This study was supported by the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Project grant 1022839. AJH is an Australian Research Council (ARC) FT3 Future Fellow (FT100100835). The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health acknowledges support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Grant.

NOT: Tüm hayvanlar üzerinde deney prosedürleri Nörobilim &amp; Ruh Sağlığı Hayvan Etik Kurulu Florey Enstitüsü tarafından onaylanmış ve Avustralya&#39;nın Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi uygun edildi bilimsel amaçlar için hayvanların bakımı ve kullanımı için uygulama kodu (7. sürümü yayınlandı 2004). 1. Çevre İşlemler <ol><li> Cinsiyet Eşleştirme <ol><li> Cinsel olgun (&gt; 8 haftalık), yaştaki erkek ve dişi fareler kullanın. NOT: Biz genellikle C57BL / 6 fareler kullanın, ancak bu protokol İsviçre fareleri kullanarak aynı sonuçları vardı. Bu, tipik olarak, n = (n = 4 erkek), n = 2 erkek-erkek çiftler halinde ayrılır, her bir deney için, n = 8 erkek ve n = 8 kadın kullanımı 2 dişi-erkek çiftleri (n = 4 kadın), ve n = 4 erkek-dişi çiftleri (n = 4 erkek ve n = 4 kadın). </li><li> Hayvan tutma tesisi, grup içi içine girişte&gt; 3 gün boyunca cinsiyete göre fareler iklime alıştırmak için. Burada ve Throughout cinsiyet eşleştirme, yabancı çevre uyaranlara tutmak (örneğin ortam sıcaklığı, ışığı: karanlık döngüsü, gıda, su, taşıma ve temizlik) sabit veya tüm farelere eşit dağıtın. </li><li> Rasgele bir erkek-erkek çifti, bir dişi-erkek çifti ya da bir erkek-dişi çifti her bir fare atar. Yiyecek ve su ad libitum giriş ile izole temiz bir kafes (2 fare / kafes) her bir çifti yerleştirin ve sadece 7 gün boyunca sürekli olarak bu şekilde yerleştiren. NOT: Rutin hayvancılık bu dönemde Tamam ama tüm farelere eşit dağıtılmalıdır. Erkek ve kadın littermates eşleştirme önlemek için dikkat edin. </li></ol></li><li> Çevre Zenginleştirme <ol><li> Cinsel olgun (&gt; 8 haftalık), yaştaki erkek ya da dişi farelerin kullanın. NOT: Biz genellikle n = 6 / tedavi grubuna ayrıldı her bir deney için n = 18 fare, kullanın. </li><li> Grup ev sahipliği özdeş standart içinde yer tutmak hayvan tutma tesis haline girişte (SH) (örn </em&gt; 3 gün iklime alıştırmak için&gt; bu aşamada) aşağıdaki koşulları görmek. Burada ve deney boyunca, yabancı çevre uyaranlara tutmak (örneğin ortam sıcaklığı, ışığı: karanlık döngüsü, gıda, su, taşıma ve temizlik) sabit veya tüm farelere eşit dağıtın. </li><li> Çevre zenginleştirme başlamak için, rastgele 3 gruba birine her fare atamak: SH; çalışma tekerleği (RW), ya da ortam olarak zenginleştirilmiş (DT) ve bir araya yiyecek ve su ad libitum giriş ile aynı temiz bir kafes içine, farelerin her bir grubu yerleştirin. NOT: Tüm gruplar için Burada, büyük sıçan tutan kafesleri, 42 cm uzunluğunda, geniş 27 cm boyutlarında, ve derin 16 cm kullanıldı. <ol><li> Buna ek olarak, aşağıdaki çevresel her grup için koşulları sağlamak: katta sadece çöp içeren SH (kağıt pelet ya da talaş); RW içeren SH artı 2 çalışan tekerlekler; EE (halatlar, merdivenler, tüneller ve boş kağıt havlu ruloları ve doku kağıt parçaları gibi nesneleri) RW artı oyuncaklar içeren hangi explore, oyun, tırmanma, gizlemek, ve yuva. </li><li> 14 gün boyunca sürekli bu şekilde onları ev. NOT: Rutin hayvancılık bu dönemde Tamam ama tüm farelere eşit dağıtılmalıdır. </li></ol></li><li> 1 saat / gün (aynı saatte her gün), 5days / hafta yeni oyuncaklar içeren daha geniş bir kafese araya koyarak ek &#39;süper-zenginleştirme&#39; (SE) tabi EE fareler. NOT: Burada, 46 cm genişliğinde 69 cm uzunluğunda ve 40 cm derinliğinde plastik küvet kullanıldı. <ol><li> Oyuncakların farklı bir dizi her oturum sunarak yenilik koruyun. Temiz oyuncaklar sabunlu su ve kokular kaldırmak için% 80 etanol ile farelere yeniden sunulmak üzere. </li><li> Her SE oturumunu takiben, kendi EE kafesine fareler dönün. Kolu SH ve RW fareler bu dönem boyunca (SE kendisi hariç) SE fareler aynı (örneğin kaldırmak ve gelen ve kafesine her SH ve RW fareyi dönüş). </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> Hazırlık <ol><li> Piyasada mevcut olan steril ozmotik pompalar ve beyin infüzyon kitleri kullanın. implantasyon gün önce, aseptik teknik kullanılarak, her bir pompa dolum (pompalar birlikte verilen talimatlara açıklandığı gibi), steril ilaç veya araç solüsyonu ile tüp ve kanül bağlayarak Başbakan implantlar. Birbirine geç ve 37 ° C&#39;de gece boyunca steril tuzlu su içinde inkübe edilir. Çapraz bulaşmayı önlemek için ayrı ayrı ilaç ve araç-dolu implantlar inkübe. </li></ol></li><li> Cerrahi. NOT: deneyci ülkeye bağlı olarak, özel hayvan deneyleri izin veya ödenekleri cerrahi ve ameliyat sonrası deneyler bu tip sürdürmeye gerekmektedir. <ol><li> Tüm cerrahi ekipman sterilize ve aseptik boyunca teknik kullanır. (Örneğin havada% 1-2 isofluorane kullanarak) bir fare anestezisi ve bir stere yerleştirinotaxic Headframe. Prosedür boyunca anestezi derinliğini kontrol edin ve gerekirse daha fazla anestezi yönetmek (zararlı pençe tutam bacak çekilmesi örneğin yokluğu yeterli anestezi göstergesidir). Emin olun gözler yağlayıcı göz merhemi ile kuruma karşı korumalıdır ve farenin vücut ısısı prosedürü boyunca normal kalmasını edilir. </li><li> Cm kafatasının arka kenarına posterior 2 gözü arasında ve bitirme başlayarak deri yoluyla orta hat kesi yapmak. Rahat pompayı ve kanül (bağlantı tüpü bitiminde bükük olmamalı) implante bir kez bağlantı tüpü sığacak kadar büyük bir subkutan &#39;cep&#39; oluşturmak için uzak fare arka aşağı yatan fasya cilt teşrih künt. Kafatasının dorsal yerinden fasya temizlemek kazıyın. </li><li> , Yaklaşık 1.5 mm çapında diş çapak kullanarak uygun stereotaksik u koordinatları kafatası içine detayantil kemik ince, esnek bir tabaka kalır. Peel uzakta ince forseps kullanarak bu katman (bu diş çapak ile yatan dura mater ve beyin zarar önler). Emin olun kafatası herhangi bir kan ve kemik parçalarının temizlenmesi ve olduğunu başka kanıyor. </li><li> Bir kanül sahibi tarafından düzenlenen kanül ile, farenin sırtını örten deri altı &#39;cebine&#39; içine pompa ve bağlantı tüpü yerleştirin. Sonraki uygun stereotaksik koordinatlarda ve beynin yüzeyinde kanül ucu yerleştirin. Dikkatle beyin içine kanül düşük ama gerekli derinlik kısa yaklaşık 1 mm durdurun. NOT: Kalan derinliği diş akrilik ilk katman uygulanması aşağıdaki müzakere edilecektir. </li><li> Kafatasının yüzeyi temiz ve kuru olduğundan emin olun tekrar, daha sonra diş akrilik küçük bir hacim hazırlamak ve th etrafında kafatası yoluyla çapak-deliğe dahil, kafatası tüm maruz alanın üzerine düzeltmek için bir kürdan kullanınE kanül. Akrilik sertleşir önce, kanül hedef haline kalan derinliğini ucu düşük. </li><li> Yerinde kanül düzeltmek için, kanül beyaz plastik desteği üzerinde yanı sıra, diş akrilik başka küçük hacimli hazırlayın ve ilk aşkın bu katmanı. Gerektiğinde akrilik ilave tabakalar ile tekrarlayın. </li><li> Akrilik sertleştikten sonra, dikkatle kanül tutucusunu çıkarın ve bir bütan alev ile ısıtılan bir neşter bıçak kullanarak beyaz plastik çıkarılabilir kanül sekmesini kesti. Son olarak, tüm implant üzerinde kapalı cilt sütür. </li></ol></li><li> Hayvanların Post-cerrahi Tedavi <ol><li> Cilt marjları antiseptik merhem sürün ve fare bir anti-inflamatuar yönetmek (örn Meloksikam, 3 mg / kg sc). , Çerçeve fareyi çıkarın ısı lambası altında yerleştirin, ve bilinç kavuşur kadar gözlemlemek. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir fare iade etmeyin. NOT: Uzmcinsiyet eşleştirme ve çevre zenginleştirme gibi erimental manipülasyonlar başlatılan veya erken ameliyat ertesi gün devam edilebilir. </li><li> Kendi vücut ağırlığı, günlük genel davranış ve görünüm izleyin. Topikal antiseptik merhem cerrahi kesiler etrafında enfeksiyon belirtileri (örn şişlik, kızarıklık, irin) davranın. Gerektiğinde sistemik analjezikler ve / veya antibiyotik ile herhangi bir belirti hastalık, ağrı, stres veya rahatsızlık (&gt;% 10 vücut ağırlığı, sosyal geri çekilme, damat eksikliği örneğin kaybı, &quot;kabartmak&quot;, hareket disfonksiyon, nöbetler) davranın. </li><li> &gt;% 15 kilo kaybı ya da hastalık, ağrı, stres veya rahatsızlık belirtileri iyileştirici tedavi 1 hafta içinde olmayan geri kazanılabilir ise fareler Euthanize. </li></ol></li></ol> 3. Beyin Doku Hazırlama, İşleme İmmunohistokimyasal ve Stereoloji <ol><li> Serpilme <ol><li> Hemen çevre / ilaç manipülasyonlar takip, çalışma için beyin hazırlamak. <br/&gt; Not: Burada bildirilen deneylerde SNc TH + nöron sayısı ölçülmüş ve farklı tedavi gruplarının her karşılaştırıldı. </li><li> İlk (örneğin 100 mg / kg ip sodyum pentobarbiton) fareler öldürmek için anestezik aşırı dozda yönetmek. Bir kez anestezi ancak kalp yenerek durur önce, sırtında fare yatıyordu ve kravat ya da her iki ön ayakları aşağı pin. </li><li> Bir neşter kullanılarak toraks sonra karın boşluğuna sadece göğüs kafesinin altındaki kas yoluyla insizyon örten cilt kesip. Göğüs kafesi kılıç şeklinde süreci bir kelepçe yerleştirin ve diyaframı açığa karaciğer yukarı ve uzağa göğüs kafesi kaldırın. </li><li> Diyafram yoluyla ve yanal göğüs kafesi geri akciğerler ve kalbi maruz başının