This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

Göç Odaları 1. Hazırlık <ol><li> Karışım kadar karışım ve ısı eridi: Bir parafin / vazelin (1 1) hazırlayın. Bir boya fırçası kullanarak parafin balmumu / petrol peltesi 2-3 katmanları çizmek (1: 1) Şekil 1B-1D uygun olarak cam slayt ortasında karıştırın. NOT: Biz ortak cam slaytlar kullanarak (76 x 26 x 1.0-1.5 mm (G / D / Y)) </li><li> Çizim sırasında katılaşma önlemek için cam slayt hızla eridi parafin / vazelin karışımı uygulayın. Parafin / vazelin tabakası uzunluğu yaklaşık 2-2.5 cm genişliğinde ve 0.3-0.5 cm olduğundan emin olun. Parafin mum / petrol jeli tabakanın kalınlığı yaklaşık 0.1-0.15 cm olmalıdır. </li><li> Katılaşmış parafin / vazelin karışımı bir coverslip ekleyin ve 2-3 katmanları mum / vazelin karışımı parafin (Şekil 1E, 1F) ile kapatın. Ortak bir hücre göçü deneyi için 4-8 geçiş odaları kullanın. Yer göç odaları iBir rafa dik bir pozisyon n tane. </li></ol> Kolajen Süspansiyon Hücre Mix 2. Hazırlık <ol><li> Hasat (örneğin,% 0.25 tripsin / EDTA) ve ilgili hücreleri sayın. Tam fetal buzağı serumu (FCS) içeren ortama, antibiyotikler hücrelerin tekrar ve ek önerilir. 4-8 1.5 ml&#39;lik tepkime tüpleri ve 4-6 x 10 4 hücreleri (hücre toplam sayısı, analiz edilecek hücre türüne göre değişir) ihtiva eden 20 ul hücre süspansiyonu hazırlamak ve tam ortam maddesi ile 50 ul&#39;ye kadar doldurun. Not: ek bileşikler (örneğin, büyüme faktörleri, kemokinler, inhibitörleri, vs), hücre süspansiyonu ilave edilir. Hücre süspansiyonunun nihai hacim 50 ul aşmayacak şekilde uygun bir stok solüsyonları kullanın. </li><li> Dört hücre göçü deneyleri için 452 ul nihai kollajen süspansiyonun toplam miktar hazırlayın. 50 ul 10x MEM (pH 5,1-5,5) ve% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 27 ul (pH 9,0-9,5 ekleme), 1.5 ml&#39;lik tepkime tüpüne ve iyice karıştırın. Yoğun mor (pH 9.0-9.5) sarı-turuncu çözüm renk dönüşü gözlemleyin. 10x MEM / sodyum bikarbonat solüsyonuna 375 ul sıvı kollajen süspansiyonu ekleyin ve iyice karıştırın. Nihai kollajen süspansiyonun pH değeri yaklaşık 7.5 olmalıdır (açık mor bir renk ile belirtilir). NOT:% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi ile pH değeri kontrol edilir. PH, yaklaşık 7.5 bir yerde bir kuluçka makinesi içinde bir açık kapağa sodyum bikarbonat çözeltisi ise (37 ° C,% 5 CO2) CO2 ile doyurulmuş ve pH (yaklaşık 9,0-9,5) yükseltmek için. Kollajen hücre süspansiyon karışımı pH kolajen ağının istikrarı için çok önemlidir. Eğer çok düşük ise, kollajen kafes hücre göçü deneyi sırasında çökecektir. NOT: Bu protokol için, sığır Arkadan gelen sıvı kolajen (pH 1.9-2.2) kullanın (2.9-3.3 mg / ml kollajen,% 95 kollajen tip I,% 5 kollajen tip IV). Kullanılarak daha fazla kolajen kafes hazırlık protokolleri örnekleriBöyle domuz ya da sıçan gibi diğer kaynaklardan kollajen tip I, 32,33 verilmiştir. Bu 1.67 mg / ml kafesinin nihai kollajen konsantrasyonunu değiştirmek gibi kullanılan çözeltilerin hacimleri değiştirmez. Daha yüksek ya da daha düşük yoğunluğu kolajen, kolajen liflerinin yoğunluğu ve hücrelerin göç davranışları 34 ile birlikte bunların arasındaki ortalama mesafe üzerinde bir etkisi vardır. </li><li> 50 ul hücre süspansiyonu nihai kollajen süspansiyonu 100 ul ve