Yazarlar, minnetle Doğa Bilimleri ve mühendislik araştırma (NSERC) Kanada Konseyi ekipman hibe HPLC, Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (CIHR) ve Kanada meme kanseri araştırma (CBCR) çalışma hibe için kabul İttifak X.Y Wu ve Toronto Üniversitesi Burs R.X. Zhang ve T. Zhang.

tüm hayvan deneyleri hayvan bakım komitesi, üniversite sağlık ağı Ontario Kanser Enstitüsü tarafından onaylanmış ve hayvan bakım kuralları Kanada Konseyi uyarınca yürütülen.
 1. biyolojik örnek hazırlık <ol><li>tam kan, büyük organları toplamak ve önceden belirlenmiş zaman-Puan Intravenous (IV) yönetim uyuşturucu içeren sonra meme tümör (örneğin, formülasyonları DMPLN, liposomal DOX) <ol><li>meme tümörü taşıyan fare damardan uyuşturucu içeren hazır formülasyonu ile enjekte.</li>
		<li>İnhalable % 2 isoflurane mühürlü bir odasında vererek belirlenen zaman-noktalarda (örneğin, 15dk) fare anestezi.</li>
		<li>Sırtında imzalat fare yatıyordu ve burnunu sürekli % 2 isoflurane sağlayan bir yangın gövdeler koymak. 
		Not: fare uğrar derin anestezi emin olmak için yavaşça çimdik fare ve tat herhangi bir hareket için bir görünüm ön bacaklarda.</li>
		<li>% 70 etanol kullanarak göğüs ve karın bölgeleri iyice temizleyin ve sonra heparinized 1 mL şırınga ve 23 G iğne kullanarak derin imzalat fareler üzerinde kalp ponksiyon terminal bir yordamı gerçekleştirin.</li>
		<li>Toplamak tam kan içine etiketli bir sodyum heparin plastik tüp püskürtülür ve yavaşça toplanan tam kan ile temas tüpü duvardaki heparin kaplı gelir sağlamak için tüp girdap. En az 50 µL bütün kan toplamak. Her zaman buz üzerinde örnekleri devam</li>
		<li>Güvenli ve açık belgili tanımlık karın ve göğüs kafesi bir çift makas ve forseps kullanarak fare fare tüm dört bacaklarda teyp. Bağırsak tarafına kayması ve yukarı doğru yeterince portal ven ortaya çıkarmak için karaciğer itin. Kan drenaj için portal ven kesti.</li>
		<li>Sıvı buz gibi % 0,9 serum 25 G iğne ile 10 mL şırınga kullanarak kalbine tüm fare gövdesi ile 50 mL. 
		Not: iğne şırınga portal ven rehberlik için 90 ° dirsek.</li>
		<li>Tüketim organlarda birini sipariş: kalp, akciğer, karaciğer, dalak, böbrekler. O zaman, meme tümör çevresindeki bağ dokusu fareyi sağ meme yağ yastığı kesi makas kullanarak ayırmak. Tüm organlarının ayrı ayrı 1,5 mL polipropilen tüpler içine toplamak ve hızlı bir şekilde onları sıvı azot içinde dondurma. 
		&#8203; Not: safra kesesi Karaciğer ayırın.</li>
		<li>4 ° C ve çıkarılan doku tam kan-80 ° C dondurucuya kadar daha sonra HPLC analiz depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Ayıklamak DOX, MMC ve biyolojik matrisler DOXol.
	<ol><li>Tüm donmuş disseke dokularda hızla tartmak ve 13 mL yuvarlak alt konik tüp içine aktarabilirsiniz. Uyuşturucu metabolizma veya yıkımı önlemek için örnekleri üzerinde buz tutmak</li>
		<li>Ekleyin buz gibi hücre lizis arabellek 1-5 mL tüp içine. 
		Not: 1 g: 5 mL (w/v); doku-tampon oranına dayanarak doku ağırlık kullanmak için arabellek hacmi bağlıdır kalp ve dalak, gibi küçük organları için 1 g: oranıdır 2 mL.</li>
		<li>Doku örnekleri, bir elektrikli el homogenizer kullanarak 18.000 rpm hızında buzda homojenize için bir yukarı-aşağı inme hareket kullanın. 
		Not: Tamamlanan homojenizasyon kısa homojenizasyon işlemi daha az 15 yaklaşık 3-5 yinelemelerini gerektirir s, her kısa homojenizasyon arasında buz üzerinde soğutma doku ardından.</li>
		<li>Homogenizer distile deiyonize (DDI) H 2 O, % 70 etanol ve DDI H 2 O çapraz bulaşma kaçınmak için her doku örneği arasında 10 mm testere dişli jeneratör probe yıkayın.</li>