üzerinde katlanabilir kadar büyük makas kullanarak her iki tarafta kaburga kesti. İnce makas bir çıkış kan nokta ve perfüze çözümleri gibi sağ atrium küçük bir kesi yapmak kullanarak, daha sonra sol grupların sol ventrikül tabanı kesticle ve sol ventrikül, sol atrium aracılığıyla bir kanül yerleştirin ve aort içine. </li><li> Heparinize sıcak (37 ° C) pompa sonra yerinde kanül Kelepçe ve sağ atrium çıkan çözelti kadar damar yoluyla 0.1 M fosfat tamponlu fizyolojik tuzlu su (PBS) kan tamamen ücretsizdir. Tüm fare de sabit kadar sonra, damar yoluyla soğuk (4 ° C) sabitleştirici solüsyonu (PBS gibi% 4 paraformaldehid) pompa. Beyin lavabolar kadar 2-3 gün süreyle% 30 sakaroz ile PBS beyin ve yer çıkarın. Not: Doku hazırlanması için daha başka türlü ilgili laboratuarda uzmanlık bağlı olarak tatbik edilebilir. </li></ol></li><li> Serbest yüzen kriyokesitler hazırlanması <ol><li> Ilgi beyin bölgeleri ile seri bölümleri kesin ve PBS bu toplamak. NOT: Bir sirostat kullanılarak 40 mikron kalınlığında kesitler kesti. Doku kesit diğer tipleri correspondi uzmanlık bağlı olarak uygulanabilecekng laboratuvar. </li></ol></li><li> İmmünohistokimya <ol><li> Ilgi proteinlerin için standart immunohistokimyasal gerçekleştirin. 48 saat süre ile 4 ° C&#39;de (400 1) sonra, poliklonal biyotinlenmiş keçi anti-poliklonal tavşan anti-TH ile, daha sonra 30 dakika için immüno-reaksiyona girme oda sıcaklığında PBS içinde% 5 normal keçi serumu ve% 0.3 Triton X-100 bölümleri inkübe 2 saat süre ile, oda sıcaklığında: -rabbit (1.000 1). </li><li> 18-20 dakika boyunca oda sıcaklığında ve daha sonra, kobalt ve nikel yoğun diamino-benzidin (0.5 mg / ml) &#39;de, 1 saat boyunca oda sıcaklığında;: Daha sonra, avidin peroksidazı (1: 500) inkübe diamino-benzidin inkübasyon son 3-5 dakika boyunca Chromagen çökelmesini katalize etmek üzere hidrojen peroksit (% 0.01) ilave edin. Önce, sonra ve yukarıdaki adımların her biri arasında PBS bölümleri 10 dakika süreyle üç kez her yıkayın. </li><li> Daha sonra, hava onları kurutun, jelatinize mikroskop slaytlar üzerinde Nissl leke (nötr kırmızı) bölümleri monte, alkol, berrak (X-3B) ve lamel içinde kurutmak. </li></ol></li><li&gt; Stereoloji <ol><li> Tarafsız stereolojik yöntemlerle TH + ve TH- SNc (ve VTA ve LC) nöronların toplam sayısını tahmin edin. Stereologist alınan tedaviye kör olduğundan emin olun. Soma çapı &lt;5 mikron bazında glia Dışlama ve görünür bir çekirdeğin yalnızca bu hücreleri saymak. </li><li> TH + hücreleri ve Paxinos ve Watson 7 beyin atlası göre anatomik noktalar / sınırları mekansal konumlara göre SNC (ve VTA ve LC) tanımlayın. (X = 100 mm, y = VTA ve LC 100 mm x = y 140 mikron = SNc için 140 mikron) düzenli önceden belirlenmiş aralıklarla sayma çerçevesinde TH + hücreler (55 x 55 mm = 3025 mm 2) Sayım Her Dördüncü bölümde her çekirdeğin boyunca. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Aumann, T., Horne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+the+dopamine+phenotype+in+substantia+nigra+neurons.">Activity-dependent regulation of the dopamine phenotype in substantia nigra neurons.</a> Journal of neurochemistry. 121, 497-515 (2012).</li><li>Sauer, H., Oertel, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+nigrostriatal+dopamine+neurons+following+intrastriatal+terminal+lesions+with+6-hydroxydopamine:+a+combined+retrograde+tracing+and+immunocytochemical+study+in+the+rat.">Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat.</a> Neuroscience. 59, 401-415 (1994).</li><li>Stanic, D., Finkelstein, D. I., Bourke, D. W., Drago, J., Horne, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timecourse+of+striatal+re-innervation+following+lesions+of+dopaminergic+SNpc+neurons+of+the+rat.">Timecourse of striatal re-innervation following lesions of dopaminergic SNpc neurons of the rat.</a> The European journal of neuroscience. 18, 1175-1188 (2003).</li><li>Aumann, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+regulates+expression+of+tyrosine+hydroxylase+in+adult+mouse+substantia+nigra+pars+compacta+neurons.">Neuronal activity regulates expression of tyrosine hydroxylase in adult mouse substantia nigra pars compacta neurons.</a> Journal of neurochemistry. 116, 646-658 (2011).</li><li>Aumann, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SK+channel+function+regulates+the+dopamine+phenotype+of+neurons+in+the+substantia+nigra+pars+compacta.">SK channel function regulates the dopamine phenotype of neurons in the substantia nigra pars compacta.</a> Experimental neurology. 213, 419-430 (2008).