thoroughly.The son kollajen süspansiyonu (1,67 mg / ml kolajen) karışımı hafif ağdalıdır. Doğru miktarda (100 ul) aktarmak için, hücre süspansiyonu aktarmadan önce bir kez yukarı ve aşağı nihai kollajen çözüm pipetle. Not: kolajen hücre süspansiyon karışımı, pH değeri 7.5 olarak değiştirildi 10x MEM / sodyum bikarbonat çözeltisi ile bir araya sonra kolajen lifleri hemen polimerize başlar. </li><li> Th nihai kollajen süspansiyon hücre karışımı aktarıngöç odalarına e reaksiyon tüpleri. Hafifçe eşit geçiş odası (Şekil 1 H) alt kollajen hücre süspansiyon karışımı dağıtmak için geçiş bölmesinin dokunun. Rafa dik bir konumda geçiş odaları yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika inkübe edilir (37 ° C,% 5 CO2) kolajen liflerinin polimerleşmesine izin vermek. </li><li> Polimerize kollajen kafes biraz bulanık ama hala açık mor renk olan dikkat edin. Ilgi takviyeleri ile, tam bir ortamda veya tam ortam ile geçiş odaları kadar doldurun ve parafin balmumu / vazelin karışımı (Şekil 1 i, 1 i) ile geçiş bölmesini sızdırmaz. </li></ol> 3. Kayıt ve Hücre Göç Analizi Bu bölüm, manuel hücre takibi ile zaman atlamalı görüntü mikroskopi ve hücre göçü analizi ile hücre göçü kaydı tanımlamaktadır. <ol><li> Mikroskop ve mikroskop sahne Västergötland açınter. 37 ° C sıcaklık ayarlayın. 10X objektif kullanın. Mikroskop altında geçiş bölmesi yerleştirin ve görüş alanı, yaklaşık 50 ya da daha fazla hücre odaklanır. </li><li> Bir çok kamera video izleme yazılımı uygulamasını kullanarak time-lapse modunda kaydedin hücre göçü. Örneğin, uygun bir formatta hücre göçü film kaydet, &quot;* .avi&quot; veya &quot;* .mov&quot;. Böyle hücre tipine ve deney şartları, destekleyici bilgileri içeren bir veritabanı hücre göçü film dosyalarını bağlayın. NOT: time-lapse 0.75 sn gerçek zamanlı olarak 1 dakika eşit olduğu anlamına gelir 1:80 bir time-lapse faktörü kullanarak kadar 2 saat boyunca lenfositler ve HSPCs kaydediyor. Tümör hücreleri, yavaş hareket eden hücreler ve bu nedenle 1 bir zaman atlamalı faktörü kullanılarak, en az 16 saat boyunca kaydedilir: 1.800 (hızlandırılmış 0.5 sn gerçek zamanlı olarak 15 dakika eşittir). </li><li> ImageJ yazılım eklentileri gibi uygun bir hücre izleme yazılımı uygulamasını kullanarak hücre göçü film Analiz(Genel 18&#39;de verilmiştir). Tarafsız bir analiz için hücrelerin aktif ya da değil, göçmen olup olmadığını hücreleri rastgele bilgisi olmadan seçilmiş olacağı önem taşımaktadır. NOT: Biz manuel (çekirdeğine yerleştirilmiş) fare imleci ile doğru hareket hücrelerini takip ederek deney başına en az 30 hücre yollarını izlemek için kendi geliştirdiği yazılım uygulamasını kullanıyor. Takip ederken, izlenen hücrelerin xy koordinatları otomatik olarak kullanılan time-lapse moduna göre belirlenmektedir. Tümör hücreleri için xy-koordinatları (15 dk gerçek zamanlı eşit) her 0.5 saniyede tespit edilir ise lenfositlerin / HSPCs xy-koordinatları, (1 dk gerçek zamanlı eşit) her 0.75 sn belirlenir. </li><li> Tipik bir hücre göçü deney için hücre başına 60 xy-koordinatlarının toplam belirleyin. Bu tümör hücreleri için lenfositler / HSPCs ve 15 saat için gerçek zaman 1 saat gerçek zamana eşittir. A &quot;,&quot; hücre tw arasında taşınamaz olduğunu gösteriro zaman noktaları, bir &quot;sayısal değer&quot; ise &quot;piksel&quot; hücre 2 zaman noktalarında (Şekil 2A) arasında taşındı yılında mesafeyi gösterir. NOT: Manuel hücre izleme deneyimi gerektirir. Özellikle hızlı göç edici hücrelerin izlemek için zor olan ve her hücre tipi sergi takviye faktörler tarafından tetiklenebilir belirgin bir göç davranışları. Izleme sırasında hücre bölünmesi durumunda, rastgele izleme devam için bir kızı hücre seçin. Görüş alanının dışına göç veya izleme ihmal değil iken ölmek, ama analiz için kabul edilir Hücreler. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Örneğin uygun bir yazılım uygulaması, bir elektronik tablo programı kullanılarak hücre izleme verilerini analiz edin. <ol><li> Bir öz-tasarlanmış elektronik tablo şablonu içine ham verileri (Şekil 2A) izleme hücreyi, kopyalayarak hücre izleme verilerini analiz edin. Temsil eden, &quot;sayısal değerleri&quot; toplamı çarpıntoplam mesafe bir hücre &quot;um&quot; içine &quot;piksel&quot; dönüştürmek için bir düzeltme faktörü ile göç etti. </li><li> İki hücre göçü parametrelerini belirlemek: ve aktif hareket (Şekil 2C, 2D) zamanında (göç hızına eşdeğerdir) lokomotor aktivite. </li><li> Hareketsiz hücreleri (yanlış-pozitif hücrelerin sayısını azaltmak için eşik değeri) 25 um den daha az göç eden hücrelerin belirlenmesi. &quot;,&quot; Ile bu hücrelerin &quot;sayısal değerlerini&quot; değiştirin. NOT: parametre &quot;lokomotor aktivite&quot; (ya da göç oranı) iki kez puan (Şekil 2B) arasındaki taşındı izlenen hücre popülasyonunun hücrelerinin yüzdesini temsil eder. Bir &quot;sayı&quot; &quot;,&quot; ise, hareket eden bir hücre olarak tanımlanan bir hareketsiz hücre olarak tanımlanmıştır. Parametre &quot;aktif hareket zamanı&quot; (zaman aktif) bir hücre yeniden göç etti toplam süre yüzdesini temsilgözlem dönemi (Şekil 2C) zaman dilimine Lation. Bir &quot;sayısal değer&quot; &quot;,&quot; bir hücre hareket değil belirtirken, bir hücre, hareket ettiğini gösterir. Bu parametre, daha fazla hareket değil hücrelerin sayısını belirlemek için kullanılır. </li></ol></li><li> Istatistiksel olarak anlamlı ve ekran hücre göç verileri hesaplayın. <ol><li> Mann-Whitney U testi kullanılarak hücreler (göç oranı) ortalama lokomotor aktivite istatistiksel olarak anlamlı hesaplayın. P-değeri &lt;anlamlı olarak 0.05 düşünün. </li><li> Xy-diyagramı, Boxplot diyagram, ya da bir çubuk grafik diyagram olarak hücrelerin ortalama lokomotor aktivitesini gösterir. Bir çubuk grafik diyagram veya bir histogram gibi aktif hareket veya hız saati gibi tek bir hücre tabanlı veri, görüntüleme. NOT: seçilen tablosu programı uygulaması Boxplot grafik veya çubuk grafik grafik aracı içermiyorsa bir online arama uygun TU arıyor için yapılmalıdırtorials. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Göç yeteneği tümör hücrelerinin 4 bir özelliğidir. Primer tümörün ayırmak ve neredeyse tüm kanser hastalarının ölüm ana nedeni olan ikincil lezyonlar, tohum mümkün olmayacaktır çevreleyen bağ dokusu tümör hücrelerine yoluyla göç yeteneği olmadan. Çünkü bu ilişkinin pek çok çalışma kanser hücresi göçü üzerinde duruluyor. Bu çalışmaların amacı, verimli bir şekilde ve böylece zarar veya metastaz oluşumu yavaşlatan, tümör hücresi göçünü bloke yeni hedef mol...