		Bir iç standart (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) tüp içine <li>transfer 50 µL doku homogenate veya tam kan bir 1,5 mL polipropilen mikro-santrifüj tüpü ve 5 Spike'la µL. 
		Not: 4-MU çözüm burada metanol hazırlanmıştır.</li>
		<li>Bir buz gibi ayıklama çözücü tam kan veya doku homogenate içeren tüp içine eklemek 250 µL. 
		Not: pH için ayarlanır pH ile % 60 Asetonitril (ACN) ve % 40 amonyum asetat (5 mM) çıkarma solvent oluşur 3.5 = %0,05 formik asit kullanarak. 1:5 (v/v) örneği kullanmak: hacim oranı için solvent ekstraksiyon.</li>
		<li>Şiddetle girdap karışımı için 2 dk, 3000 x 4 o C, g kuvvet, santrifüj 10 dk ve damlalıklı 200 µL başka bir önceden soğutulmuş taze mikro-santrifüj tüpüne süpernatant.</li>
		<li>Buharlaştırılarak süpernatant azot gazı ışık koruma ile yavaş bir akarsuyun altında 60 ° C'de.</li>
		<li>Buz gibi metanol, 30 s ve 3000 x g başka bir 5 dakika süreyle 4 ° C'de, santrifüj için şiddetle girdap 100 µL ile kurumuş kalıntı sulandırmak</li>
		<li>Örnek şişeleri enjeksiyon için bir Otomatik Örnekleyici tepsisine yerleştirin ve süpernatant HPLC şişe sokmak içine transfer.</li>
	</ol></li></ol> 2. HPLC araçları ve işlem parametrelerini <ol><li>HPLC hazırlamak cep fazlı tutarlı tekrarlanabilirlik ile <ol><li>500 mL HPLC sınıf H 2 O mezun silindir kullanarak ölçmek.</li>
		<li>Ölçmek ayrı bir mezun silindir kullanarak HPLC sınıf Asetonitril (ACN) 500 mL.</li>
		<li>Dikkatle her 500 mL H 2 O içine trifluoroacetic asit (TFA) (dikkat) 0.5 mL ekleyin ve ACN H 2 O mobil faz elde etmek için ve % 0.1 içeren ACN TFA, sırasıyla. 
		Not: TFA aşındırıcı ve toksik ve laboratuvar duman başlık altında ele alınmalıdır. Tüm çözücü karışımları oda sıcaklığında hazır mısınız.</li>
		<li>Naylon membran filtre 0,45 µm ile mobil aşamalardan filtre boyutu gözenek ve temiz HPLC rezervuar şişe transfer.</li>
	</ol></li> <li>Kurulum HPLC araçları aynı anda DOX, MMC ve DOXol ve I.S. 4-MU algılanması için.
	<ol><li>Degrade pompa, de-gasser, Otomatik Örnekleyici, fotodiyot dizi dedektörü ile multi λ Floresans Dedektör üzerinde geçiş.</li>
		<li>Mobil faz kompozisyon %16,5 H 2 O başlangıç koşullarını giriş (% 0,1 TFA) ve %83.5 ACN (% 0,1 TFA) (v/v).</li>
		<li>310 adlı iki kanaldaki UV dedektörü ayarla nm 4-MU (I.S.) için ve diğer 360 nm MMC için.</li>
		<li>λ ex adlı iki kanaldaki Floresans dedektörü ayarla / λ em 365/445 = nm 4-MU ve diğer λ ex at için / λ em 480 nm/560 nm DOX ve DOXol, sırasıyla =.</li>
		<li>1.0 mL/dak bir isocratic akış hızı ayarla</li>
		<li>Temel kuruluş için 10 dakika oda sıcaklığında bir önceden yüklenmiş ters faz C 18 sütun (4.6 mm x 250 mm, 5 µm) equilibrate.</li>
	</ol></li> <li>Ayrı uyuşturucu (DOX, MMC, DOXol ve 4-MU) degrade cep fazlı koşulu kullanarak.
	<ol><li>Enjekte 15 µL otomatik örnekleyici kullanarak örnekleri ayıklanan ve yeniden konsantre.</li>
		<li>Yavaş yavaş ilk mobil faz durumu değiştirmek (2.2.2 Protokolü adıma bakın) %100 ACN (% 0,1 TFA) üzerinde 18 dk otomatik degrade pompa kullanarak. 
		Not: ayırma işlemi sırasında dört kanal (iki UV emici ve iki floresan) aynı anda bir uyuşturucu bileşik görüntüleme her kanal ile görünür (iletişim kuralı adıma 2.2.3 ve 2.2.4 başvurun).</li>
		<li>Korumak %100 ACN (% 0,1 TFA) 1 dk ve 1 dk. içinde ilk mobil faz durumuna sonra dönüş için</li>
		<li>İlk mobil aşamasında Debi 1.5 mL/dk 4 dk için sonraki örnek enjeksiyon için sütunu yeniden durum.</li>
	</ol></li></ol> 3. HPLC doğrulama <ol><li>DOX, MMC ve DOXol ve 4-MU (I.S.) çalışma standartları hazırlayın.
