저자는 그들의 전문 기술 지원; Keali 룀, 루이자 Frieß, 하이 케 멘 젤 감사 헬가 Brünner 동물 보호; 대 하 그리고 생성 및 ImageJ 소프트웨어에 대 한 광학 disector 그리드 플러그인의 배포에 대 한 Chistopher S. 병 동.

관심과 동물의 사용에 대 한 모든 해당 국제, 국가, 또는 기관 지침에 따라 했다. 프로토콜 Regierung 폰 인 운터 프랑 켄, 뷔르츠부르크, 독일에서 지방 자치 단체에 의해 승인 되었다.
 1. 조직 처리 및 Immunohistochemistry <ol><li>Euthanize 쥐 CO 2 또는 어떤 다른 승인 방법.</li>
	<li>Perfuse 6 12 주 된 C56Bl/6N 남성 쥐 transcardially 10 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 25 G 바늘과 주입 펌프를 사용 하 여 다음 0.1 M PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 70 mL. 
	주의: PFA는, 알레르기, 독성 및 발암 성.</li>
	<li>Bregma (그림 25, Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14)에서 +0.74 m m의 영역에서 두뇌 매트릭스 슬라이서와 코로나 비행기에 쥐의 뇌를 해 부.</li>
	<li>SN를 포함 하 여 4%에서 뇌의 등 쪽 부분 침수-고정을 위한 4 ° C에서 1 d 0.1 M PBS에 PFA.</li>
	<li>Cryo-보호에 대 한 30% 자당/0.1 mol PBS 솔루션 PFA 교환 하 고 다른 2 d 4에서 품 어 ° c.</li>
	<li>최적의 절삭 온도 (10 월)는 cryomold로 뇌의 등 쪽 부분 가득 넣어 컴파운드와 천천히 액체 드라이 아이스 냉각 isopentane는 조직의 동결. 
	주의: 드라이 아이스는 매우 추운 (-78 ° C); 드라이 아이스와 함께 작업 하면서, 장갑 등 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다. 드라이 아이스 증발 CO 2; 따라서, 연기 후드 작동.</li>
	<li>순차적으로 30 µ m cryo-섹션 코로나 비행기에서 잘라내어 Bregma (그림 51 Paxinos, 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14)에서 2.46 m m에서 시작 및 끝 Bregma에서 4.04 m m 섹션을 수집 (그림 64, Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14).</li>
	<li>는 Cryoprotectant (30% 글리세롤, 30 %ethoxyethanol, 및 40 %PBS)-20 ° c.에로 채워진 튜브에 4 개의 시리즈를 저장 단면화 절차 동안 표시 오른쪽 반구 brainstem의 상위 영역에 작은 구멍을 puncturing.</li>
	<li>Immunohistochemical 얼룩, 선택 마우스 당 섹션의 한 시리즈. 10% 정상 염소 혈 청 (0.1 mol 통에 PBS에에서 NGS)/2% BSA/0.5% 세제 1 시간에 대 한 preincubate 부동성 섹션. 섹션 4에서 하룻밤 2% NGS/2% BSA/0.5% 세제 0.1 mol PBS에에서 희석 토끼 반대로 마우스 티로신 hydroxylase (TH, 1:1,000 희석) 항 체로 품 어 ° c.</li>
	토끼에 대 한 항 체 <li>적용 보조 Igs (1: 100 희석) 실 온에서 2 h 뒤 avidin/비오 틴 시 약 (1: 100 희석). 품 어와 3, 3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (한 덩어리) 및 H 2 O 2와 얼룩. 코팅된 개체 슬라이드에 얼룩 후 섹션을 탑재. 
	참고: 회 + dopaminergic SN 뉴런 그림 1a에 표시 됩니다. 얼룩 한 시리즈, 여 SN 동위 compacta (SNpc) 및 reticulata, 꼬리 부분에는 rostral에서 연장 13 SN 섹션의 평균은 동물 ( 그림 1b) 당 물 들 다. 섹션 120 µ m (1/4 시리즈)으로 구분 됩니다 ( 그림 1c). 
	주의: 소량은 의심 되는 발암 물질 이다. 그것은 접촉 및 흡입 독성입니다. 소량 작업 시 보호구를 사용.</li>
</ol> 2. 이미지의 수집 <li>캡처 일 immunohistochemically <ol>디지털 현미경에 결합 된 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 SN 섹션 스테인드. 1 시리즈의 각 섹션을 별도로 분석.</li>
	<li>이미징 소프트웨어의 스캔 슬라이드 옵션을 사용합니다. 높은-품질의 이미지 (그림 2)에 대 한 TIFF 형식으로 저장. 
	참고: 이미지 해상도 cm 당 312 픽셀.</li>
	<li>기자 &#34; 취득 &#34; 수집 창 (그림 2a) 여.</li>