</li><li>Aumann, T. D., Tomas, D., Horne, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+behavioral+modulation+of+the+number+of+substantia+nigra+dopamine+neurons+in+adult+mice.">Environmental and behavioral modulation of the number of substantia nigra dopamine neurons in adult mice.</a> Brain and behavior. 3, 617-625 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Schultz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+dopamine+signals.">Behavioral dopamine signals.</a> Trends in neurosciences. 30, 203-210 (2007).</li><li>Sun, P., Smith, A. S., Lei, K., Liu, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+bonds+in+male+prairie+vole:+long-term+effects+on+emotional+and+social+behavior,+physiology,+and+neurochemistry.">Breaking bonds in male prairie vole: long-term effects on emotional and social behavior, physiology, and neurochemistry.</a> Behavioural brain research. 265, 22-31 (2014).</li><li>Aponso, P. M., Faull, R. L., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+progenitor+cell+proliferation+and+astrogenesis+in+the+partial+progressive+6-hydroxydopamine+model+of+Parkinson's+disease.">Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 151, 1142-1153 (2008).</li><li>Frielingsdorf, H., Schwarz, K., Brundin, P., Mohapel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+new+dopaminergic+neurons+in+the+adult+mammalian+substantia+nigra.">No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10177-10182 (2004).</li><li>Lie, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+substantia+nigra+contains+progenitor+cells+with+neurogenic+potential.">The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6639-6649 (2002).</li><li>Chen, Y., Ai, Y., Slevin, J. R., Maley, B. E., Gash, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+proliferation+in+the+adult+hippocampus+and+substantia+nigra+induced+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor.">Progenitor proliferation in the adult hippocampus and substantia nigra induced by glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Experimental neurology. 196, 87-95 (2005).</li><li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibility+for+neurogenesis+in+substantia+nigra+of+parkinsonian+brain.">Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain.</a> Ann Neurol. 58, 31-40 (2005).</li><li>Shan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+de+novo+neurogenesis+and+dopaminergic+neurogenesis+in+the+substantia+nigra+of+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced+Parkinson's+disease-like+mice.">Enhanced de novo neurogenesis and dopaminergic neurogenesis in the substantia nigra of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease-like mice.</a> Stem Cells. 24, 1280-1287 (2006).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neurogenesis+in+the+adult+mammalian+substantia+nigra.">Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7925-7930 (2003).</li><li>Baker, H., Kawano, T., Margolis, F. L., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transneuronal+regulation+of+tyrosine+hydroxylase+expression+in+olfactory+bulb+of+mouse+and+rat.">Transneuronal regulation of tyrosine hydroxylase expression in olfactory bulb of mouse and rat.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 3, 69-78 (1983).</li><li>Black, I. B., Chikaraishi, D. M., Lewis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-synaptic+increase+in+RNA+coding+for+tyrosine+hydroxylase+in+a+rat+sympathetic+ganglion.">Trans-synaptic increase in RNA coding for tyrosine hydroxylase in a rat sympathetic ganglion.</a> Brain research. 339, 151-153 (1985).</li><li>Zigmond, R. E., Chalazonitis, A., Joh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preganglionic+nerve+stimulation+increases+the+amount+of+tyrosine+hydroxylase+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Preganglionic nerve stimulation increases the amount of tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion.</a> Neuroscience letters. 20, 61-65 (1980).</li><li>Biguet, N. F., Rittenhouse, A. R., Mallet, J., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preganglionic+nerve+stimulation+increases+mRNA+levels+for+tyrosine+hydroxylase+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Preganglionic nerve stimulation increases mRNA levels for tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion.</a> Neuroscience letters. 104, 189-194 (1989).</li><li>Richard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tyrosine+hydroxylase+gene+expression+in+rat+brain+and+adrenals+by+exposure+to+cold.">Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold.</a> Journal of neuroscience research. 20, 32-37 (1988).</li><li>Schalling, M., Stieg, P. E., Lindquist, C., Goldstein, M., Hokfelt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+increase+in+enzyme+and+peptide+mRNA+in+sympathetic+ganglia+after+electrical+stimulation+in+humans.">Rapid increase in enzyme and peptide mRNA in sympathetic ganglia after electrical stimulation in humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4302-4305 (1989).</li><li>Liaw, J. J., He, J. R., Barraclough, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+tyrosine+hydroxylase+mRNA+levels+in+A1,+A2+and+locus+ceruleus+neurons+following+electrical+stimulation+of+A1+noradrenergic+neurons.">Temporal changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in A1, A2 and locus ceruleus neurons following electrical stimulation of A1 noradrenergic neurons.</a> Brain research. Molecular brain research. 13, 171-174 (1992).</li><li>Watabe-Uchida, M., Zhu, L., Ogawa, S. K., Vamanrao, A., Uchida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+mapping+of+direct+inputs+to+midbrain+dopamine+neurons.">Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 74, 858-873 (2012).</li><li>Tepper, J. M., Lee, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+control+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">GABAergic control of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Progress in brain research. 160, 189-208 (2007).</li><li>Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+and+brain+repair:+harnessing+the+therapeutic+effects+of+cognitive+stimulation+and+physical+activity+to+enhance+experience-dependent+plasticity.">Environmental enrichment and brain repair: harnessing the therapeutic effects of cognitive stimulation and physical activity to enhance experience-dependent plasticity.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 40, 13-25 (2014).</li><li>Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+environments,+experience-dependent+plasticity+and+disorders+of+the+nervous+system.">Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).</li><li>Chmiel, D. J., Noonan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preference+of+laboratory+rats+for+potentially+enriching+stimulus+objects.">Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects.</a> Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).</li><li>Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+runway+paradigm+to+assess+the+relative+strength+of+rats'+motivations+for+enrichment+objects.">Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects.</a> Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).</li><li>Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions+and+construct+validity+in+preclinical+models+of+psychiatric+disorders.">Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders.</a> Progress in neuro-psychopharmacology &amp; biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).</li><li>Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+of+preference+for+nesting+material+as+environmental+enrichment+for+laboratory+mice.">Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice.</a> Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).</li><li>Rampon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+on+gene+expression+in+the+brain.">Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).</li><li>Eckert, M. J., Abraham, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+exposure+on+synaptic+transmission+and+plasticity+in+the+hippocampus.">Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus.</a> Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).</li><li>Sztainberg, Y., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmental+enrichment+model+for+mice.">An environmental enrichment model for mice.</a> Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).</li><li>Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+brain+plasticity:+towards+an+endogenous+pharmacotherapy.">Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy.</a> Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Çevre manipülasyonlar Bu çevresel manipülasyonlar (cinsiyet eşleştirme ve çevresel zenginleştirme) tasarım arkasındaki motivasyon ortamına olup olmadığını belirlemek için, ve / veya çevre tarafından istendiğinde davranış, orta beyin DA nöronların sayısında değişiklikler ile ilişkilidir. Odak ortamları sağlanması ve orta beyin DA sinyal meşgul muhtemel davranışları uyarıcı nedenle oldu. Bu karşı cinse dahil eşleştirme, ve,, oyun keşfetmek tı...