Hücre füzyonu (genel bir bakış için bakınız 1,2) Hücre göçü, embriyonik gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık (inceleme için 3 bakınız) dahil olmak üzere, fizyolojik süreçlerin bir bolluk katılır başka bir biyolojik fenomen gibi. Ancak, göç yeteneği tümör hücreleri (inceleme için 3,4 bakınız) metastaz için bir önkoşul da. Hücre göçü, bir kompleksi, çeşitli ligand (örneğin, sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri, hormonlar, hücre dışı matris bileşenleri) reseptör (örneğin, reseptör tirozin kinazlar tarafından başlatılan çeşitli sinyal transdüksiyon yollarının etkileşimiyle yönlendirilir henüz tam olarak anlaşılmamıştır süreçtir sonuçta de- ve fokal yapışma kompleksleri tekrar takılmasıyla ile aktin hücre iskeleti eşlik eden yeniden yapılanmasını neden kemokin reseptörleri, integrinleri) etkileşimler 5 6 sinyalizasyon integrin&#39;in-aracılı. in vitro ve in vivo çeşitli hücre göç deneyleri, hücre göçü analiz etmek tahlil 8-10, üç boyutlu (şifa Boyden odası / Transwell tahlilinde 7, çizilmeye tahlil / yara dahil, geçmiş yıllarda geliştirilmiştir 3D) kollajen matris, göç deneyi 11 yanı sıra, intravital görüntüleme / mikroskop (inceleme için 12 bakınız). Bu hücre göç deneyleri her artılarını ve eksilerini, örneğin, ilgili maliyetleri ve ekipman ihtiyacını, taşıma veya elde edilen verilerin güvenilirliği vardır. Boyden odasının / Transwell deneyi ve çizik deney / yara iyileşme testi, hem de in vitro 7-10 hücre migrasyonun ölçülmesi için kullanımı kolay, düşük maliyetli ve gelişmiş tahliller bulunmaktadır. Olarak adlandırılan üst bölmeye 7 - Boyden odasının içinde / Transwell hücre tahlili bir uç ihtiva eden gözenek (yaklaşık 8 um çapında) üzerine ekilir. İsteğe bağlı, uç hücre dışı m ile kaplanabilirAtrix parçalar, örneğin, fibronektin, kolajen, vb daha fizyolojik ortamı taklit etmek. Benzer şekilde, endotelyal hücreler, bu şekilde bir endotelyal hücre engeli 13 taklit eden, parçanın üstüne yetiştirilebileceğini. Bu gibi büyüme faktörlerinin ve kemokinlerin medya ve takviyeleri, barındırılması alt bölmeye tanımlanan bir zaman aralığı boyunca gözeneklerin içinden geçen bu hücreler, hücre göçü (veya ekstravazasyon) ölçmek için bir okuma olarak kullanılmaktadır. Sıfırdan deneyde / yara iyileşmesi analiz, hangi hücrelerin plakalara ekilir ve ortak akışkanlığa gelinceye kadar büyütülür 10. Deney plakaları ayar bağlı olarak örneğin fibronektin gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin, önceden kaplanmış olabilir. Sıfırdan her tarafında hücre tek tek hücreleri kazıyarak yara çizik / oluşturduktan sonra / yara böylelikle 10 şifa / dolum, boşluğa geçirebilirsiniz. Sıfırdan / yaraların iki tarafı arasındaki mesafe belirlenirzaman bağlı olarak ve hücreler 10 göç aktivitesi için bir okuma olarak kullanılır. Ancak, time-lapse video mikroskopi ve tek hücre 10 izleme ile tahlil birleştirmek için tavsiye edilir ve hücre göçü (ayrıca çizik / yaranın dolum / iyileşmeye neden olabilir), hücre çoğalması arasındaki ayrımcılık. Ancak, Boyden odası / Transwell tahlil ve iyileşmesi deneyini çizik tahlil / yara, hem fizyolojik bir benzeri hücresel çevre ile ilgili oldukça kusurlu. Boyden odasının içinde / Transwell hücre tahlili sıfırdan deney hücreleri iyileştirme deneyi / yara, iki boyutlu bir önceden kaplanmış plastik bir levha üzerine ekilir ise, plastik bir gözenekten geçiş gerekir. Aynı şekilde, iyi göç davranışı iki boyutlu ve 3 boyutlu bir ortamda 3 arasında belirgin farklılık olduğu kabul edilmektedir. Örneğin, fibroblastlar üç boyutlu matris adezyonlar ile karakterize edici özelliği, iki fokal ve fibriler adezyonlardan farklıdırα5β1 ve αvβ3 integrinler, paxillin, diğer hücre iskeleti bileşenleri ve fokal yapışma kinaz 14 tirosin fosforilasyonu içindeki yoğunluğu boyutlu takım alt-tabakalar. Aynı şekilde, bir 3D ortamı içinde gömülü hücreler de değişmiş bir göç davranışı 15 görüntülenir. Böylece, daha doğru bir şekilde hücre göçünü analiz etmek için göç deneyi 3B, fizyolojik veya fizyolojik gibi bir ortam içinde tek hücre göçünü ölçmek için izin önerilir. İntravital görüntüleme / mikroskop 3D fizyolojik bağlamında hücre göçü ölçmek için altın standarttır. Bu şimdiye kadar sadece nedeniyle mümkün olduğu, ancak, aynı zamanda, lenf düğümü 17, 16 ya da içindeki ekstravazasyon lenfosit ticaretinde tümör hücreleri ve endotelyal hücreler gibi farklı hücre tipleri arasında etkileşimler, hücre dışı matris-hücre etkileşimlerinin ait değil örneğin 2-foton şeklinde geliştirilmiş bir floresan mikroskopi teknikleri,konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan proteinleri sentezleyen türevleri 12,16,17 hayati floresan boyalar ve transgenik fare suşlarının kullanılması. Buna ek olarak, intravital görüntüleme / mikroskop indirin otomatik hücre 18 izlemek için birleştirilebilir. Bununla birlikte, bir 2-foton odaklı lazer tarama mikroskobu ihtiyacı hem de hayvanlarda (ve uygun transjenik hayvan modellerinde) intravital görüntüleme / mikroskop oldukça maliyet-yoğun bir yöntemdir. Boyden odası / Transwell tahlili ve çizik tahlil / yara iyileştirici testin sınırlamaları aşmak ve 3D kollajen matris göç deneyi 11,19 geliştirilen bir 3D ortamında farklı hücre tiplerinin göç analiz etmek. Böylece, göç edici hücrelerin 3B kolajen lif şebekesi, in vivo olarak daha fazla benzeyen, bir durum içinde gömülürler. Müştereken, time-lapse video mikroskopi gerçek hücre göçü nedeniyle saptamaya olanak ölçülürBirkaç göç parametreler yanı sıra yanlısı göçmen faktörler veya inhibitörleri tepki olarak kendi değişikliklerin ulus. Çeşitli hücre tipleri lenfosit ve lökositlerin 11,20, hematopoietik sap / 21-24 progenitör hücreleri ve tümör hücreleri dahil olmak üzere bu 5,25-29 teknik kullanılarak analiz edilebilir. Tek hücre yanı sıra, aynı zamanda, hücre kümeleri veya sferoidler 30,31 kafes kalojee Zigotun / sfero ikinci tek hücrelerin göç analizi ile kollajen matris, eşlik eden gömülü olabilir. In vivo durumu yakın sonuçlar veren bir in vitro yöntemle - Bu protokol, 3D ortamında farklı hücre tiplerinin göç davranışlarını analiz etmek için basit, ama güçlü tekniği hakkında genel bir bakış sunmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