	<li>설정 합니다 binning &#34; 2 &#34; 회색조 이미지. 
	참고: 컬러 사진 대신 회색조 이미지의 인수 최종 스택 이미지 파일 (그림 2a)의 크기를 줄입니다.</li>
	<li>클릭 &#34; 라이브 쇼 &#34; 섹션의 라이브 이미지를 보여주는 새 창을 열려면 수집 창에서 (그림 2 a와 b).</li>
	<li>클릭 &#34; 단계 &#34; 수집 창에서. 선택 &#34; 슬라이드 스캔 &#34; 드롭다운 메뉴 및 확인란 (그림 2c). 
	참고: 그러면 수집 및 z-비행기, 13 μ의 전체 범위에서 1 µ m의 연속 이미지 사이의 거리를 사용 하 여 스택 이미지의 수집 뿐만 아니라 x, y 평면에 고도의 확대 SN 이미지 (630 X 배율)의 맞춤 m.</li> <li>SN에 대 한 검색을 2.5 X 목표를 선택 합니다.</li>
	<li>X. 63 목표 변경</li>
	<li>왼쪽된 상단 (TopLeft) (그림 2c) 및 오른쪽 아래 모서리 (LowRight) (그림 2d) 섹션의 클릭 하 여 정의 &#34; 세트. &#34;</li>
	<li>클릭 &#34; Z 시리즈 &#34; 확인 하 고는 &#34; Z-비행기 시리즈 &#34; 상자 (그림 2e).</li>
	<li>결정 3 개의 무작위로 선택 된 계산에서 섹션의 실제 탑재 된 두께 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 섹션 당 사이트. 클릭이 &#34; 보기 상단 오프셋 &#34; 정의 섹션 (그림 2e)의 상단을 클릭 &#34; 중지 보기 톱 &#34; (그림 2f). 그 후, 클릭 &#34; 보기 아래쪽 오프셋 &#34; (그림 2f)를 클릭 하 고 &#34; 중지 보기 하단 &#34; (그림 2 g). 섹션의 두께 적어 둡니다.</li>
	<li>빼기 3 µ m (가드 영역) 위에서 오프셋 하 고 최고 오프셋된 슬롯 (그림 2 h)에 결과 입력 합니다. 13 µ m (광 disector의 높이) 최고 오프셋된 수에서 뺍니다 고 맨 아래 오프셋된 슬롯 (그림 2i)에 결과 입력 합니다. 다음 매개 변수를 선택 합니다: 단계, 14; 크기, 1.00 (그림 2i). 
	참고:이 연속 이미지 사이의 1 µ m 거리 13 µ m의 z 평면에 두께에 해당.</li>
	<li>(그림 2j) 파일을 저장할 디렉터리를 선택 합니다.</li>
	<li>클릭 &#34; 시퀀스 &#34; (그림 2j) 수집을 시작 하.</li>
	<li>클릭 &#34; 처리 &#34; 고 다음과 같은 매개 변수 선택: &#34; 모든 비행기 &#34;에서 &#34; 순서; &#34; &#34; 몽타주; &#34;와 &#34; 빠른 &#34; 및 &#34; 바느질 &#34; 상자, 10% (그림 2)의 이미지 중복. 시작을 클릭 하 여 이미지를 &#34; 시작 &#34;. 
	참고: 분석에 대 한 스택 이미지 생성 됩니다 (그림 2 l, 그림 3a -e).</li>
</ol> 3. Stereological 평가 순서 <ol><li>NIH ImageJ 소프트웨어 버전 4.7 사용 하 여 SN 스택 이미지의 분석을 수행.</li>
	<li>ImageJ.nih.gov 웹사이트에서 필요한 두 개의 플러그인 다운로드:는 &#34; 그리드 오버레이 &#34; 플러그인 15와 &#34; 셀 카운터 &#34; 플러그인 16. 설명 된 대로 두 플러그인 설치.</li>
	<li>편견된 stereological 평가 대 한 다음과 같은 세 매개 변수 정의: 그리드 크기 130 x 130 µ m; 계산 프레임, 50 x 50 µ m; 광 disector 높이, 13 & #181, m.</li>
	<li>클릭 하 여 이미지를 열고 &#34; 파일 &#34; &#8594; &#34; 오픈 &#34; (그림 4a)를 사용 하 여 이미지 축척을 설정에 &#34; 분석 &#34; &#8594; &#34; 비율 설정 &#34; 명령 (그림 4b). 이 단계에 대 한 정의 된 크기에서에서 변경 픽셀 µ m (그림 4c). 
	참고: 분석 된 이미지에 대 한 425 픽셀 100 µ m에 해당.</li>
	<li>선택은 &#34; 플러그인 &#34; &#8594; &#34; 그리드 &#34; &#8594; &#34; 격자 유형: 라인 &#34; 그리드를 무작위로 삽입 하는 명령. 검사는 &#34; 임의의 오프셋 &#34; 상자. 130 µ m x 130 µ m으로 grid (그리드 사각형) 내 하나의 사각형의 크기를 정의 = 16900 µ m 2 ( 그림 3b 및 그림 4 d 및 e).</li>
	<li>변경 이미지에서 유형 16-비트 RGB 색상 (클릭 &#34; 이미지 &#34; &#8594; &#34; 유형 &#34; &#8594; &#34; RGB 색상 &#34;) (그림 4 층). Baquet 외에 설명 된 대로 SNpc를, 찾습니다 17.와 SNpc를 둘러싸 자는 &#34; 페인트 브러시 도구 &#34; (브러쉬 폭: 11) ( 그림 3 c 및 그림 4 g -난).</li>