Ortabeyin ventral tegmental alan (VTA) ve substantia nigra pars compactadaki (SNc) nöronların tarafından DArgic sinyal ödül motive bilişsel, duygusal ve motor davranışlar için önemli olduğu düşünülmektedir. Ancak, çok fazla veya çok az orta beyin DA sinyal birçok devre dışı nörolojik bozukluklar çeşitli belirtileri (örneğin Parkinson hastalığı, dikkat eksikliği ve hiperaktivite bozukluğu, şizofreni, ve uyuşturucu bağımlılığı) neden olur. Artırmak veya DA bu belirtileri hafifletmek sinyalizasyon azaltan ilaçlar, ancak onlar da düzensiz sinyal atfedilebilecek yan etkileri ve hedef dışı etkiler üretmek. İlaç etkinliği, aynı zamanda, beynin telafi tepkiler zamanla azalır. Bu bakımdan, bir daha hedefli ve fizyolojik şekilde normal orta beyin DA sinyal geri ve bir tercih yaklaşım artan ya da orta beyin DA nöron sayısını azaltarak gereğidir. Kanıt sev için biriken edilmiştir(1 gözden) olgun yetişkin hücrelerde metabolize ve ticareti DA ve diğer katekolaminlerin yer alan genlerin ve proteinlerin ifadesi değiştirilebilir olduğunu eral yıl. TH immunonegative (TH-) nöron sayısı karşısında modelini gösterir iken orta beyin, tirozin hidroksilaz immünopozitif sayısı (TH + DA sentezi, oran-sınırlayıcı enzim) nöron sonra, (örneğin, bir artış nörotoksin verilmesini 2,3 aşağıdaki da artar sonra) 3 azalır. Bu daha sonra bazı hücreler tarafından &#39;DA fenotip&#39; bir kazanç kaybı ile tutarlıdır. TH + ve TH- SNc nöronların sayısı da bu hücrelerin 4,5 elektrik aktivitesini değiştirmeyen farklı tedavilerin ardından eşit fakat ters yönde değiştirmek için gösterilmiştir. Örneğin, 2 hafta boyunca orta beyin içine küçük iletkenlik enfüzyon, kalsiyum ile aktive edilen potasyum (SK) kanalı antagonisti apamin (aynı miktarda) nu TH + ve artar sayısını azaltmaktadırTH- SNc ve mber 4,5 nöronlar. Buna karşılık, SK kanal agonisti 1-EBIO infüzyon TH + sayısını artırır ve (aynı tutarda) TH- SNc nöronlar 4,5 sayısını azaltır. Benzer değişiklikler, afferent girişi 4 hedef olan de dahil olmak üzere SNc nöronal aktivitenin, hedefleme çeşitli uygulamalar aşağıdaki görüldü. Nöronal aktivitenin ve afferent tarafından SNc DArgic nöronların sayısının bu bariz düzenleme ortamı veya davranış SNc nöron sayısını etkileyebilir olasılığını yükseltir. Farklı ortamlara maruz kalan Gerçekten de, yetişkin fareler daha az ya da orta beyin (SNc VTA) TH + nöronlar ve bu ortam ile endüklenen değişikliklerin en azından bir orta beyin 6 sinaptik giriş eşzamanlı ablukası ile ortadan kaldırılamaz sahiptir. (1) çevresel manipülasyonlar ve ilaç infüzyonu nasıl uygulanacağı konusunda daha fazla ayrıntı sağlamak;: Bu iletişim amaçları vardır ve (2) e bizim çekişme destekleyen daha fazla veri sağlamakbütünlüklü afferent yoluyla, orta beyin DA nöron sayısını düzenler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1300">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:636px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:636px;">Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td>
			<td style="width:119px;">AHN3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET Osmotic pump 1002</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0004317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET Brain infusion kit 1</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0004760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET cannula holder 1</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0008860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent)</td>
			<td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Vertex Self Curing (dental acrylic powder)</td>
			<td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">METACAM (Meloxicam)</td>
			<td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia</td>
			<td style="width:119px;">L10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Sodium Pentobarbitone</td>
			<td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia</td>
			<td style="width:119px;">571177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Normal goat serum</td>
			<td>chemicon-temecula, CA</td>
			<td style="width:119px;">S26-Litre</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck Millipore Headquarters&#160;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td>
			<td style="width:119px;">1.08603.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase</td>
			<td>Merck Millipore Headquarters&#160;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td>
			<td style="width:119px;">AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit</td>
			<td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td>
			<td style="width:119px;">EO432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avidin peroxidase</td>
			<td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td>
			<td style="width:119px;">A3151-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamino-benzidine</td>
			<td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td>
			<td style="width:119px;">D-5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Investigator</td>
			<td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

