Yazarlar, uzman teknik yardım Keali Röhm, Louisa Frieß ve Heike Menzel için minnettarız; Helga Brünner hayvan bakımı için için; ve Chistopher S. Ward için üretim ve dağıtım ImageJ yazılım için optik disector kılavuz eklentisi için.

bakım ve hayvanların kullanımı için ilgili tüm uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergeleri takip edildi. Protokol Regierung von Unterfranken Wuerzburg, Almanya itibariyle yerel yetkililer tarafından kabul edildi.
 1. doku işleme ve immünhistokimya <ol><li>Euthanize fareler CO 2 veya başka herhangi bir onaylanmış yöntemi.</li>
	70 mL 0.1 M PBS %4 paraformaldehyde (PFA) tarafından takip <li>Perfuse altı 12 haftalık C56Bl/6N erkek fare transcardially ile 25-G iğne ve bir infüzyon pompa kullanarak 0.1 M fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 10 mL. 
	Uyarı: İngiltere'de yılın, alerjik, zehirli ve kanserojen.</li>
	<li>Bir beyin matris dilimleyici bölgesinin +0.74 mm Bregma (şekil 25, Paxinos ve Franklin fare beyin atlas 14) üzerinden, koronal düzlemde fare beynini incelememize.</li>
	<li>SN, %4 oranında dahil beyin, dorsal parçası koymak daldırma-fiksasyon için 4 ° C'de 1 d 0.1 M PBS PFA.</li>
	<li>PFA cryo-koruma için % 30 Sükroz/0,1 mol PBS çözüm için döviz ve için başka bir 2 d 4'te kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Bir cryomold beynine dorsal parçası dolu en uygun kesme sıcaklık (OCT) ile yerine bileşik ve yavaş yavaş sıvı kuru buz-serin isopentane doku dondurmak. 
	Uyarı: Kuru buz son derece soğuk (-78 ° C); Kuru buz ile çalışırken eldiven, dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (PPE), kullanın. Kuru buz CO 2 ' buharlaşır; Bu nedenle, bir duman başlık altında çalışmak.</li>
	<li>Seri olarak 30 µm cryo-bölümler koronal düzlemde kesmek ve 2,46 mm Bregma (şekil 51, Paxinos ve Franklin fare beyin atlas 14) arasında başlayan ve Bregma 4,04 mm'den at bitiş bölümleri toplamak (şekil 64, Paxinos ve Franklin fare beyin atlas 14).</li>
	<li>Dört serisi cryoprotectant (% 30 gliserol, %30 ethoxyethanol ve % 40 PBS)-20 ° C'de dolu tüpler saklayın Beyin sapı üst bölgeye küçük bir delik delme tarafından sağ hemisfer parça işlem sırasında işaretlemek.</li>
	<li>İmmunohistokimyasal boyama için fare başına bölümleri bir dizi seçin. Preincubate serbest yüzer bölümleri için 1 h % 10 normal keçi Serumda (0,1 mol bir shaker PBS NGS)/2% BSA/0.5% deterjan. Gece 4'te % 2 NGS/2% BSA/0.5% deterjan 0,1 mol PBS içinde seyreltilmiş tavşan Anti-fare tirozin hidroksilaz (TH; 1:1,000 seyreltme) antikor ile bölümleri kuluçkaya ° C.</li>
	Tavşan karşı <li>Uygula ikincil antikor IGS (1: 100 seyreltme) oda sıcaklığında 2 h için avidin/biotin reaktif (1: 100 seyreltme) tarafından takip ettim. Kuluçkaya ve 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) ve H 2 O 2 ile leke. Bölümleri kaplamalı nesne slaytlarda boyama sonra mount. 
	Not: TH + dopaminerjik SN nöronlar Şekil 1a ile gösterilir. Bir seri boyama tarafından ortalama 13 SN kesitler rostral SN pars compacta (SNpc) ve reticulata, Kaudal kısımları uzanan, lekeli hayvan ( Şekil 1b). Bölümleri 120 µm (1/4 serisi) tarafından ayrılır ( şekil 1 c). 
	Uyarı: DAB şüpheli bir kanserojen olduğu. İletişim ve inhalasyon tarafından zehirlidir. DAB ile çalışırken KKE kullanın.</li>
</ol> 2. Görüntüleri edinimi <ol><li>TH yakalamak immunohistochemically lekeli dijital mikroskop için birleştiğinde düşsel bilgisayar yazılımı kullanma SN bölümlerine. Bir dizi her bölümü ayrı ayrı analiz.</li>
	<li>Düşsel bilgisayar yazılımı inceden inceye gözden geçirmek Slayt seçeneğini kullanın. Yüksek-nitelik imge (Şekil 2) için TIFF biçiminde kaydetme. 
	Not: Görüntü çözümlemesidir 312 piksel / cm.</li>
	<li>Basın &#34; al &#34; (şekil 2a) edinme penceresini açmak için.</li>
	<li>Ayarla binning &#34; 2 &#34; gri tonlamalı görüntüler için. 
	Not: Renkli resimlerin yerine gri tonlamalı görüntüleri edinimi son yığın görüntü dosyası (şekil 2a) küçültür.</li>
	<li>Tıklayın &#34; göstermek yaşamak &#34; bölümünün canlı görüntü gösteren yeni bir pencere açmak için edinme pencerede (Şekil 2 bir ve b).</li>
	<li>Tıklayın &#34; sahne &#34; edinme penceresinde. Seçin &#34; tarama slayt &#34; açılır menü ve onay kutusu (Şekil 2 c). 