	<ol><li>DOX ve MMC ilaç tozu (dikkat) ve 4-MU bir taze küçük kağıt (3 x 3 inç 2) ağırlığında tartmak ayrı ayrı 1 mg. 
		Not tüm antikanser ilaçların akut toksisite ve germ hücreli mutagenisitesinin solunum veya sindirim neden olabilir bir sağlık tehlikesi olarak kabul edilir. Eldiven ve maske ile dikkatli bir şekilde işleneceğini.</li>
		<li>Ağırlığını DOX, MMC ve 4-MU bir yeni bireysel 1,5 mL polipropilen mikro-santrifüj tüpüne transfer.</li>
		<li>Meth 1 mL ekleyinanol ve kısaca DOX ve MMC 1 mg/mL konsantrasyonu elde etmek için girdap.</li>
		<li>DOXol (dikkat) ve girdap kısaca DOXol konsantrasyonu 1 mg/mL edinmek için önceden ağırlığını 1 mg içeren bir flakon 1 mL metanol ekleyin. 
		Not: DOXol bir kardiyo-toksik metaboliti ve dikkatle ele alınmalıdır.</li>
		<li>Pipet 20 µL DOX, MMC, DOXol ve 4-MU içine yeni bir hazır hisse senedi çözümleri ayrı 1,5 mL polipropilen mikro-santrifüj tüpü ve metanol her uyuşturucu 20 µg/mL bir çalışma standartları elde etmek için 980 µL ekleyin.</li>
		<li>Seyreltik 20 µg/mL DOX, MMC ve metanol 50 çalışma standartları elde etmek için kullanarak DOXol ng - 20 µg /mL DOX, MMC ve DOXol ve 2000 ng/mL I.S. 4-MU için.</li>
		<li>Çalışma çözümleri metanol buharlaşma önlemek için tüm tüp doğrudan güneş ışığı ve -20 mağazada maruz önlemek için alüminyum folyo ile sarın parafin film kaplama dar bir parçası ile tüpün kapağı mühürle ° C.</li>
	</ol></li> <li>Doğrusallık, hassasiyet ve doğruluk DOX, MMC ve biyolojik matrisler (Yani, tam kan ve tümör homogenate) DOXol belirlemek.
	<ol><li>Aynı anda spike 5 µL çalışma standartları DOX ve DOXol (50 ng/mL - 20 µg/mL), MMC (1000 ng/mL - 16 µg/mL) ve 4-MU (2 µg/mL) içine boş tam kan veya doku homogenate polipropilen mikro-santrifüj tüpler için 50 µL 5-2000 ng/mL ilaç bileşikler için ve 4-MU (I.S.) için 200 ng/mL arasında değişen standart toplama eğrisi elde edilir.</li>
		<li>Protokolü 1.2 ile açıklanan uyuşturucu ayıklama tahlil gerçekleştirmek.</li>
		<li>DOX ve DOXol düşük, medyan ve yüksek konsantrasyonları kullanın (50, 500 ve 2.000 ng/mL) ve MMC (100, 1000, 2000 ng/mL) içi ve arası gün hassasiyet ve doğruluk için. 
		Not: analiz gününde taze standart konsantrasyonları hazırlayın.</li>
	</ol></li> <li>Analiz örnekleri <ol><li>enjekte 15 µL otomatik örnekleyici kullanarak örnek.</li>
		<li>Yavaş yavaş mobil faz üzerinden 0-18 min, artan ACN bileşimi aralığında değişir.</li>
		<li>Sonra 18 dk, mobil faz koşul 1 dk. tutun</li>
		<li>2 dk içinde ilk durumuna dönün ve sonra sonraki enjeksiyon önce 4 dk için yeniden equilibrate.</li>
		<li>Uyuşturucu bileşiklerin onların tutma zamanı ile doruklarına takip gösterilir koşmak her örnek sonra Not: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) ve DOX.</li>
		<li>Eğri (AUC) HPLC yazılımını kullanarak uyuşturucu bileşiklerin altındaki tepe alanını ile tümleştirmeniz.</li>
		<li>I.S. (Denklem 1) arasındaki bireysel uyuşturucu bileşik AUC oranı hesaplamak ve aynı ayıklama prosedürleri altında hazırlanan standart eğrileri DMPLN formülasyonu DOX, MMC ve DOXol ilaç konsantrasyonlarda belirlemek için kullanın. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq1.jpg" /></li> <li>o çivili biyolojik örnekler özleri gelen metanol kullanarak yeniden ilaç konsantrasyonları karşılaştırarak uyuşturucu kurtarma yüzdesi (Denklem 2) hesaplamak Standart (&#34; düzgün &#34;) uyuşturucu metanol çözümde. 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq2.jpg" /></li></ol></li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının ve çıkar çatışması var.