	<li>실행 취소는 &#34; 비율 설정 &#34; 클릭 하 여 명령 &#34; 분석 &#34; &#8594; &#34; 비율 설정 &#34; &#8594; &#34; 제거 규모를 클릭 &#34; (그림 4j -l) 오히려 픽셀에 계산의 성능을 사용할 수 있도록 µ m 보다.</li>
	<li>화면 (그림 4 m)를 확인 하 고 이미지 파일 저장 ImageJ (그림 4n)으로 새 파일을 엽니다. 선택 &#34; 포인트 &#34; (그림 4o)와 25 (그림 4 p)의 브러시 폭. 그 연락처는 SN 광학 disector (그림 4 분기)의 배치에 대 한 모든 그리드 사각형을 표시 합니다. 개요 SN 부분적으로 또는 완전히 지역화 된 모든 광학 disectors에 셀 수의 분석을 수행.</li>
	<li>SN의 부분을 포함 한 그리드 사각형을 선택 합니다. ImageJ는 x와 y를 정의 하에 커서를 놓고이 사각형의 왼쪽된 위 모퉁이 좌표 (4r 그림)와 함께 시작 하는 측정. 
	참고: 광 disector를 사용 하 여 위치에 대 한 삽입 됩니다 좌표는 &#34; 광학 disector 위치 &#34; (그림 4s), 4 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>, 스프레드시트 서식 파일을 사용 하 여 광학 disector 위치를 계산 &#34; 광학 disector 위치, &#34; 4 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>보정 광학 disector (매크로 추가 파일 크리스토퍼 S. 구 음)를 클릭 하 여 &#34; 플러그인 &#34; &#8594; &#34; 매크로 &#34; &#8594; &#34; 편집 &#34; (그림 4t), 열은 &#34; opt_dis_ grid.txt &#34; (4u 그림) 파일, 그리고 정의의 크기는 &#34; usergrid &#34; x, y 차원 광학 disector (그림 4v)의 해당 픽셀에. 50 µ m x 50 µ m의 크기를 선택 하는 usergrid의 1 개의 측의 크기는 212.5 픽셀 (픽셀 50 x 4.25)로 정의 됩니다.</li>
	<li>광학 disector (그림 4v)의 중심을 정의 하는 ImageX와 ImageY 좌표를 삽입 하 여 스택 이미지에서 광학 disector의 위치를 결정 합니다. 매크로 실행 (&#34; 매크로 &#34; &#8594; &#34; 실행 매크로 &#34;) (그림 4w). 
	참고: 격자 ( 3d 그림 및 그림 4 x) 스택 이미지에서 사라져 버릴 것 이다. Z-평면 ( 3e 그림 및 그림 4 x)에서 이동할 때 광 disector 유지 됩니다.</li>
	<li>선택 &#34; 플러그인 &#34; &#8594; &#34; 셀 카운터 &#34; 셀 카운터 플러그인 (그림 4y) 시작. 셀 카운터를 초기화 하 고 표식 유형 (그림 4z)를 선택 합니다. 이미지에 확대 (클릭 &#34; + &#34;) 200%의 확대에 핸드폰 번호의 stereological 평가 수행 하는 고.</li>
	<li>식별 dopaminergic 신경 perikarya 그들의 둥근 또는 ovoid 모양 및 셀 크기 ( 그림 1a). Stereological 규칙을 사용 하 여 셀의 수를 계량. 
	참고: 광 disector 3 차원 큐브 ( 그림 5a) 이기 때문에, 왼쪽, 앞으로 제외 측 및 큐브 (빨간색)의 최고의 측면 정의 합니다. 따라서, 돈 &#39; t 수 회 + 셀 레드 라인 (왼쪽 및 전면) 또는 상단 측면의 접촉으로 그 어 서. 준비 된 스프레드시트 파일에는 셀의 결과 추가 &#34;의 세포 수 계산 &#34; (5 단계).</li>
	<li>SN 이미지에 따라 계산 다음 셀 개수에 대 한 광학 disector를 다음 그리드 스퀘어 사용 하 여 x, y 단계 overlying 그리드 ( 그림 5b)의 크기와 &#34; 광학 disector 위치 &#34; 4 단계에서 설명한 대로 스프레드시트 서식 파일.</li>
	<li>셀 번호 사용의 추정을 수행는 &#34;의 세포 수 계산 &#34; 스프레드시트 (5 단계).</li>
</ol> 4. 광학 Disector 위치를 사용 하 여 계산 된 &#34; 광 Disector 위치 &#34; 스프레드시트 서식 파일 <ol><li>계산 크기와 SN (윤곽선 overlying 그리드에 배치 각 광 disector의 위치 그림 5b) 사용 하는 &#34; 광학 disector position.xlsx &#34; 스프레드시트 파일 (파일 추가).</li>
	<li>삽입 µ m, 당 픽셀의 변환에 의해 정의 된 대로 &#34; 비율 설정 &#34; 명령의 노란색 표시 된 위치에는 &#34; 광학 disector position.xlsx &#34; 파일 ( 그림 6a와 보충 파일 ).</li>
	<li>광학 disector의 계획 된 크기와 삽입 (µ m)에서 1 개의 측의 길이 의해 정의 된 overlying 그리드의 모눈 정사각형의 크기 오렌지 표시 위치. 