	Not: Bu satın alma ve son derece büyütülmüş SN görüntüleri (630 X büyütme) x, y-uçak gibi üst üste görüntüleri düzlemde z-13 µ toplam aralığını kapsayan, 1 µm arasındaki mesafe ile yığın görüntüleri edinimi hizalamasını sağlar m.</li> <li>SN için aramak için 2.5 X hedefi seçin.</li>
	<li>63 amacı değiştirmek</li>
	<li>Yanında tıkırtı üstünde sol üst köşesinde (TopLeft) (Şekil 2 c) ve sağ alt köşesinde (LowRight) (şekil 2B) bölümü tanımlar &#34; kümesi. &#34;</li>
	<li>Tıklayın &#34; Z-serisi &#34; ve kontrol &#34; Z-uçak serisi &#34; kutusu (şekil 2e).</li>
	<li>Belirleme gerçek takılı kalınlığı üç rasgele seçilen sayma, bölümlerin siteleri görüntüleme yazılımı kullanarak bölüm başına. Bunun için tıklayın &#34; görünümü üst kayan &#34; (şekil 2e) bölümünün üst tanımlamak ve o zaman tıkırtı üstünde &#34; durdurmak görünümü üst &#34; (şekil 2f). Bundan sonra tıklayın &#34; görünümü alt ofset &#34; (şekil 2f) ve o zaman tıkırtı üstünde &#34; durdurmak görünümü alt &#34; (Resim 2 g). Bölüm kalınlığı yazmak.</li>
	<li>Baştan çıkarma 3 µm (guard zone) ofset ve sonuç en iyi mahsup yuvaya (Şekil 2 h) yazın. 13 µm (optik disector yüksekliği) üst mahsup numaradan çıkarma ve sonucu alt mahsup yuvasına (şekil 2i) yazın. Aşağıdaki parametreleri seçin: adımlar, 14; Boyut, 1.00 (şekil 2i). 
	Not: Bu ardışık görüntüler arasında 1 µm mesafe ile 13 µm, z-bir düzlemde bir kalınlığı karşılık gelir.</li>
	<li>(Şekil 2j) dosyayı kaydetmek istediğiniz dizini seçin.</li>
	<li>Tıklayın &#34; sıra &#34; edinme (şekil 2j) başlatmak için.</li>
	<li>Tıklayın &#34; işleme &#34; ve aşağıdaki parametreleri seçin: &#34; tüm uçaklar, &#34; üzerinden &#34; sıra; &#34; &#34; montaj; &#34; ve &#34; hızlı &#34; ve &#34; dikiş &#34; kutuları, resim örtüşen % 10 (Şekil 2 k). Yanında tıkırtı üstünde belgili tanımlık imge dikiş başlamak &#34; başlatmak &#34;. 
	Not: Bu analiz için yığın görüntü oluşturur (Şekil 2 l, şekil 3a -e).</li>
</ol> 3. Stereological değerlendirme sırasını <ol><li>SN yığını görüntüleri NIH ImageJ yazılım sürümü 4.7 kullanarak Çözümlemeyi gerçekleştirmek.</li>
	<li>ImageJ.nih.gov web sitesinden gerekli olan iki eklentileri download: &#34; kılavuz yerleşimi &#34; eklenti 15 ve &#34; hücre Counter &#34; eklenti 16. Her iki eklentileri bölümünde açıklandığı gibi yükleyin.</li>
	<li>Tarafsız stereological değerlendirmesi için sayım parametreleri aşağıdaki gibi tanımlayın: ızgara boyutunu, 130 x 130 µm; sayım çerçeve, 50 x 50 µm; ve optik disector yükseklik, 13 ve #181; m.</li>
	<li>Açık görüntü yanında tıkırtı üstünde &#34; dosya &#34; &#8594; &#34; açık &#34; (şekil 4a) kullanarak görüntü ölçeği ayarlayın &#34; analiz &#34; &#8594; &#34; ölçeği ayarla &#34; komut (şekil 4b). Bu adımda, tanımlı boyutunu piksel uzakta µm (şekil 4 c) değiştirmek. 
	Not: analiz görüntülerde 425 piksel karşılık gelen için 100 µm.</li>
	<li>Select &#34; eklentileri &#34; &#8594; &#34; kılavuz &#34; &#8594; &#34; ızgara türü: satır &#34; rasgele bir kılavuz eklemek için komut. Kontrol &#34; rasgele ofset &#34; kutusu. 130 µm x 130 µm kılavuz (kılavuz-kare) içinde bir kare boyutunu define = 16.900 µm 2 (şekil 3b ve şekil 4 d ve e).</li>
	<li>Değiştir resim türü üzerinden 16-bit RGB renk için (tıklayın &#34; resim &#34; &#8594; &#34; türü &#34; &#8594; &#34; RGB renk &#34;) (şekil 4f). Baquet vd tarafından açıklandığı gibi SNpc bulun 17. SNpc ile çembere &#34; Boya Fırçası aracını &#34; (fırça genişliği: 11) ( şekil 3 c ve şekil 4 g -ı).</li>
	<li>Geri alma &#34; ölçeği ayarla &#34; komutunu tıklatarak &#34; analiz &#34; &#8594; &#34; ölçeği ayarla &#34; &#8594; &#34;'ı tıklatın Kaldır Ölçekle &#34; (şekil 4j -l) piksel hesaplamalarda performansını oldukça etkinleştirmek için µm daha.</li>
	<li>Bir ekran görüntüsü (şekil 4 m) yapmak, kurtarmak imge eğe ve ImageJ (şekil 4n) ile yeni bir dosya açın. Seçin &#34; noktası &#34; (şekil 4o) ve fırça genişliği 25 (şekil 4 p). Her kılavuz-kare için bir optik disector (şekil 4q) yerleşimini SN o kartvizitleri iþaretleyin. Tam yerelleştirilmiş tüm optik disectors veya kısmen Seviyelendirilmiş SN içinde cep numarasını analizini gerçekleştirmek.</li>