Bir tek ilaç tür algılama bir anda diğer Kromatografik yöntemleri ile karşılaştırıldığında, mevcut HPLC protokolü aynı anda aynı biyolojik matris değiştirmeye gerek kalmadan üç uyuşturucu bileşikler (DOX, MMC ve DOXol) quantitate yapabiliyor mobil faz. Bu hazırlama ve analiz yöntemi başarıyla uygulandı farmakokinetik ve biyo-iki uyuşturucu nanoparçacık tabanlı dağıtım sistemlerinin dağıtımını belirlemek için (Yani, liposomal DOX ve DMPLN)22. Peg...

Henüz kez şiddetli yan etkiler ve ilaç direnci nedeniyle sınırlı etkinliği ve diğer etkenler1,2,3ile ilişkili kemoterapi birçok kanser için birincil tedavi yöntemi var. Kemoterapi sonucu geliştirmek için ilaç kombinasyonu rejimlerinin konuları üst üste toksisite, uyuşturucu eylem ve çapraz ilaç direnci4,5 farklı mekanizmalar gibi temel kliniğinde uygulanan , 6. klinik çalışmalarda, daha iyi bir tümör yanıt oranı genellikle aynı anda kullanarak yönetilen ardışık ilaç teslim7,8bir rejimi için karşılaştırıldığında uyuşturucu kombinasyonları gözlendi. Ancak, alt-optimal biyo-dağıtım nedeniyle ücretsiz ilaç formları, birden çok ilaçların eşzamanlı enjeksiyon tedavi etkisi9,10,11daha ağır basar önemli normal doku toksisite neden olabilir. Nanocarrier tabanlı ilaç dağıtım alter farmakokinetik ve biyo-dağıtım tümör hedefli birikimi12,13,14artırılması kapsüllenmiş ilaçların olduğu gösterilmiştir. Bizim son makalelerinde gözden olarak sinerjik uyuşturucu kombinasyonları ile birlikte yüklenen nano tanecikleri ücretsiz uyuşturucu kombinasyonları, kontrollü kendi zamansal ve mekansal co teslimini nedeniyle karşılaştığı sorunları azaltmak için yetenek göstermiştir birden fazla uyuşturucu tümör doku sinerjik uyuşturucu etkileri kansere karşı etkinleştirme4,15,16hücreleri. Sonuç olarak, üstün terapötik etkinlik ve düşük toksisite her iki önceden klinik ve klinik çalışmalar4,17,18içinde gösterilmiştir.
Bizim önceki vitro çalışmalarda iki antikanser ilaç, doksorubisin (DOX) ve mitomycin C (MMC), kombinasyonu sinerjik etkisi birkaç meme kanseri hücreleri hattı karşı üretilen bulundu ve ayrıca, yükleme DOX ve MMC içinde co Polimer-lipid hibrid nano tanecikleri (DMPLN) çeşitli çok ilaca dirençli ilişkili sızma Pompalar (Örneğin, P-glikoprotein ve meme kanseri dayanıklı protein)19,20,21üstesinden geldi. Vivo, DMPLN DOX ve MMC tümör sitelere uzamsal-Zamansal eş teslimi ve ilaçların kanser hücreleri içinde artan bioavailability DOX metaboliti doxorubicinol (DOXol)22oluşumu ılımlılık tarafından belirtildiği şekilde etkin. Sonuç olarak, DMPLN gelişmiş tümör hücre apoptosis, tümör büyüme inhibisyonu ve DOX ve MMC kombinasyonu veya bir liposomal DOX formülasyonu22,23,24ücretsiz göre uzun süreli ana bilgisayar hayatta kalma, 25.
Ortak bir nanocarrier tarafından teslim uyuşturucu gerçek miktarı analiz etkili nanopartikül formülasyonları tasarlamak için önemlidir. Pek çok yöntem plazma düzeyini yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) yalnız kullanarak tek DOX veya MMC doz veya kütle spektrometresi (MS)26,27,28 ile birlikte analiz etmek için geliştirilmiştir , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. biyolojik örnekler çok sayıda ayrı ayrı birden çok uyuşturucu (bazen uyuşturucu metabolitleri dahil) analizi için hazırlıklı olması gerekiyor gibi Ancak, bu yöntemler genellikle zaman alıcı ve kombinasyon tedavisi için pratik vardır. Güçlü plazma protein bağlayıcı DOX ve MMC ek olarak kırmızı kan hücreleri da bağlamak ve pek çok antikanser ilaçlar35,36konsantre büyük bir kapasiteye sahip. Böylece, plazma analiz DOX veya MMC için gerçek kan ilaç konsantrasyonları karartmak. Mevcut çalışma (şekil 1) basit ve sağlam aynı anda ayıklamak ve DOX, MMC ve tam kan ve çeşitli dokular ( DOX metaboliti doxorubicinol (DOXol) quantitate ters faz HPLC kullanarak birden fazla uyuşturucu analiz yöntemi açıklar Örneğin, tümörler). Farmakokinetik ve biyo-DOX ve MMC dağıtımını yanı sıra DOXol oluşumu ilaç dağıtım yolu ile ücretsiz çözümler ya da nanopartikül formları (örneğin, DMPLN ve liposomal DOX) sonra bir orthotopically belirlemek için başarıyla uygulandı fare meme tümör fare modeli Intravenous (IV) sonra implante enjeksiyon22.