environmental modulations of the number of midbrain dopamine neurons in adult mice

Beyin veya beyin plastisite &#39;Uzun süreli değişiklikler hastalık ya da yaralanma aşağıdaki uyarlamalı davranış ve beyin onarımı altında yatan. Ayrıca, bizim çevre ile etkileşimleri beyin plastisite neden olabilir. Giderek, araştırma beyin ve davranış bozuklukları tedavisinde yararlı beyin plastisite teşvik hangi ortamlar belirlemek için çalışıyor. İki çevresel manipülasyonlar açıklanan hangi artırmak veya yetişkin fare orta beyindeki nöronlar tirozin hidroksilaz immünopozitif sayısını (TH +, dopamin (DA) sentezinde hız kısıtlayıcı enzim) azaltın. İlk eşleştirme erkek ve birlikte sürekli erkeklerde yaklaşık% 12 oranında orta beyin TH + nöronlar artar 1 hafta için dişi farelerin içermektedir, ancak kadınlarda yaklaşık% 12 oranında orta beyin TH + nöronlar azaltır. İkinci vb çalışan tekerlekleri, oyuncaklar, halatlar, yuvalama malzeme, içeren &#39;zenginleştirilmiş ortamlarda&#39; (EE) 2 hafta boyunca sürekli konut fareler içermektedir ierkeklerde yaklaşık% 14 oranında orta beyin TH + nöronlar ncreases. Ayrıca, bir protokol eş zamanlı çevre kaynaklı beyin plastisite altında yatan mekanizmaları belirlemek yardımcı olmak için bu çevresel manipülasyonlar sırasında doğrudan orta beyin içine uyuşturucu beslerken için tarif edilmiştir. Örneğin, daha orta beyin TH + nöronların EE-indüksiyon orta beyin nöronlar üzerine sinaptik girdi eşzamanlı ablukası tarafından kaldırılmıştır. Birlikte, bu veriler çevre ile ilgili bilgiler veya &#39;DA&#39; genlerin ifadesi kapatmak için orta beyin nöronların sinaptik giriş üzerinden geçirilen olduğunu göstermektedir. Böylece, altta yatan mekanizmaların hedef uygun çevresel stimülasyon ya da ilaç, orta beyin DA dengesizliklerin ile ilişkili beyin ve davranış bozuklukları tedavisinde yararlı olabilir (örn Parkinson hastalığı, dikkat eksikliği ve hiperaktivite bozukluğu, şizofreni, ve uyuşturucu bağımlılığı).