	참고: 결과 주황색 상자 옆에 있는 빨간 상자에 묘사 된다.</li>
	<li>시작 지점으로 결정 했다 SN 윤곽선 그리드 사각형으로 시작 (하나의 그리드 사각형 선정 되었다로 시작 되기 위하여는, 단계 3.9에서 같이 위의).</li>
	<li>삽입 x 및 y 좌표를 기준으로 측정 단계는 파일의 녹색 상자에 3.9에서 (이러한 값, x, y 좌표를 사용 하 여이 첫 번째 사각형 내에서 광학 disector의 센터 계산 되 고 결과 파란색 상자에 묘사에 대 한). Opt_dis_grid.txt 매크로 (추가 파일) 실행.</li>
	<li>첫 번째 그리드 사각형 (갈색 상자) 기준으로 그리드 스퀘어 거리 (사각형의 수 측정)를 삽입 하 여 x, y 좌표 연속 광 disectors의 계산. 
	참고: + x: 그리드 사각형은 오른쪽; -x: 그리드 사각형은 왼쪽; + y: 그리드-광장은 아래쪽에 위치 하 고 있습니다. -y: 그리드 사각형은 상단에 위치 하 고 있습니다. 결과 회색 상자에 표시 됩니다.</li>
</ol> 5. 셀 번호를 사용 하 여 추정은 &#34; 세포 수 계산 &#34; 스프레드시트 <ol><li>계산 수식을 사용 하 여 동물 (N) 당 회 + SN 셀의 예상된 수 출판 서쪽 외 알., 1991 년 3, 어디 &#8721; Q - 일 + 신경 한 뇌 섹션의 모든 광학 disectors에 계산의 총 수로 정의 됩니다. 
	참고: 측정된 두께 (t) 섹션의 관련 광학 disector (h)의 높이 방정식에 포함 됩니다. 지역 샘플링 분수 (asf) 표 (x, y 단계)의 사각형 크기 내에서 광학 disector (광 disector) 프레임 크기의 영역 (A)의 비율으로 정의 된다 (광 disector/A x, y 단계) ( 그림 3b), 그리고 섹션 샘플링 분수 (ssf) 전체 직렬 컷된 두뇌의 섹션의 비율으로 정의 됩니다: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq1.jpg" /> 양적 높은 품질을 보장 하기 위해 추정 계수 오류 (CE) 0.10 보다 낮은 되어야 합니다. Keuker 외에 의해 수식을 사용 하 여 CE 확인., 2001 년 10: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq2.jpg" /></li> <li>각각의 SN 내 휴대폰 번호 stereological 추정에 대 한 마우스, 마우스 당 생성 된 시리즈의 총 수, 광 disector, x, y 영역 광학 disector (µ m 2: 광 disector), x, y 영역 (x, y 단계 모눈 정사각형의 높이 대 한 지정 된 정보를 삽입 µ m 2에), 평균 측정 (µ m)에서 사용 하 여 노란색 상자에 섹션의 두께 &#34; 셀 count.xlsx의 계산 &#34; 스프레드시트 ( 그림 6b 파일 및 보조 파일 ).</li>
	<li>같은 동물에서 각 SN 섹션 5 단계에서 설명한 대로 분석.</li>
	<li>삽입 셀 카운트 회색 상자에 각 광 disector 한 SN 섹션을 참조를 사용 하 여 각 줄에서 &#34; 셀 count.xlsx의 계산 &#34; 스프레드시트 파일 (파일 추가). 
	참고: 예상된 휴대폰 번호 및 계산 된 CE 파란색 상자 ( 그림 6b)에서 묘사 된다.</li>
</ol> 6. 상업적으로 사용 가능한 Stereology 시스템을 사용 하 여 셀 번호의 추정 <ol><li>시작 dopaminergic SNpc의 추정 셀 번호를 클릭 하 여 &#34; 프로브 &#34; &#8594; &#34; 광학 Fractionator 워크플로 &#34; 광학 Fractionator 여 워크플로 창. 
	참고: 새 창이 나타납니다-SN의 새 시리즈 계산 될 것 이다 확인.</li>
	<li>클릭 하 여 일 + SN 섹션의 새로운 시리즈를 시작 &#34; 새로운 주제를 시작 &#34; 팝업 창에서.</li>
	<li>광학 Fractionator 워크플로의 다른 단계를 통해 이동합니다. 첫 번째 단계에서 주제를 설정 합니다. 이 위해 조사를 삽입 &#39; s 이름, 주제, &#39; s 이름 (SN 그룹), 및 기타 유용한 정보. 이 SN에 대 한 계산 섹션의 숫자를 삽입 합니다. 잘라 조직 단면도의 두께 삽입 합니다. 4이 경우에 섹션 간격을 삽입 합니다. 시작으로 임의로 결정된 섹션 번호 삽입.</li>
	<li>두 번째 단계에서 설정 낮은 확대 (2 X 목표)을 선택 현미경 &#34; 탄 창 렌즈 X 2 &#34; 메뉴에서.</li>
	<li>Baquet 외에 설명 된 대로 SNpc은 마우스 왼쪽된 버튼으로 관심 영역을 추적 3 단계에서., 2009 17.</li>
	<li>4 단계에서 높은 확대에 현미경을 설정합니다. 이 위해 100 X 목표를 변경 하 고 선택 &#34; 100 X 매기 렌즈 &#34; 드롭다운 메뉴에서.</li>
	<li>5 단계에서 초점을 맞춤 으로써 섹션의 하단을 상단에 탑재 된 두께 측정.</li>