Göç etme yeteneği, çeşitli hücre tiplerinin ayırt edici bir özelliği olup, embriyonik gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Fakat, hücre göçü aynı zamanda yayılma metastatik başlatmak için primer tümörün ayırmak için, bu kanser hücrelerini etkinleştirerek kanserinde önemli bir mekanizmadır. Geçen yıllar içinde çeşitli hücre göçü deneyler, farklı hücre tiplerinin göç davranışlarını analiz için geliştirilmiştir. Hücrelerin lokomotor davranışı belirgin bir iki boyutlu (2D) arasında değişmektedir ve üç boyutlu (3D) ortamında 3 boyutlu bir ortamda gömülü olan hücrelerin göç analizi daha önemli hücre göçü olarak verim olacağını kabul edilebilir, çünkü Veri. Tarif edilen 3D kollajen matris, göç deneyi avantajı hücreler, hücre dışı matrisin başlıca bileşenini temsil eden kolajen liflerinin ve fizyolojik bir 3 boyutlu bir ağ içinde gömülü olmasıdır. Nedeniylezaman atlamalı görüntü mikroskopi gerçek Hücre göçü, ön-göç faktörleri veya inhibitörlerine tepki olarak çeşitli geçiş parametrelerine ve bunların değişikliklerinin tespitine imkan ölçülür. Çeşitli hücre tipleri hücreleri ve tümör hücreleri, lenfositler / lökositler de dahil olmak üzere, bu teknik kullanılarak kök incelenebilir. Benzer şekilde, aynı zamanda hücre kümeleri veya sferoidler kolajen kafes içine hücre kümesi / sfero ikinci tek hücrelerin göç analizi ile kollajen matris, eşlik eden gömülü olabilir. Biz 3D kollajen matris göç deneyi fizyolojik-benzeri 3D ortamında hücrelerin göçünü analiz için çok yönlü bir yöntem olduğu sonucuna varıldı.