	<li>SN bölümlerini içeren bir kılavuz-kare seçin. Bu kare x ve y tanımlamak için ImageJ içindeki imleç ile sol üst köşesinde koordinatları (4r rakam ile) başlatmak için ölçü. 
	Not: Koordinatları kullanarak konumlandırma optik disector için eklenir &#34; optik disector konumu &#34; (Adım 4'te açıklandığı gibi şekil 4'ler),.</li>
	<li>Optik disector pozisyon başlıklı elektronik tablo şablonu kullanarak hesaplama &#34; optik disector pozisyon, &#34; adım 4'te açıklandığı gibi.</li>
	<li>Kalibre optik disector (Christopher S. Ward, Ek dosya tarafından yazıldı makro) yanında tıkırtı üstünde &#34; eklentileri &#34; &#8594; &#34; makroları &#34; &#8594; &#34; düzenleme &#34; (şekil 4t), açık &#34; opt_dis_ Grid.txt &#34; dosya (4u rakam) ve boyutunu define &#34; usergrid &#34; x ile y boyut-in görme duyusuyla ilgili disector (şekil 4v) karşılık gelen piksel cinsinden. Usergrid bir tarafı boyutunu 212.5 piksel (50 x 4.25 piksel) tanımlanan 50 µm x 50 µm, boyutunu seçin.</li>
	<li>Optik disector (şekil 4v) ortasına tanımlayan ImageX ve ImageY koordinat ekleyerek yığın görüntü optik disector konumunu belirleyin. Makroyu çalıştırmak (&#34; makroları &#34; &#8594; &#34; Makro Çalıştır &#34;) (şekil 4w). 
	Not: Kılavuz ( 3d şekil ve 4 x rakam) yığın görüntüden kaybolur olacaktır. Optik disector z-düzlemde ( 3e anlamaya ve 4 x rakam) taşırken devam edecek.</li>
	<li>Select &#34; eklentileri &#34; &#8594; &#34; hücre Counter &#34; hücre sayaç eklentisi (şekil 4y) başlatmak için. Hücre Sayacı başlatmak ve bir işaret türü (şekil 4z) seçin. Resmi yakınlaştırmak (tıklayın &#34; + &#34;) ve % 200 bir büyütmede hücre sayıları stereological değerlendirmesi gerçekleştir.</li>
	<li>Tespit dopaminerjik nöron perikarya onların yuvarlak veya oval şekil ve hücre boyutuna göre ( Şekil 1a). Stereological kuralları kullanarak hücre sayısını ölçmek. 
	Not: optik disector 3 boyutlu küp ( şekil 5a) olduğundan, dışlama taraf olarak ön, sol ve küp (kırmızı) üst kenarlarında tanımlayın. Bu nedenle, don &#39; t sayısı TH + hücreleri (sağ ve sol açık) kırmızı çizgi ya da üst yan temas geliyor. Hücre sayımları sonuçlarını başlıklı hazırlanmış elektronik tablo dosyasına ekleyin &#34; hücre sayısı hesaplanması &#34; (5. adım).</li>
	<li>Göre SN resmi, sonraki kılavuz-kare sonraki hücre sayısı için optik disector yerleştirileceği hesaplamak kullanarak x, y adımlar örten kılavuz ( şekil 5b) boyutunu ve &#34; optik disector pozisyon &#34; elektronik tablo şablonu, adım 4'te açıklandığı gibi.</li>
	<li>Kullanarak hücre bir tahmini gerçekleştirmek &#34; hücre sayısı hesaplanması &#34; elektronik tablo (5. adım).</li>
</ol> 4. Optik Disector konumunu kullanarak hesaplama &#34; optik Disector konumu &#34; elektronik tablo şablonu <ol><li>hesaplamak, boyutunu ve konumunu SN (anahat içinde örten kılavuz içine yerleştirilmesini optik her disector şekil 5b) kullanarak &#34; optik disector position.xlsx &#34; elektronik tablo dosyası (Ek dosya).</li>
	<li>Ekle µm, her piksel için dönüşüm tarafından tanımlanan &#34; ölçeği ayarla &#34; komutu, sarı işaretli konumlarını içine &#34; optik disector position.xlsx &#34; dosya ( şekil 6a ve ek dosya ).</li>
	<li>INSERT optik disector planlanan boyutunu ve kılavuz-kare (µm), bir tarafta uzunluğu tarafından tanımlanan üstteki kılavuzunun boyutunu portakal işaretli pozisyonlar. 
	Not: Sonuçları turuncu kutu yanındaki kırmızı kutuları içinde tasvir edilmektedir.</li>
	<li>Başlangıç noktası olarak belirlendi SN anahat içinde kılavuz Meydanı ile başlar (bir kılavuz-kare seçildi, adım 3.9, olduğu gibi yukarıda).</li>
	<li>x ve y koordinatları, adım 3.9, dosyanın yeşil kutularına (bu değerleri, x, y koordinatları için bu ilk kare içinde optik disector ortasına hesaplanır ve sonuçları mavi kutu içinde tasvir edilmektedir kullanarak) ölçülen ekle. Opt_dis_grid.txt (Ek dosya) makroyu.</li>
	<li>Hesaplamak x, y koordinatları ardışık optik disectors (kareler cinsinden ölçülür) kılavuz-kare mesafe ilk kılavuz-kare (kahverengi kutular) göre ekleyerek. 
	Not: + x: Kılavuz-kare sağda yer alır; -x: Kılavuz-kare sola; bulunur + y: Kılavuz-kare için alt yer alır; -y: Kılavuz-kare başına bulunur. Sonuçlar gri kutularında gösterilir.</li>