	<li>단계에서 6, 50 x 50 µ m로 계산 프레임 크기를 정의; 광학 disector (x, y)의 크기입니다.</li>
	<li>7 단계에서 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 격자의 크기 130 x 130 µ m 설정.</li>
	<li>8 단계에서 3 µ m 감시 영역을 입력.</li>
	<li>9 단계에서 설정을 저장.</li>
	<li>는 마지막으로, 광학 Fractionator 워크플로의 단계 10에서에서 SRS 격자 내에서 광학 disectors의 각 목 + dopaminergic 셀을 계산합니다. 이 클릭 하 여 시작 된 &#34; 계산 &#34; 버튼.</li>
	<li>클릭 한 부분을 마치고는 &#34; 다음 섹션 시작 &#34; 같은 SN 시리즈의 다음 SN 섹션의 광학 Fractionator 워크플로 시작 하는 버튼.</li>
	<li>1 SN 시리즈의 마지막 SN 섹션 계량 되었습니다 때 클릭 &#34; 나 &#39; ve 완료 센다. &#34;</li>
	<li>클릭 합니다 &#34; 결과 보기 &#34; stereology 샘플링의 결과 표시 하려면 단추.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV1/2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment:+a+new+mouse+model+for+Parkinson's+disease.">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).</li><li>Ip, C. W., Beck, S. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+proliferation+following+stroke+in+the+mouse+depends+on+distance+from+the+infarct.">Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct.</a> PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).</li><li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>. Grid_Overlay.java Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</a> (2010)</li><li>. cell_counter.jar Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> (2010)</li><li>Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+model-based+(2D)+and+design-based+(3D)+stereological+methods+for+estimating+cell+number+in+the+substantia+nigra+pars+compacta+(SNpc)+of+the+C57BL/6J+mouse.">A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse.</a> Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoarchitectonic+and+chemoarchitectonic+analysis+of+the+dopamine+cell+groups+in+the+substantia+nigra,+ventral+tegmental+area,+and+retrorubral+field+in+the+mouse.">A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).</li><li>German, D. C., Manaye, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+dopaminergic+neurons+(nuclei+A8,+A9,+and+A10):+three-dimensional+reconstruction+in+the+rat.">Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat.</a> J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).</li><li>Smeyne, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+MPTP+and+Paraquat+on+Dopaminergic+Neurons+and+Microglia+in+the+Substantia+Nigra+Pars+Compacta+of+C57BL/6+Mice.">Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice.</a> PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).</li></ol>