<table style="border-collapse:collapse;width:635pt" width="846">
	<colgroup>
		<col style="width:188pt" width="250" />
		<col style="width:122pt" width="162" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:236pt" width="315" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Doxorubicin&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Polymed Theraeutics</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">111023</td>
			<td class="xl20" style="width:236pt" width="315">Anticancer drug</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Mitomycin C</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Polymed Theraeutics</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">060814</td>
			<td class="xl20" style="width:236pt" width="315">Anticancer drug</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">Doxorubicinol (DOXol)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Toronto Research Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">D558020</td>
			<td class="xl21">Metabolite of DOX</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">4-Methylumbelliferone sodium salt&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">M1508</td>
			<td class="xl21">Internal standard</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Myristic Acid</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">544-63-8&#160;&#160;</td>
			<td class="xl21">Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Polyoxyethylene (100) Stearate</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Spectrum</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">M1402</td>
			<td class="xl21">Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Polyoxyethylene (40) Stearate</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">P3440</td>
			<td class="xl21">Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Pluronic F68 (PF68)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">BASF Corp.</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">9003-11-6</td>
			<td class="xl21">Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">Ultrasonication (UP100H)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Hielscher, Ultrasound Technology</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Nanoparticle preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Water Bath (ISOTEMP 3016HS)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Nanoparticle preparation</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl20" height="105" style="width:188pt;height:78.75pt" width="250">Liposomal Doxorubicin&#160; (Caelyx)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Janssen</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital</td>
			<td class="xl21">Clinically-approved nanoparticle formulation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">HPLC-graded Methanol</td>
			<td class="xl21">Caledon Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">6701-7-40</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase composition</td>
		</tr>
		<tr height="25" style="height:18.75pt">
			<td class="xl20" height="25" style="width:188pt;height:18.75pt" width="250">HPLC-graded H2O</td>
			<td class="xl21">Caledon Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">8801-7-40</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase composition</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">HPLC-graded Acetonitrile&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Caledon Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">1401-7-40</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase composition</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Trifluoroacetic Acid</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">302031</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase composition</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">0.45 &#956;m Nylon Membrane Filter Paper</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Whatman</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">WHA7404004</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl29" height="42" style="height:31.5pt">1cc Plastic Syringes</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">2606-309659</td>
			<td class="xl21">Treatment injection</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl29" height="42" style="height:31.5pt">5cc Plastic Syringes</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">2608-309646</td>
			<td class="xl21">Tissue collections</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">30G 1/2 Needles</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">305106</td>
			<td class="xl21">Treatment injection</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">25G 5/8 Needles</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">305122</td>
			<td class="xl21">Tissue collections</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">Sterile 0.9% Saline</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Univeristy of Toronto House Brand</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">1011</td>
			<td class="xl21">Tissue perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl20" height="22" style="width:188pt;height:16.5pt" width="250">13 ml Rounded-bottom conical tube&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">SARSTEDT</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">62.515.006</td>
			<td class="xl21">Prolyprolene, tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl30" height="23" style="height:17.25pt">Alpha Minimum Essential Medium (MEM)&#160;</td>
			<td class="xl27">Gibco</td>
			<td class="xl28" style="width:89pt" width="119">12571063</td>
			<td class="xl21">Cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl20" height="22" style="width:188pt;height:16.5pt" width="250">1 x Phosphate Buffer Saline</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Gibco</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">10010023</td>
			<td class="xl21">Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Triton X-100</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">X100-100 ML</td>
			<td class="xl21">Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Formic acid</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Caledon Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">1/5/3840</td>
			<td class="xl21">Adjust pH for extraction solvent</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">Sodium heparin sprayed plastic tubes</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">367878</td>
			<td class="xl21">Blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Analytical Weigh Balance&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sartorius&#160;</td>
			<td class="xl21">CPA225D</td>
			<td class="xl21">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">pH meters&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl26">13-637-671</td>
			<td class="xl21">accumet BASIC</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Vortex Mixter</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">02-215-365</td>
			<td class="xl21">Vortexing samples at desired speed</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">1.5 ml&#160; Microcentrifuge Tube</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Fisherbrand</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">2043-05408129</td>
			<td class="xl21">Prolyprolene</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Model 1000 homogenizer</td>
			<td class="xl22">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">08-451-672</td>
			<td class="xl21">Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Centrifuge 5702R</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Eppendorf</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">5702R</td>
			<td class="xl21">Extraction preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Heated Evaporator System</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Glas-Col</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Sample reconstitution</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">HPLC Screw Thread Vials</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">DIKMA</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">5320</td>
			<td class="xl21">HPLC sample injection</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">DIKMA</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">5325</td>
			<td class="xl21">HPLC sample injection</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">HPLC Polypropylene Insert&#160;&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">5182-0549</td>
			<td class="xl21">Maximum volume 250 &#956;l, HPLC sample injection</td>
		</tr>
		<tr height="25" style="height:18.75pt">
			<td class="xl20" height="25" style="width:188pt;height:18.75pt" width="250">Xbridge C18 Column</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">186003117</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Gradient pump&#160;</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">W600</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Auto-sampler</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">W2707</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Photodiode array detector&#160;</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">W2998</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Multi &#955; fluoresence detector&#160;</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">W2475</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">EMPOWER 2</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Scientist</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Micromath</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Pharmacokinetic analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Female Balb/c Mice</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Jackson Laboratory</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">001026</td>
			<td class="xl21">In vivo</td>
		</tr>
		<tr height="63" style="height:47.25pt">
			<td class="xl20" height="63" style="width:188pt;height:47.25pt" width="250">EMT6/WT Breast Cancer Cells</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">In vivo</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin c following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice

Kombinasyon kemoterapi, kanser tedavisi için klinikte sık kullanılır; Ancak, ilişkili yan etkileri normal doku için onun terapötik yarar sınırlayabilir. Nanoparçacık tabanlı ilaç kombinasyonu ücretsiz uyuşturucu kombinasyon tedavisi tarafından karşılaşılan sorunların etkisini azaltmak için gösterilmiştir. Önceki çalışmalarımız var, bu iki antikanser ilaç, doksorubisin (DOX) ve mitomycin C (MMC) ile birlikte gösterilen her iki fare karşı bir sinerjik etkisi üretilen ve vitroinsan meme kanseri hücreleri. DOX ve MMC birlikte yüklenen polimer-lipid hibrid nano tanecikleri (DMPLN) tedavisine direnç ve meme tümör modelleri gelişmiş etkinlik gösterdiği danışmam çeşitli sızma ışınlama pompalar yan yol. Geleneksel çözüm biçimlerine göre DMPLN üstün böyle etkinliğinin DOX ve MMC ve artan hücre içi uyuşturucu bioavailability tümör hücreleri nanocarrier PLN tarafından etkin içinde eşitlenmiş farmakokinetik atfedilen yapıldı.
Farmakokinetik ve biyo-dağılımı değerlendirmek için DOX ve MMC özgür eriyik ve nanoparçacık formları, ters fazlı yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) yapıldı kullanarak basit ve verimli çoklu ilaç analizi yöntemi ortak idare geliştirdi. DOX veya MMC plazmada ayrı ayrı analiz daha önce bildirilen yöntemler aksine, bu yeni HPLC yöntem aynı anda DOX, MMC ve bir büyük kardiyo-toksik DOX metaboliti, doxorubicinol (DOXol), çeşitli biyolojik matrisler ( içinde quantitate yapabiliyor Örneğin, tam kan, meme tümör ve kalp). Bir çift floresan ve ultraviyole emici sondayı 4-methylumbelliferone (4-MU) farklı algılama dalga boyu ile birden fazla ilaç analizi tespiti tek adımlı bir iç standart (I.S.) olarak kullanılmıştır. Bu yöntem DOX ve tam kan nanopartikül ve çözüm yaklaşımları ve orthotopic meme tümör fare modelinde çeşitli dokular tarafından teslim MMC konsantrasyonları belirlemek için başarıyla uygulandı. Analitik yöntemi sunulan nanoparçacık tabanlı teslimat uyuşturucu kombinasyonları önceden klinik analiz için yararlı bir araçtır.