</ol> 5. Cep numarasını kullanarak tahmini &#34; hücre sayısı hesaplama &#34; elektronik tablo <ol><li>hesapla TH + SN hücre formülü kullanarak hayvan (N) başına tahmini sayısı Yayınlandı tarafından Batı ve ark., 1991 3, nerede &#8721; Q - bir beyin bölümü tüm optik disectors içinde sayılan TH + nöronlar toplam sayısı olarak tanımlanır. 
	Not: Optik disector (h) ile ilgili olarak ölçülen kalınlığı (t) bölümünün yüksekliğini denklemde dahildir. Alan örnekleme kesir (asf) optik disector (optik disector) çerçeve boyutu kılavuz (x, y adım) kare boyutunu içinde alan (A) oranı olarak tanımlanır (optik disector/A x, y adım) ( şekil 3b) ve Bölüm örnekleme kesir (ssf) bütün seri olarak kesilmiş beyin bölümlerini oranı tanımlanır: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq1.jpg" /> yüksek kaliteli nicel sağlamak, tahminleri katsayısı hata (CE) 0,10 düşük olmalıdır. Keuker ve ark tarafından formülü kullanarak CE belirlemek., 2001 10: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq2.jpg" /></li> <li>her hücre sayısı içinde belgili tanımlık SN stereological tahmini için fare, fare başına oluşturulan serisi toplam sayısı, optik disector, x, y alan optik disector (optik bir disector, µm 2), x, y alan kılavuz kare (x, y adım yüksekliği ile ilgili olarak belirtilen bilgileri ekle µm 2), ve ortalama ölçülen kalınlığı bölümünde (µm) kullanarak sarı kutulara &#34; hücre count.xlsx hesaplanması &#34; elektronik tablo dosyası ( şekil 6b ve ek dosya ).</li>
	<li>Analiz her SN bölümüne aynı hayvan, adım 5'te açıklandığı gibi.</li>
	<li>Insert Hücre sayar optik her disector gri kutularındaki için her satır bir SN bölümüne atıfta, kullanarak &#34; hücre count.xlsx hesaplanması &#34; elektronik tablo dosyası (Ek dosya). 
	Not: Tahmini cep telefonu numarasını ve hesaplanan CE mavi kutu ( şekil 6b) tasvir edilmektedir.</li>
</ol> 6. Bir ticari olarak kullanılabilir Stereology sistem kullanarak hücre sayının tahmin <ol><li>Başlangıç dopaminerjik SNpc tahmini cep numarasını tıklayarak &#34; sondalar &#34; &#8594; &#34; optik Fractionator iş akışı &#34; optik Fractionator açmak için İş akışı pencere. 
	Not: Yeni bir pencere olacaktır SN yeni bir dizi sayılması olup olmayacağını belirlemek için açılır pencere.</li>
	<li>Tıklatarak TH + SN bölümleri yeni bir seri başlatmak &#34; yeni bir konu başlatmak &#34; açılan pencerede.</li>
	<li>Optik Fractionator iş akışı farklı adım adım gitmek. İlk adım konu ayarlayın. Bunun için araştırmacı Ekle &#39; s adı, konu &#39; s adı (SN grubu) ve diğer yararlı bilgiler. Bu SN için saymak için bölümlerin numaralarını ekleyin. Kesme doku bölümleri kalınlığı yerleştirin. Bu durumda dörttür bölüm aralığı ekleyin. Rastgele belirlenen bölüm numarası ile başlamak ekle.</li>
	<li>İkinci adımda, mikroskop büyütme (2 X amaç) düşük ve seçmek için ayarla &#34; 2 X Mag mercek &#34; menüsünden.</li>
	<li>Adım 3'te, faiz Baquet ve ark tarafından açıklandığı gibi SNpc olan sol fare tuşu ile bölgenin izini., 2009 17.</li>
	4. adımda yüksek büyütme için mikroskop <li>ayarlayın. Bunun için hedefi 100 X değiştirmek ve seçin &#34; 100 X Mag objektif &#34; açılır menüden.</li>
	<li>Odaklanarak adım 5'te üst ve alt kısmındaki kısmına monte kalınlığı ölçmek.</li>
	<li>Adım 6, 50 x 50 µm sayım çerçeve boyutu tanımla; bu optik disector (x, y) boyutudur.</li>
	<li>7. adımda sistematik rastgele örnekleme (SRS) kılavuz boyutu 130 x 130 µm ayarlayın.</li>
	<li>3-µm koruma bölgesi 8. adımda girin.</li>
	<li>Adım 9 ayarları kaydetmek.</li>
	<li>Son olarak, her optik disectors içinde adım 10 optik Fractionator iş akışı SRS kılavuzunda TH + dopaminerjik hücreleri saymak. Bunun için yanında tıkırtı üstünde başlamak &#34; Counting &#34; düğmesini.</li>
	<li>Bir bölümü bitirdikten sonra tıklayın &#34; sonraki bölüme başlar &#34; aynı SN serisi sonraki SN bölümünün optik Fractionator iş akışını başlatmak için düğmeyi.</li>
	<li>Sayısal bir SN serisi son SN bölümünü ne zaman tıkırtı üstünde &#34; ben &#39; ve tamamlandı sayım. &#34;</li>
	<li>Tıklayın &#34; sonuçları göster &#34; stereology örnekleme sonuçlarını görüntülemek için düğmeyi.</li>
</ol>