C. W. I. 즈 제약, LLC 및 TEVA; 과학 보드에서 제공 하는 Ipsen, 즈, LLC는, 제약과 엘 러간, Inc.;에서 여행에 대 한 자금 지원을 받고 있다 제출된 작품 외부 스피커 honoraria Merz, TEVA, 엘 러간, i n c.에서 받았다. J. V. 보스턴 과학, Medtronic, 및 AbbVie에 대 한 컨설턴트 역임 했다 고 제출된 작품 밖에 honoraria Medtronic, 보스턴 과학, AbbVie, Bial, 엘 러간, 및 GlobalKinetics에서 받고 있다.

Stereology는 조직 처리를 시작합니다. SN 조직의 직렬 절단 stereological 분석 하는 동안 섹션의 손실을 방지 하기 위해 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 또한, 하나의 필수 단계 stereology 수행할 때 SN 왼쪽에서 오른쪽을 구별 하기 위해 한 반구를 표시 하는. Brainstem의 상단 부분에 작은 구멍을 배치 제시 연구에서 최상의 결과 생성. 또한, 조직이 광학 fractionator 방법 요구 작업 이후 약 30-40 µ m 보다는 더 ?...

신경 세포 수의 부 량은 neurodegeneration substantia nigra (SN)1,2에서 레벨을 전 임상 파 킨 슨 병 연구에. 관심의 영역에 셀 수의 편견된 stereological 추정 금3,,45으로 간주 됩니다.
편견된 stereology의 도래 하기 전에 섹션에서 신경 세포의 수는 뉴런 섹션에 광경에와 서 가변 확률에 대 한 수정 계산된 셀 프로 파일을 조작 하 여 평가 했다. 가장 일반적으로 사용 되는 방법 중 하나는 아베 크롬 비6에 의해 설명 된 정량된 셀의 정정 했다. 이 방법은 세포 조각 같은 셀의 인접 한 얇은 섹션에서 발견 되는 경우 여러 번 측정할 수는 계정에 걸릴 하려고 했습니다. 따라서, 아베 크롬 비와 다른 저자 모양, 크기, 및 계산된 셀7,8의 방향에 대 한 정의 요구 하는 방정식을 생성. 그러나, 이러한 가정 일반적으로 하지 실현 되었고 따라서 실제 휴대폰 번호 (즉, 바이어스)에서 체계적인 오류 및 분기에 led. 또한, 바이어스 추가 샘플링3으로 줄일 수 없습니다.
Stereological 광학 fractionator를 사용 하 여 셀 수 추정에 대 한 수학적 원리 직접 정의 3 차원 볼륨에 직접 셀 숫자를 추정에 적용 됩니다. 이 방법의 장점은 그것은 모양, 크기, 및 계산 셀의 방향에 대 한 가정을 포함 하지 않습니다. 따라서, 예상된 핸드폰 번호는 참 값에 가까운 고 가까이 샘플 크기가 증가 (즉, 편견)3. Stereology 편견 메서드를 계속 사용 하는 경우 많은 규칙을 따라야 합니다, 때문에 준비-사용 상업 stereology 시스템 개발 되었습니다 (검토를 위해 참조 슈 미 츠, 호프, 20054). 전문된 stereology 시스템 디자인-기반 stereological 메서드 구현 선험적 정의 프로브와 샘플링 방식을 모양, 크기, 공간 배급, 및의 방향에서 독립을 이끌어 내는 stereological 평가 분석 된4,9에 셀. 그러나, 상용 stereology 시스템 비싸다; 이 새로운 연구에서 제한할 수 있습니다.
이 연구의 목표는 SN, 광학 fractionator 메서드를 사용 하 고 표준 현미경 장비 (즉, 빛을 사용 하 여 마우스에서 dopaminergic 셀의 디자인 기반 stereological 추정에 대 한 사용 가능한 기술을 개발 했다 현미경, 표준 현미경 소프트웨어 및는 자동화 한 x, y, z 단계). 이 위해, 마우스 뇌 조직 처리 하는 방법과 편견된 stereology 디자인-기반을 사용 하 여 SN 셀 숫자를 예측 하는 방법에 대 한 단계별 가이드를 제시 합니다. 또한, 예상된 셀 숫자의 계산 및 오류 (CE)의 계수에 대 한 템플릿은 제공 합니다.
여기에 설명 된 메서드는 SN의 분석에 국한 되지 않습니다 하지만 마우스 또는 쥐 뇌의 해부학 적 정의 다른 영역에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 편견된 stereology 마10 과 로커 스 coeruleus11신경 세포 숫자를 추정 사용 되었습니다. 또한, 신경, 이다12 와 microglia13, 등 다른 세포 유형 뿐만 평가 될 수 있다. 따라서,이 방법은 그들의 연구에서 편견된 stereology를 구현 하고자 하지만 많은 stereology 시스템을 구입 하는 돈 지출 하고자 하는 과학자에 게 유용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Paxinos mouse atlas</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet &#38; created by Paul Halasz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">brain matrix slicer mouse</td>
			<td style="width:217px;">Zivic Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BSMAS 001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose /D(+) Saccharose&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isopentane</td>
			<td style="width:217px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">3927.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1040931000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32205-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">phosphate buffered saline ingredients:</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1048731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">di-sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1049360500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:217px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A4503-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100-100ml</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0</td>
			<td style="width:217px;">Kem En Tec</td>
			<td style="width:119px;">4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">H2O2/ Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1072090250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">avidin/biotin reagent</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32050</td>
			<td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td style="width:217px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">Ab112</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L</td>
			<td style="width:217px;">vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-1000</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StereoInvestigator version 11.07</td>
			<td style="width:217px;">MBF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BX53 microscope</td>
			<td style="width:217px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Visiview</td>
			<td style="width:217px;">Visitron Systems GmbH</td>
			<td style="width:119px;">3.3.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axiophot2</td>
			<td style="width:217px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:217px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;">Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue-TEK OCT</td>
			<td style="width:217px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dry ice</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">grid overlay plugin</td>
			<td style="width:217px;">Wayne Rasband</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cell counter plugin</td>
			<td style="width:217px;">Kurt de Vos</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">optical disector macro</td>
			<td style="width:217px;">Christopher Ward</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57Bl/6N male mice</td>
			<td style="width:217px;">Charles River, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperFrost Plus coated object slides</td>
			<td style="width:217px;">Langenbrinck, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25G needle Microlance 3</td>
			<td style="width:217px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">REGLO Analog Infusion pump</td>
			<td style="width:217px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM 829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">StereoInvestigator system</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">StereoInvestigator version 11.07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BX53 microscope</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">BX53 microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">self-assorted stereology</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">Visiview</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axiophot2</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">Axiophot2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fractionator and standard microscopy equipment

