. Wenn größere Gerinnsel Mengen verwendet werden, kann dieser Schritt nicht notwendig sein.</li>
	<li>Sphäroide auf die Fibrin-Schicht übertragen.
	<ol><li>Entfernen der Brunnen Platte und die Petrischale mit Sphäroide in den hängenden Tropfen Kultur aus dem Inkubator und Sphäroide unter dem Mikroskop zu untersuchen. Legen Sie die Schale in der Kultur-Motorhaube.</li>
		<li>Invertieren vorsichtig den Deckel von der Petrischale für den Zugriff auf die hängenden Tropfen Kulturen.</li>
		<li>Mit einer Nadel 21 G eine 1 mL Spritze sorgfältig übertragen ein Tropfen aus dem umgekehrten Deckel in der Mitte des jeweils gut kümmert sich nicht um die Beschichtung der Unterseite des Brunnens polymerisierten Fibrin-Schicht zu durchbohren. Um den Tropfen effektiv zu übertragen, ziehen Sie die Tropfen in die Nadel. Ziehen den Kolben zurück, sobald der gesamte Rückgang in der Nadel ist zu stoppen; die Tropfen zu weit zurückziehen kann einführen Luftblasen, die effektive Sphäroid Transfer oder nachfolgenden Bildgebung stören können.</li>
		<li>Untersuchen die well-Platte unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass Sphäroide ordnungsgemäß in allen gewünschten Vertiefungen übertragen haben.</li>
	</ol></li> <li>Für die Bildung der zweiten Schicht von Fibrin, erstellen eine andere Gerinnsel Lösung verwenden die gleiche Vorbereitung wie oben für die Erstellung der ersten Fibrin-Schicht (Schritt 3.2). Sorgfältig pipette 100 μL auf jedem Sphäroid-haltigen Tropfen und untersucht unter dem Mikroskop wieder, um sicherzustellen, dass die Sphäroide sind noch intakt und nicht an den Rändern der Brunnen gerückt.</li>
	<li>Rückkehr der well-Platte in den Inkubator und die zweite Schicht für 1 h polymerisieren zu ermöglichen</li>
</ol> 4. 6. Tag: Zugabe von Pro-wandernde oder hemmende Faktoren <ol><li>Warm HDFn Medien auf 37 ° c</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte in eine Haube um Kontaminationen zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie Medien für jede Gruppe, einschließlich der entsprechende Konzentrationen von Pro/anti-migratory Agenten zu evaluierenden.</li>
	<li>Entfernen der well-Platte aus Inkubator und in eine Kultur Kapuze.</li>
	<li>Hinzufügen 500 μL der Standardmedien in jede Vertiefung der Kontrollgruppe Sphäroid, 500 μL der hemmenden Medien in jede Vertiefung des Arbeitskreises Migration gehemmt Sphäroid und 500 μl Pro wandernden Medien in jede Vertiefung des Arbeitskreises Migration-enhanced Sphäroid.</li>
	<li>Rückkehr der well-Platte in den Inkubator.</li>
	<li>Änderung Medien alle 48 h.</li>
</ol> 5. 6-9 Tage: Evaluation of Cell Migration und Proliferation <ol><li>Bild Sphäroide mit Hellfeld Mikroskopieren sofort nach Zugabe von Medien (0 h) und dann alle 24 h für 72 h Optional: zu jedem Zeitpunkt eine Z-Stapel-Bild nehmen, um festzustellen, ob Migration ist in Ebenen außerhalb des primären Fokus auftreten. Erfahrungsgemäß tritt dies nicht auf; Es ist jedoch nützlich, um sicherzustellen, dies ist der Fall bei jedem Versuch.</li>
	<li>Einsatz ImageJ Zelle Auswuchs in jede Vertiefung durch Analyse Prozent Zuwachs im Bereich für jedes Sphäroid durch Rückverfolgung der Zellenrahmen für jedes Sphäroid an jedem Punkt Mal in Folge und mit bestimmen die &#34; Maßnahme &#34; Funktion, um die Fläche zu berechnen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair.">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. 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(74), (2013).</li><li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration.">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li><li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Lead+the+Way:+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility.">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li><li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Z&#228;nker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix.">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Three-Dimensional+Wound+Healing+Model.">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li><li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+collagen+formation.">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li><li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation.">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li><li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+signaling+in+wound+repair.">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li><li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll ermöglicht die Prüfung der Zellwanderung in der Wundheilung ECMs über eine in-vitro- 3D Modell zugeordnet. Ein entscheidender Schritt für die ordnungsgemäße Durchführung des Verfahrens ist die richtige Entwicklung der Fibroblasten Sphäroide; Zellkonzentration während der Vorbereitung wurde optimiert, um eine Ausgangskonzentration von 2.500 Zellen/Tropfen, geben so dass Sphäroide zu bilden zuverlässig über eine Inkubationszeit von 72 h. Wenn eine unzureichende Anzahl von Zellen verwen...

Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der die Wiederherstellung der Gewebe Integrität nach Verletzung führt. Dieser Prozess wird in vier überlappende Phasen Blutstillung, Entzündungen, Verbreitung und Umbau, umgeben aufgeteilt die jeweils geregelt sind durch eine komplexe Kombination von löslichen Queues, Zelle-Matrix Interaktionen und Zell-Zell-Kommunikation. 1 , 2 die Orchestrierung dieser Signale steuert eine Vielzahl von zellulären Reaktionen bei der Wundheilung einschließlich allem Zellmigration. 3 , 4 Zellwanderung ist ein sehr dynamischer Prozess abhängig von zellulären Phänotypen und die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften des extrazellulären Matrix Milieus. 5 Zellen Sonde kontinuierlich ihre extrazellulären Matrix Umwelt durch Integrin-vermittelte Wege; Dieser Prozess ermöglicht Zellen, eine Vielzahl von Matrixeigenschaften einschließlich der Topographie, der Steifigkeit und der Entbindung zu spüren. Zweidimensionale (2D) Analyse der Zellwanderung zeigt, dass die Migration von Lamellipodia Bildung an der Vorderkante durch die Generierung von Aktin-Filament-Bundles angetrieben wird. Nachträgliche Bildung von fokalen Adhäsionen an der Vorderkante, in Kombination mit Actomyosin getrieben Kontraktion ein- und Ausfahren an der Hinterkante treibt die Zelle. 6 dreidimensionale (3D) zelluläre Migration ist derzeit nicht bekannt, jedoch neuere Studien zeigen, dass 3D Migration deutlich anders als die zuvor Mechanismus in 2D beschriebenen und wird wahrscheinlich von alterative Mechanismen gesteuert. Beispiel: neuere Studien von Petrie Et Al. gezeigt, dass je nach den Eigenschaften des ECM, Zellen in 3D Matrizen zwischen Lamellipodium und Lobopodium getrieben Mechanismen der Migration wechseln können. 7 da Zellwanderung ein wesentlicher Bestandteil der Wundheilung Reaktion ist, 3D-Modelle von Zellwanderung sind entscheidend für das Verständnis der physiologischer Reaktionen auf verschiedene Reize bei der Wundheilung. Obwohl Zelle Wanderungsverhalten auf 2D Oberflächen stark variieren von Migration in 3D Matrizen nachgewiesen wurde, nutzen die aktuelle in-vitro- Modelle der Zellwanderung während der Wundheilung, einschließlich der etablierten Scratch Test 2D Monolayer-Kulturen. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 vor kurzem entwickelt Tests eine 3D Matrix verwendet haben, aber noch Kulturzellen in einer Monolage auf der Matrix begrenzt somit die Fähigkeit, wirklich die Dreidimensionalität der Zelle Umwelt rekapitulieren in-vivo. 15
Die hier beschriebene Methode soll Zellwanderung in einem physiologisch relevanten 3D-Modell, anstatt auf eine 2D Oberfläche zu studieren, um ein robuster Verständnis von Migration Antworten verbunden sind mit den angewandten reizen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Zellwanderung innerhalb einer 3D Fibrin-Gerinnsel-Matrix im Beisein von Faktoren, die zu aktivieren oder hemmen Wege Zellwanderung zugeordnet. Für diese Methode durch die kritische Rolle der Fibrin in den frühen Phasen der Wundheilung wurde eine Fibrin-Matrix gewählt; Folgende Verletzungen, ein Fibrin-Gerinnsel entsteht innerhalb der Umgebung der Wunde Blutverlust einzudämmen und dient als Gerüst für die erste Zelle eindringen während der Reparatur von Gewebe und Umbau. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , Darüber hinaus 20 Fibrin wird klinisch als eine chirurgische Dichtungsmittel verwendet und die Zusammensetzung der Dichtstoffe Zellwanderung und ultimative Heilung Ergebnisse gebunden worden ist. Einer früheren Studie von Cox Et Al. Migration von Fibroblasten mit Fibrin Gerinnsel bestehend aus unterschiedlichen Fibrin und Thrombin Konzentrationen zum Zwecke der Optimierung ein Fibrin Dichtungsmittel untersucht. In diesen Studien wurde die Wanderung von Zellen aus Fibrin Gerinnsel auf Plastikschalen quantifiziert. 20 hier präsentieren wir eine Methode, die zur Quantifizierung der Migration von Zellen innerhalb der 3D Fibrin-Umgebung ermöglicht. Während die Methode, die speziell in diesem Protokoll beschriebenen Fibrin verwendet, kann dieses Modell leicht geändert werden, um alternative Matrixmaterialien zu verwenden, wie gewünscht, z. B. Kollagen oder andere 3D Matrizen. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von Fibroblasten Sphäroide in diesem Assay, weil Fibroblasten Migration in das Wundbett für Synthese der extrazellulären Matrix und Gewebe Reparatur/Umbau von höchster Bedeutung ist. Jedoch während der Reparatur sind Prozess Neutrophile die erste Zelle Art in das Wundbett, gefolgt von Makrophagen wandern. Fibroblasten beginnen dann die Wundumgebung ca. 48 Stunden nach der ersten Verletzung zu Beginn der Proliferativen Phase der Wundheilung zu infiltrieren. 19 dieser Assay kann leicht geändert werden, um zählen Neutrophile, Makrophagen oder anderen Zelltypen zu beurteilen, wie Änderungen in Fibrin Gerinnsel Struktur Migration dieser Zelltypen beeinflussen. 21
Um diesen Test zu implementieren, wird zunächst ein Sphäroid Fibroblasten gebildet eine Modifikation der zuvor beschriebenen für Stammzelle-Kultur Techniken. 22 Fibroblasten Sphäroid wird anschließend in einer 3D Fibrin-Matrix übertragen, und Auswuchs kann dann leicht überwacht und über mehrere Tage quantifiziert. Dieses Protokoll berücksichtigt die 3D physiologische Systeme durch das Einbetten von 3D Zelle Sphäroide innerhalb einer Fibrin-Matrix, wodurch die Einschränkungen in Relevanz durch eine mit einer 2D Wachstumsoberfläche eine Zelle Monolage auf Modell Wanderungsverhalten herbeigeführt, zwar noch ermöglicht zur Auswertung der Zelle Verhalten in einer streng kontrollierte in-vitro- Umgebung.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Materials&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM already containing L-glutamine can also be used</td></tr><tr><td>100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Dishes of any size can be used for hanging drop culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Can be replaced with other cell type of interest</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2&#039; needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Syringes of any volume can be used</td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td><td>VWR</td><td>82051-004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB 3</td><td>Can be replaced with matrix protein of interest</td></tr><tr><td>Human Alpha Thrombin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>HT 1002a</td><td>May not be necessary depending on matrix protein of interest</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Equipment&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 cell culture hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope with 10X objective</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