Zaman atlamalı video mikroskobu ve bilgisayar destekli izleme hücre ile birlikte, kullanılan 3D-kollajen matris, göç deneyi popülasyon bazlı parametre (örneğin, lokomotor aktivitesi ortalama) dahil olmak üzere çeşitli hücre göçü parametreleri ve tek bir hücre bazlı parametrelerinin belirlenmesine izin verir (örneğin, aktif hareket, hız, mesafe zaman göç). Elde edilen hücre izleme veri setleri, veri işleme ve veri sunumu bir örneği Şekil 2&#39;de verilmektedi...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

analysis-of-cell-migration-within-a-three-dimensional-collagen-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.5K Görüntüleme.  Witten/Herdecke University.  Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır. 

Video: Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

İletken Mürekkepler düzlemsel ve Üç Boyutlu Baskı

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Biyomühendislik

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper composition, targeted modulus, and well-defined architectural features. Biomaterials that recapitulate the intrinsic architecture of in vivo tissue are vital for studying diseases as well as to facilitate the regeneration of lost and malformed soft tissue. A novel biofabrication technique was developed which combines state of the art imaging, three-dimensional (3D) printing, and selective enzymatic activity to create a new generation of biomaterials for research and clinical application. The developed material, Bovine Serum Albumin rubber, is reaction injected into a mold that upholds specific geometrical features. This sacrificial material allows the adequate transfer of architectural features to a natural scaffold material. The prototype consists of a 3D collagen scaffold with 4 and 3 mm channels that represent a branched architecture. This paper emphasizes the use of this biofabrication technique for the generation of natural constructs. This protocol utilizes a computer-aided software (CAD) to manufacture a solid mold which will be reaction injected with BSA rubber followed by the enzymatic digestion of the rubber, leaving its architectural features within the scaffold material.

An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

Üç boyutlu Biyomimetik Teknoloji: Roman Biorubber Kollajen Hidrojeller içinde Mikro ve Makro ölçekli Mimarileri Tanımlı oluşturur

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Hazırlama ve Analizler<em&gt; İn Vitro</em&gt; Üç Boyutlu Meme Kanseri Suretler

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.