전 임상 파 킨 슨 병 연구에 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 손실의 정량화를 포함 하 여 nigrostriatal로 분석은 필수적입니다. 총 dopaminergic 신경 세포 숫자를 예상 하려면 편견된 stereology 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 현재 이라고 여겨진다 금 표준. 광학 fractionator 메서드 뒤에 이론은 복잡 하 고 stereology 전문된 장비 없이 달성 하기 어렵습니다, 때문에 필요한 소프트웨어를 포함 하는 여러 상용 완료 stereology 시스템 존재, 순전히 있기 때문에 셀에 대 한 이유를 계산. 이 보고서에 dopaminergic 신경 세포의 stereological 추정 가벼운 현미경을 포함 하 여 표준 현미경 장비를 사용 하 여 계산에 대 한 방법을 설명 합니다 이후 특수 stereology 설치 구입은 항상 가능 하 고, 여러 가지 이유로, 한 이미징 소프트웨어와 분석에 대 한 컴퓨터 개체 테이블 (x, y, z 평면)를 자동화. 단계별 설명은 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 stereological 정량화를 수행 하는 방법에 부여 되 고 예상된 셀 개수 계산에 대 한 사전 프로그램 된 파일 제공 됩니다. 이 방법의 정확도 평가, 하 상용 stereology 장치에서 가져온 데이터에 대 한 비교는 수행 되었다. 유사한 핸드폰 번호가 프로토콜과 stereology 장치를 사용 하 여 따라서 편견된 stereology이이 프로토콜의 정밀도 보여주는 발견 됐다.