Derzeit die meisten in-vitro- Modelle der Wundheilung, wie etablierte Scratch-Assays, Studium Zelle Migration und Wunde Schließung auf zweidimensionalen Flächen beinhalten. Allerdings ist die physiologische Umgebung welche in Vivo Wundheilung erfolgt dreidimensional als zweidimensionale. Es wird immer deutlicher, dass Zelle Verhalten unterscheidet sich stark in zweidimensionalen vs. dreidimensionale Umgebungen; Daher gibt es eine Notwendigkeit an mehr physiologisch relevanten in-vitro- Modelle für das Studium Zelle Migration Verhaltensweisen in Wundverschluss. Die hier beschriebene Methode ermöglicht das Studium der Zellwanderung in einem dreidimensionalen Modell, das physiologische Bedingungen besser als vorher festgelegten zweidimensionale Scratch Assays widerspiegelt. Dieses Modell soll Zelle Auswuchs über die Prüfung der Zellmigration Weg ein Sphäroid Körper eingebettet innerhalb einer Fibrin-Matrix im Beisein von Pro oder anti migratory Faktoren zu bewerten. Mit dieser Methode Zelle Auswuchs aus dem Sphäroid Körper in einer dreidimensionalen Matrix beobachtet werden und im Laufe der Zeit durch Brightfield Mikroskopie und Analyse von Sphäroid Körperbereich leicht quantifizierbar ist. Die Wirkung von Pro-wandernde oder hemmende Faktoren auf Zellwanderung kann auch in diesem System ausgewertet werden. Diese Methode bietet eine einfache Methode des Analysierens Zellwanderung in dreidimensionale Wunde verbunden Matrizen in-vitro-Forscher, wodurch sich die Relevanz der in-vitro- Studien Zelle vor der Verwendung von in-Vivo -Tier Modelle.

Sphäroid Kultur kann genutzt werden, um die Wirkung der pro und Anti-wandernde Agenten auf Fibroblasten Migration in-vitro-erfolgreich bewerten 3D Fibroblasten Sphäroide können gebildet werden, über hängende Tropfen Kultur über einen Zeitraum von 72 h (Abbildung 1). Im Anschluss an die Kulturdauer Sphäroide innerhalb der Gerinnsel-Matrix eingebettet sind und abgebildet mit Brightfield Mikroskopie (Abbildung 2</s...

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Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Pro und anti migratory Faktoren auf Zellwanderung innerhalb einer dreidimensionalen Fibrin-Matrix bewerten.

Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Research

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Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

7.6K Aufrufe.  North Carolina State University and The University of North Carolina - Chapel Hill. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Pro und anti migratory Faktoren auf Zellwanderung innerhalb einer dreidimensionalen Fibrin-Matrix bewerten.

Serie: Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Forschung

Krebsforschung

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Eine Vorrichtung zur Durchführung Zellmigration / Wundheilung in einer 96-Well-Platte

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Entwicklungsbiologie

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Biotechnik

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Immunologie und Infektion

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Medizin

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biologie

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Scratch Migration Assay und Dorsal Skinfold Kammer für In Vitro und In Vivo Analyse der Wundheilung

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Quantifizierung der dreidimensionalen Zellmigration innerhalb und in granuläre Hydrogel-Biomaterialien

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...