<ol><li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV1%2F2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment%3A+a+new+mouse+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).</li>
<li>Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+reduce+nigrostriatal+deficits+in+the+6-hydroxydopamine+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease.</a> J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereology+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li>
<li>Tieu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+neurotoxic+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316(2011).</li>
<li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anat Rec. 94, 239-247 (1946).</li>
<li>Rose, R. D., Rohrlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+sectioned+cells+via+mathematical+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Counting sectioned cells via mathematical reconstruction.</a> J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).</li>
<li>Weibel, E. R., Gomez, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+principle+for+counting+tissue+structures+on+random+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">A principle for counting tissue structures on random sections.</a> J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).</li>
<li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereological+methods+for+counting+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Design-based stereological methods for counting neurons.</a> Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).</li>
<li>Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+use+the+optical+fractionator%3A+an+example+based+on+the+estimation+of+neurons+in+the+hippocampal+CA1+and+CA3+regions+of+tree+shrews%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).</li>
<li>Mouton, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+age+and+lipopolysaccharide+%28LPS%29-mediated+peripheral+inflammation+on+numbers+of+central+catecholaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons.</a> Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).</li>
<li>Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+proliferation+following+stroke+in+the+mouse+depends+on+distance+from+the+infarct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct.</a> PLoS One. 6 (11), e27881(2011).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</a> (2010).</li>
<li>De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> (2010).</li>
<li>Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+model-based+%282D%29+and+design-based+%283D%29+stereological+methods+for+estimating+cell+number+in+the+substantia+nigra+pars+compacta+%28SNpc%29+of+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse.</a> Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoarchitectonic+and+chemoarchitectonic+analysis+of+the+dopamine+cell+groups+in+the+substantia+nigra%2C+ventral+tegmental+area%2C+and+retrorubral+field+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).</li>
<li>German, D. C., Manaye, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+dopaminergic+neurons+%28nuclei+A8%2C+A9%2C+and+A10%29%3A+three-dimensional+reconstruction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat.</a> J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).</li>
<li>Smeyne, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+Effects+of+MPTP+and+Paraquat+on+Dopaminergic+Neurons+and+Microglia+in+the+Substantia+Nigra+Pars+Compacta+of+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice.</a> PLoS One. 11 (10), e0164094(2016).</li>
</ol>