제시 방법, 일 + 오른쪽 SN 7,363 및 7,987 세포 사이 원거리로 하 고, SN, 왼쪽에서 dopaminergic 신경의 예상된 번호를 사용 하 여 7,446 및 7,904 세포 사이. 따라서, dopaminergic 신경 (± SEM)의 평균 수 SN 오른쪽과 왼쪽 SN 7,675 ± 66에 대 한 7,647 ± 83 셀 이었다. 각 동물에 대 한 계산 된 CE는 0.08 보다 낮은 (범위: 0.073 0.079) (그림 7). 상업적으로 사용 가능 하 고 전문 ster...

Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment at JoVE.

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

이 작업 표준 현미경 장비 (즉, 가벼운 현미경 자동화 개체 테이블 (x, y, z를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 세포 숫자의 편견된 stereological 추정에 대 한 단계별 프로토콜 제공 비행기), 그리고 디지털 이미지 분석을 위한 공개 소프트웨어.

광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

stereological-estimation-dopaminergic-neuron-number-mouse-substantia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K 조회수.  University Hospital of Würzburg. 이 작업 표준 현미경 장비 (즉, 가벼운 현미경 자동화 개체 테이블 (x, y, z를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 세포 숫자의 편견된 stereological 추정에 대 한 단계별 프로토콜 제공 비행기), 그리고 디지털 이미지 분석을 위한 공개 소프트웨어.

비디오: Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

연구

신경과학

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells or structures. These methods have been revolutionary for quantitative analysis of the mammalian brain, in which volumetric cell populations are too high to count manually, and stereology is now the technique of choice whenever estimates of three-dimensional quantities need to be extracted from measurements on two-dimensional sections. All stereological methods are in principle unbiased; however, they rely on proper knowledge about the structure of interest and the characteristics of the tissue. Stereology is based on Systematic Uniformly Random Sampling (SURS), with adjustment of sampling to the most efficient level in respect to precision, providing reliable, quantitative information about the whole structure of interest. Here we present the optical fractionator in conjunction with BrdU immunohistochemistry to estimate the production and survival of newly-formed neurons in the granule cell layer (including the sub-granular zone) of the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation, which is among the most potent stimulators of neurogenesis. The optical fractionator technique is designed to provide estimates of the total number of cells from thick sections sampled from the full structure. Thick sections provide the opportunity to observe cells in their full 3-D extent and thus, allow for easy and robust cell classification based on morphological criteria. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of the optical fractionator provides accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

Here, we present a stereological method, the optical fractionator, used to quantify the formation of new neurons, and their survival, in the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of stereological methods ensures accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

전기 충격 요법의 쥐 모델에서 세포 수를 추정하기위한 광학적 분별 기 기술

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a useful method to quantify neuronal profiles of various brain structures. Here we provide a software-based stereology protocol to estimate the total length of cholinergic fibers in the nucleus basalis of Meynert (NBM) of the basal forebrain. The method uses a space ball probe for length estimates. The cholinergic fibers are visualized by choline acetyltransferase (ChAT) immunostaining with the horseradish peroxidase-diaminobenzidine (HRP-DAB) detection system. The staining protocol is also valid for fiber and cell number estimation in various brain regions using stereology software. The stereology protocol can be used for estimation of any linear profiles such as cholinoceptive fibers, dopaminergic/catecholaminergic fibers, serotonergic fibers, astrocyte processes, or even vascular profiles.

Neuronal fiber length within a three-dimensional structure of a brain region is a reliable parameter to quantify specific neuronal structural integrity or degeneration. This article details a stereological quantification method to measure cholinergic fiber length within the nucleus basalis of Meynert in mice as an example.

마우스 뇌의 마이너트 핵 기저에서 콜린성 섬유 길이의 입체 추정

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...