İki antikanser ilaç, DOX ve MMC yanı sıra DOX metaboliti, DOXol, aynı anda aynı uygulanan degrade HPLC koşul I.S. floresan ve UV dedektörleri için 4-MU kullanarak altında biyolojik herhangi bir müdahale olmadan tespit edildi. DOX, MMC, DOXol ve 4-MU birbirinden MMC için 5,7 min, 10.4 min DOXol için 4-MU için 10.9 min ve 11.1 min DOX (Şekil 2) için saklama kez ile iyi ayrılmış. Tam kan her ilaç ve çeşitli dokuların konsantrasyon doğrusa...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-b

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Bu iletişim kuralı bir verimli ve kullanışlı analitik süreci örnek ekstraksiyon ve birden fazla uyuşturucu, doksorubisin (DOX), mitomycin C (MMC) ve doxorubicinol (DOXol), biyolojik bir kardiyo-toksik DOX metaboliti eşzamanlı belirlenmesi açıklar Preklinik meme tümör modeli örnekleri nanopartikül formülasyonları sinerjik ilaç kombinasyonu ile tedavi.

Örnek çıkarma ve eşzamanlı Kromatografik Nefelometri doksorubisin ve ilaç kombinasyonu dağıtımında nano tanecikleri tümörü taşıyan fareler takip Mitomycin C

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

sample-extraction-simultaneous-chromatographic-quantitation

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Cancer Research

Unit 1

Pharmacokinetic Models

SCIENTISTS IN ACTION

10.8K Görüntüleme.  University of Toronto. Bu iletişim kuralı bir verimli ve kullanışlı analitik süreci örnek ekstraksiyon ve birden fazla uyuşturucu, doksorubisin (DOX), mitomycin C (MMC) ve doxorubicinol (DOXol), biyolojik bir kardiyo-toksik DOX metaboliti eşzamanlı belirlenmesi açıklar Preklinik meme tümör modeli örnekleri nanopartikül formülasyonları sinerjik ilaç kombinasyonu ile tedavi.