C. W. ı. Merz eczacılık, LLC ve TEVA için bilimsel kurullarında hizmet vermiştir; Ipsen, Celal eczacılık, LLC ve Allergan, Inc.'a seyahat için fon aldı; ve hoparlör honoraria dışında gönderilen iş Merz, TEVA ve Allergan, Inc aldı. J. V. Boston bilimsel, Medtronic ve AbbVie için bir danışman olarak hizmet vermiştir ve honoraria Medtronic, Boston bilimsel, AbbVie, Bial, Allergan ve GlobalKinetics dışında gönderilen iş aldı.

Stereology doku işleme ile başlar. Seri kesim SN doku stereological Çözümleme sırasında bölümler kaybını önlemek için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. Ayrıca, sağ sol SN stereology gerçekleştirirken ayırmak için bir Yarımküre işaretlemek için bir temel adım olduğunu. Beyin sapı üst kısmında küçük bir delik yerleştirerek en iyi sonuçları sunulan çalışmada oluşturulan. Ayrıca, immünhistokimya, antikor ve diğer kuluçka sıvı doku penetrasyon sırasında daha yay...

Miktar nöronal hücre sayının gözlemliyorum nigra (SN)1,2içinde ateş düzeyini belirlemek için önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma çok önemli. Bölge hücre sayısı faiz tarafsız stereological tahmini altın standart3,4,5olarak kabul edilir.
Tarafsız stereology gelişiyle önce nöronlar gelmek içine bir bölümü görünürde değişken olasılıklar için düzeltmek için sınırlı sayıda hücre profilleri manipüle ederek bölümleri nöronların sayısı değerlendirildi. En sık kullanılan yöntemlerden birini quantified hücre sayımları Abercrombie6tarafından açıklanan düzeltme yapıldı. Bu yöntem aynı hücreyi parçaları bitişik ince bölümlerde bulunursa, hücreler birden çok kez sayılabilir dikkate almaya çalıştı. Bu nedenle, Abercrombie ve diğer yazarlar şekli, boyutu ve yönlendirmesi sayılan hücreleri7,8hakkında varsayımlar gerekli denklemler oluşturulan. Ancak, bu varsayımlar genellikle değil fark etti ve bu nedenle gerçek hücre sayısı (Yani, önyargı) sistematik hatalar ve ıraksak evrim süreçleri sonucu yol açtı. Ayrıca, önyargı ek örnekleme3tarafından azaltılabilir değil.
Optik fractionator kullanarak hücre sayıları stereological tahmini için doğrudan doğrudan birimindeki bir tanımlanmış, 3 boyutlu hücre sayıları tahmin etmek için matematik ilkeleri uygulanır. Bu yöntemin avantajı şekli, boyutu ve yönlendirmesi sayılır varlık hücre hakkında varsayımlar anlamına gelmez mi. Böylece, tahmini hücre sayıları için gerçek değerleri daha yakın olan ve örnek boyutu (Yani, tarafsız)3arttıkça daha yakın olsun. Birçok kural stereology yöntemi tarafsız tutmak için kullanılırken izlenmesi gerekir çünkü, kullanıma hazır ticari stereology sistemleri geliştirilmiştir (gözden geçirme için bkz: Schmitz ve Hof, 20054). Özel stereology sistemlerinin uygulanması Tasarım temelli stereological yöntemleri ile tanımlanan bir priori sonda ve örnekleme düzenleri şekil, boyut, kayma dağıtım ve yönlendirmesi'dan bağımsızlığını yol stereological değerlendirmeler için hücreleri analiz4,9olmak. Ancak, piyasada bulunan stereology sistemleri pahalıdır; Bu yeni araştırma uygulamasında sınırlayabilir.
Bu çalışmada dopaminerjik hücre sayıları Mouse optik fractionator yöntemle contalı profillerde hem standart mikroskobu donanımları (Yani, ışık kullanarak SN, Tasarım temelli stereological tahmini için kullanışlı bir teknik geliştirmekti mikroskop, standart mikroskop bilgisayar yazılımı ve motorlu bir x, y, z sahne). Bunun için fare beyin dokusunu işlemek ve tarafsız stereology tasarım tabanlı kullanarak SN hücre sayıları tahmin hakkında adım adım yönergeler sunulmaktadır. Ayrıca, tahmini hücre sayıları hesaplama ve katsayıları hata (CE) için şablonlar sağlanır.
Burada açıklanan yöntemi SN analiz için sınırlı değildir, ancak fare ya da sıçan beyin anatomik olarak tanımlanmış diğer bölgelerinde kullanmak için adapte edilebilir. Örneğin, tarafsız stereology nöronal hücre sayıları Hipokampus10 ve11locus coeruleus tahmin etmek için kullanılan. Buna ek olarak, nöronlar, astrocytes1312 ve microglia gibi farklı hücre tipleri de değerlendirilebilir. Bu nedenle, bu yöntem tarafsız stereology onların araştırma uygulamayı istediğiniz ama çok stereology sistem satın almak için para harcamaya istekli olmayan bilim adamları için yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Paxinos mouse atlas</td><td></td><td></td><td>The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet &amp;amp; created by Paul Halasz</td></tr><tr><td>brain matrix slicer mouse</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS 001-1</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>sucrose /D(+) Saccharose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>isopentane</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Merck</td><td>1040931000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;phosphate buffered saline ingredients:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>potassium dihydrogen phosphate</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>di-sodium hydrogen phosphate dihydrate</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>potassium chloride</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ml</td><td>detergent</td></tr><tr><td>3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0</td><td>Kem En Tec</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/ Hydrogen peroxide 30%</td><td>Merck</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>avidin/biotin reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>32050</td><td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td></tr><tr><td>rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody</td><td>abcam</td><td>Ab112</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L</td><td>vector laboratories</td><td>BA-1000</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StereoInvestigator version 11.07</td><td>MBF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>3.3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Version 4.7</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>dry ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>grid overlay plugin</td><td>Wayne Rasband</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td></tr><tr><td>cell counter plugin</td><td>Kurt de Vos</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>optical disector macro</td><td>Christopher Ward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6N male mice</td><td>Charles River, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus coated object slides</td><td>Langenbrinck, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G needle Microlance 3</td><td>BD</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>REGLO Analog Infusion pump</td><td>Ismatec</td><td>ISM 829</td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator system</td><td></td><td></td><td>StereoInvestigator version 11.07</td></tr><tr><td>BX53 microscope</td><td></td><td></td><td>BX53 microscope</td></tr><tr><td>self-assorted stereology</td><td></td><td></td><td>Visiview</td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td></td><td></td><td>Axiophot2</td></tr></tbody></table>

stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fractionator and standard microscopy equipment

Önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma, analiz miktar gözlemliyorum nigra içinde dopaminerjik nöron kaybı da dahil olmak üzere nigrostriatal sistemi esastır. Toplam dopaminerjik nöron sayısı tahmin etmek için tarafsız stereology optik fractionator yöntemini kullanarak şu anda altın standart olarak kabul edilir. Optik fractionator yöntemi arkasındaki teori karmaşık olduğu için ve stereology özel ekipman elde etmek zor olduğu için gerekli yazılımı dahil birkaç ticari olarak mevcut tam stereology sistemleri, tamamen var hücre için nedenleri sayma. Özel stereology Kur satın alma her zaman birçok nedenden dolayı mümkün olmadığına göre bir ışık mikroskobu, dahil olmak üzere standart mikroskobu kullanýlýyor dopaminerjik nöron hücre stereological tahmini sayar için bu raporu bir yöntem açıklanır bir nesne tablosu (x, y, z uçak) görüntüleme yazılımı ve analiz için bir bilgisayar ile motorlu. Adım adım açıklama stereological miktar optik fractionator yöntemini kullanarak gerçekleştirme konusunda verilir ve önceden programlanmış dosyaları tahmini hücre sayımları hesaplanması için sağlanır. Bu yöntem doğruluğunu değerlendirmek için piyasada bulunan stereology cihaz elde edilen verilere bir karşılaştırma gerçekleştirildi. Benzer hücre sayıları bu protokol ve stereology aygıt kullanarak böylece tarafsız stereology için bu protokolü duyarlık gösteren bulundu.

Sunulan yöntemi, TH + dopaminerjik nöron 7,363 ve 7,987 hücreler arasında değişmekteydi SN sağ ve sol SN, tahmini sayısı 7,446 ve 7,904 hücreler arasında kullanarak. Böylece, dopaminerjik nöron (± SEM) ortalama sayısı SN sağ ve sol SN için 66 7,675 ± 7,647 ± 83 hücreleri idi. Her hayvan için hesaplanan CE 0,08 düşüktü (aralığı: 0,073 0.079) (Şekil 7). Bu yöntem ticari olarak kullanılabilir ve özel stereology sistemleri ile kar...

Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment at JoVE.

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Bu eser dopaminerjik nöron hücre sayıları tarafsız stereological tahmini için adım adım bir protokol fare gözlemliyorum standart mikroskobu kullanýlýyor (Yani, bir ışık mikroskobu, bir motorlu nesne tablo (x, y, z nigra içinde sunar. uçak) ve kamuya açık yazılım dijital görüntü analizi için.

Optik Fractionator ve standart mikroskobu ekipmanlar kullanarak fare gözlemliyorum Nigra dopaminerjik nöron sayısının stereological tahmin

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

stereological-estimation-dopaminergic-neuron-number-mouse-substantia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K Görüntüleme.  University Hospital of Würzburg. Bu eser dopaminerjik nöron hücre sayıları tarafsız stereological tahmini için adım adım bir protokol fare gözlemliyorum standart mikroskobu kullanýlýyor (Yani, bir ışık mikroskobu, bir motorlu nesne tablo (x, y, z nigra içinde sunar. uçak) ve kamuya açık yazılım dijital görüntü analizi için.

Video: Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia nigra ve ventral Tegmental Bölgesi Dopamin Yönetmelik Kapsamlı Profilleme

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Nörobilim

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Yetişkin Farelerde Orta beyin dopamin Nöronlar Sayısının Çevre Modülleri

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells or structures. These methods have been revolutionary for quantitative analysis of the mammalian brain, in which volumetric cell populations are too high to count manually, and stereology is now the technique of choice whenever estimates of three-dimensional quantities need to be extracted from measurements on two-dimensional sections. All stereological methods are in principle unbiased; however, they rely on proper knowledge about the structure of interest and the characteristics of the tissue. Stereology is based on Systematic Uniformly Random Sampling (SURS), with adjustment of sampling to the most efficient level in respect to precision, providing reliable, quantitative information about the whole structure of interest. Here we present the optical fractionator in conjunction with BrdU immunohistochemistry to estimate the production and survival of newly-formed neurons in the granule cell layer (including the sub-granular zone) of the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation, which is among the most potent stimulators of neurogenesis. The optical fractionator technique is designed to provide estimates of the total number of cells from thick sections sampled from the full structure. Thick sections provide the opportunity to observe cells in their full 3-D extent and thus, allow for easy and robust cell classification based on morphological criteria. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of the optical fractionator provides accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

Here, we present a stereological method, the optical fractionator, used to quantify the formation of new neurons, and their survival, in the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of stereological methods ensures accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

Elektrokonvülsif Terapi Sıçan Modelinde Hücre Sayılarını Tahmin Etmek İçin Optik Fraksiyonlama Tekniği

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a useful method to quantify neuronal profiles of various brain structures. Here we provide a software-based stereology protocol to estimate the total length of cholinergic fibers in the nucleus basalis of Meynert (NBM) of the basal forebrain. The method uses a space ball probe for length estimates. The cholinergic fibers are visualized by choline acetyltransferase (ChAT) immunostaining with the horseradish peroxidase-diaminobenzidine (HRP-DAB) detection system. The staining protocol is also valid for fiber and cell number estimation in various brain regions using stereology software. The stereology protocol can be used for estimation of any linear profiles such as cholinoceptive fibers, dopaminergic/catecholaminergic fibers, serotonergic fibers, astrocyte processes, or even vascular profiles.