Bu çevresel manipülasyonlara maruz Yetişkin fareler orta beyin numaralarını (SNc ve VTA), ancak LC değiştirmiştir, TH + nöronlar, EE artı pikrotoksin veya bicuculline ya eşzamanlı orta beyin infüzyon (GABA A reseptör antagonistleri) ve EE-indüksiyon ortadan kaldıran daha SNc TH + nöronlar. Bu veriler, daha önce 6 yayınlandı. Mevcut veriler bir önceki çalışmanın bir parçası olarak gerçekleştirilen tekrarlanan deneylerde derlendi, ama başka bir yerde yayınlanmamış olm...

Watch this Scientific Journal Video about Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice at JoVE.com

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Yetişkin Farelerde Orta beyin dopamin Nöronlar Sayısının Çevre Modülleri

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

environmental-modulations-number-midbrain-dopamine-neurons-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Görüntüleme.  The University of Melbourne. This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Video: Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Dinamik Kelepçe Tekniği ile Sıçan orta beyin dopaminerjik nöronlar NMDA Reseptör İletkenlik Uygulama

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Nörobilim

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Yetişkin doğmuş Nöronlar Entegrasyon incelenmesi

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membran Yetişkin farelerin ventromedial Hipotalamus Nöronlar Potansiyel Boya Görüntüleme Glikoz Algılama Çalışması için

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

Dopaminerjik Homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi ve Synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

Farklı bölge ve lamina gelişmekte olan ve yetişkin beyninin ortaya çıkarmak için sinaptik çinko Histochemistry kullanımı

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...