Video: Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Kanser Araştırmaları

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

Kolon-26 Karsinoma Tümör taşıyan Kanser Kaşeksi Araştırmaları Modeli Olarak Fare

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Antikanser antikor etkinliğinin Antineoplastic uyuşturucu tarafından kullanılmasının muhtemelen: antikor-uyuşturucu Synergism kombinasyon Dizin denklem kullanılarak tespiti

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the tumor milieu can possess pro- or anti-tumor capacity. One of the important cytokines regulating neutrophil functions in a tumor context are type I interferons. In the presence of interferons, neutrophils gain anti-tumor properties, including cytotoxicity or stimulation of the immune system. Conversely, the absence of an interferon signaling results in prominent pro-tumor activity, characterized with strong stimulation of tumor angiogenesis. Recently, we could demonstrate that pro-angiogenic properties of neutrophils depend on the activation of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) signaling pathway in these cells. Inhibition of this pathway in tumor-associated neutrophils leads to their potent anti-angiogenic phenotype. Here, we demonstrate our newly established model allowing in vivo evaluation of tumorigenic potential of manipulated tumor-associated neutrophils (TANs). Shortly, pro-angiogenic tumor-associated neutrophils can be isolated from tumor-bearing interferon-deficient mice and repolarized into anti-angiogenic phenotype by blocking of NAMPT signaling. The angiogenic activity of these cells can be subsequently evaluated using an aortic ring assay. Anti-angiogenic TANs can be transferred into tumor-bearing wild type recipients and tumor growth should be monitored for 14 days. At day 14 mice are sacrificed, tumors removed and cut with their vascularization assessed. Overall, our protocol provides a novel tool to in vivo evaluate angiogenic capacity of primary cells, such as tumor-associated neutrophils, without a need to use artificial neutrophil cell line models. vc

Here, we show therapeutic potential of anti-angiogenic tumor-associated neutrophils after their transfer into tumor-bearing mice. This protocol can be used to manipulate neutrophil activity ex vivo and to subsequently evaluate their functionality in vivo&#160;in developing tumors. It is an appropriate model for studying potential neutrophil-based immunotherapies.

Anjiogenik potansiyelinin In vivo çalışması için Işlenmiş tümör ilişkili Nötroflelerin tümör taşıyan fareler içine aktarılması

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

Zebrabalığı Tümör Ksenogreftlerinde Konak Anjiyojenik Yanıtın Vivo Görüntüleme ve Kantitasyonunda

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&amp;#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

Polianhidrit IL-1α Nanopartiküllerinin In vivo Antitümör Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These relatively simple avascular constructs mimic key aspects of in vivo tumors, such as 3D structure and pathophysiological gradients. MCTSs models can provide insights into cancer cell behavior during spheroid development and in response to drugs; however, their requisite size drastically limits the tools used for non-destructive assessment. Optical Coherence Tomography structural imaging and Imaris 3D analysis software are explored for rapid, non-destructive, and label-free measurement of regional cell density within MCTSs. This approach is utilized to assess MCTSs over a 4-day maturation period and throughout an extended 5-day treatment with Trastuzumab, a clinically relevant anti-HER2 drug. Briefly, AU565 HER2+ breast cancer MCTSs were created via liquid overlay with or without the addition of Matrigel (a basement membrane matrix) to explore aggregates of different morphologies (thicker, disk-like 2.5D aggregates or flat 2D aggregates, respectively). Cell density within the outer region, transitional region, and inner core was characterized in matured MCTSs, revealing a cell-density gradient with higher cell densities in core regions compared to outer layers. The matrix addition redistributed cell density and enhanced this gradient, decreasing outer zone density and increasing cell compaction in the cores. Cell density was quantified following drug treatment (0 h, 24 h, 5 days) within progressively deeper 100 &#181;m zones to assess potential regional differences in drug response. By the final timepoint, nearly all cell death appeared to be constrained to the outer 200 &#181;m of each aggregate, while cells deeper in the aggregate appeared largely unaffected, illustrating regional differences in the drug response, possibly due to limitations in drug penetration. The current protocol provides a unique technique to non-destructively quantify regional cell density within dense cellular tissues and measure it longitudinally.

The present protocol develops an image-based technique for rapid, non-destructive, and label-free regional cell density and viability measurement within 3D tumor aggregates. Findings revealed a cell-density gradient, with higher cell densities in core regions than outer layers in developing aggregates and predominantly peripheral cell death in HER2+ aggregates treated with Trastuzumab.

İlaç Tedavisini Takiben Tümör Agregaları İçindeki Bölgesel Hücre Yoğunluğunun Tahribatsız Değerlendirilmesi

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

Radyoaktif Olmayan Kemilüminesans Tespiti Kullanılarak Telomer Uzunluğunun Ölçülmesi

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Yazar Spotlight: TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...