Neuronal fiber length within a three-dimensional structure of a brain region is a reliable parameter to quantify specific neuronal structural integrity or degeneration. This article details a stereological quantification method to measure cholinergic fiber length within the nucleus basalis of Meynert in mice as an example.

Fare Beyninin Meynert'in Nükleus Bazalisinde Kolinerjik Lif Uzunluğunun Stereoolojik Tahmini

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with immunostaining and unbiased automated image analysis, this model allows for the analysis of the effects of drugs and genetic manipulations on &#945;-synuclein aggregation in neuronal cultures. Primary midbrain cultures provide a reliable source of bona fide embryonic dopamine neurons. In this protocol, the hallmark histopathology of Parkinson&#8217;s disease, Lewy bodies (LB), is mimicked by the addition of &#945;-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) directly to neuronal culture media. Accumulation of endogenous phosphorylated &#945;-synuclein in the soma of dopamine neurons is detected by immunostaining already at 7 days after the PFF addition. In vitro cell culture conditions are also suitable for the application and evaluation of treatments preventing &#945;-synuclein accumulation, such as small molecule drugs and neurotrophic factors, as well as lentivirus vectors for genetic manipulation (e.g., with CRISPR/Cas9). Culturing the neurons in 96 well plates increases the robustness and power of the experimental setups. At the end of the experiment, the cells are fixed with paraformaldehyde for immunocytochemistry and fluorescence microscopy imaging. Multispectral fluorescence images are obtained via automated microscopy of 96 well plates. These data are quantified (e.g., counting the number of phospho-&#945;-synuclein-containing dopamine neurons per well) with the use of free software that provides a platform for unbiased high-content phenotype analysis. PFF-induced modeling of phosphorylated &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons provides a reliable tool to study the underlying mechanisms mediating formation and elimination of &#945;-synuclein inclusions, with the opportunity for high-throughput drug screening and cellular phenotype analysis.

Here, we present a detailed protocol to study neuronal &#945;-synuclein accumulation in primary mouse dopamine neurons. Phosphorylated &#945;-synuclein aggregates in neurons are induced with pre-formed &#945;-synuclein fibrils. Automated imaging of immunofluorescently labeled cells and unbiased image analysis make this robust protocol suitable for medium-to-high throughput screening of drugs that inhibit &#945;-synuclein accumulation.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarında Pre-formed Fibril Indüklenen α-Sinüklein Birikiminin İncelendirilmesi

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased stereological counting is the standard for quantification of these cells, but it remains a laborious and time-consuming process, which may not be feasible for all projects. Here, we describe the use of an image analysis platform, which can accurately estimate the quantity of labeled cells in a pre-defined region of interest. We describe a step-by-step protocol for this method of analysis in rat brain and demonstrate it can identify a significant reduction in tyrosine hydroxylase positive neurons due to expression of mutant &#945;-synuclein in the substantia nigra. We validated this methodology by comparing with results obtained by unbiased stereology. Taken together, this method provides a time-efficient and accurate process for detecting changes in dopaminergic neuron number, and thus is suitable for efficient determination of the effect of interventions on cell survival.

Here we present an automated method for semi-quantitative determination of dopaminergic neuron number in the rat substantia nigra pars compacta.

Otomatik Görüntü Analizi Kullanılarak Kemirgen Modellerinin Substantia Nigra'sında Dopaminerjik Nöron Yoğunluğunun Yarı Nicel Belirlenmesi

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

Quantifying Newly Generated Neurons in Rat Brain Tissue Using the Optical Fractionator Technique

Source:<a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55737/the-optical-fractionator-technique-to-estimate-cell-numbers-in-a-rat-model-of-electroconvulsive-therapy'><span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Olesen, M. V.,&#160;et al<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.&#160;J. Vis. Exp.<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> (2017).</a> &#160;The video demonstrates the technique for quantifying newly generated neurons in brain tissue. Hippocampal tissue slices containing Bromodeoxyuridine (BrdU)-labeled neurons were stained using immunohistochemistry and subsequently quantified across the tissue thickness using the optical fractionator technique.

Source: Olesen, M. V.,&#160;et al. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.&#160;J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroimaging

Synaptic & Cellular Imaging

Studying Alpha-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons

Source: Er, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/61118">Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates the process of quantifying alpha-synuclein accumulation in embryonic mouse dopamine neurons pre-treated with alpha-synuclein pre-formed fibrils. It outlines the steps for fixing, staining, and quantifying the dopamine neurons containing alpha-synuclein aggregates using immunofluorescence.

Primer Embriyonik Fare Dopamin Nöronlarında Alfa-Sinüklein Birikiminin İncelenmesi

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1.&#160;Preparation

	Prepare ...