Name: dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Changhui Pak ve Alysia Vrailas Mortimer başlangıçta beyin diseksiyonu tekniği SMK verdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Ken Moberg'ın laboratuar grubunun üyeleri, özellikle Chris mermi, eleştirel yazının okumak için teşekkür ederiz. Fas2 tanıma antikorlar (1 d 4) ve chaoptin (24B10) gelişim çalışmaları Hibridoma bankadan elde. Antikor 24B10 Seymour Benzer ve Nansi Colley24tarafından,60,61DSHB için yatırılır, antikor 1 d 4 için DSHB Corey Goodman 22,23,56tarafından yatırılır. Sinek stokları Bloomington hisse senedi merkezden elde edilmiştir. Ayrıca Ohio tarımsal araştırma ve Geliştirme Merkezi (OARDC) MCIC görüntüleme Merkezi confocal mikroskop kullanımı için şekil 4A beyinlerinde görüntü için teşekkür etmek istiyorum ve B. SMK NICHD hibe tarafından desteklenmektedir (1 R15 HD084241-01A1).

1. drosophila melanogaster genetik ve isteğe bağlı ısı şok yordamlar
<ol><li>Bir kez sinekler geçti ve F1 döl yumurtadan, kadın ve/veya uygun genotip erkek elde edilir. Soruşturma altında beyin bölgesi bağlı olarak sinekler her gün toplanması ve böylece beyin bağlantısı yaş bağımlı ve/veya cinsel şekilli desen daha kolay ayırt edilebilir seks tarafından ayrılmış. 
	Not: İsteğe bağlı: sinekler bir Repressible hücre işaretçisi (MARCM) analizi 12 , 47, embriyo, larvaları ile mozaik analiz için kullanılmaktadır, ya da pupa ısı 30-45 dk 37 ° C'de şok olmalı Mitotik rekombinasyon neden. MARCM analiz için mantar organlarının belirli bölgeleri hedeflemek için şekil 5 ' te B ana hatlarıyla ve 12 tarafından belirlenen zamanlamaya göre ısı şok zaman. MARCM beyin bölgeleri mantar organları dışında araştırmak için kullanılıyorsa, pilot deneyler ısı şok olmak en iyi sahne belirlemek için yapılmalıdır. Belgili tanımlık merdiven aşağı konuda yazılmış olsa da eclosed uçar, pharate yetişkin de disseke pupa durum kaldırıldıktan sonra aşağıdaki adımları kullanarak.</li>
</ol> 2. Diseksiyon istasyonu hazırlık <ol><li>stereomicroscope ve ışık kaynağı ile konum bağlı fiber optik goosenecks üzerinde büyük bir benchtop. Sürekli el hareketleri teşvik etmek ve azaltmak el &#34; sallamak &#34; diseksiyon sırasında yeterli el ve kol dinlenme alanı mevcuttur mikroskop için önemlidir. Mikroskop ve 4-6 inç mikroskop Bankası tezgah kenarı arasındaki iki tarafında yaklaşık 8-10 inç olduğundan emin olun.</li>
	Bir cam <li>dolgu 2 veya 3 Kuyu PTN arabelleği 1.0 mL ile 9-şey veya 3-iyi yemek (0.1 M sodyum fosfat tampon pH 7.2, % 0,1 Nonyonik yüzey aktif, tam arabellek bileşenleri için malzemeler tabloya bakınız) ve yer yanında bulunuyor parçalanmış buz üzerinde. Yeni disseke beyin bu yemek için transfer ve fiksasyon adım kadar saklı.
	<ol><li>Not: canlı görüntüleme gerekiyorsa, diseksiyon arabellek fosfat tamponlu tuz (PBS) veya HL3 arabellek 48 x 1 olmalıdır. İntraselüler protein yerelleştirme gerekiyorsa, PBS de alternatif bir tampon olarak diseksiyon ve fiksasyon için kullanılabilir. Fiksasyon, hücre zarları permeabilization sonra gerçekleştirilmesi PTN yıkar %0,1 veya % 0,3 Noniyonik deterjan içeren kullanarak.</li>
		<li>PBS diseksiyonu ve fiksasyon için kullandıysanız, pipet ipuçları deterjan içeren bir arabellek (örneğin PTN) ile durulanır en az bir kez beyin microcentrifuge tüpler transfer sırasında plastik pipet ipuçları yapışmasını önlemek için olmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>Bir boş 35 mm cam veya plastik petri dish, kullanarak oluşturmak bir silikon elastomer içeren bir diseksiyon yemek. Kısaca, üretici göre elastomer bileşenleri karıştırmak &#39; s yön, 35 mm yemeklerin dökün ve bir gecede düz bir yüzeye polimerize sağlar. Diseksiyon yemekleri içeren elastomer forseps forseps ve bir cam tabak gibi sert bir yüzeye arasında iletişim yapılırsa hangi kolayca hasar görebilir, anatomi iyi ipuçları korumak için kullanılır. Biz de düzenli olarak online perakendecilerin ticari olarak mevcut silikon kaplı yemekleri satın alma. Inaktif kömür (ve böylece renkli siyah) içeren silikon elastomer diseksiyon yemekleri kontrast diseksiyonu sırasında artırmak için özellikle yararlı.</li>
</ol> 3. Yetişkin beyin diseksiyon yordam <ol><li>Anesthetize 3-5 gün eski yetişkin D. melanogaster CO 2 ile veya kullanarak buz. Buz kullanılıyorsa, sinekler baş aşağı içeren flakon (Tak son aşağı) içine buz kovası ~ 5 dk. şişe buz baş aşağı koyarak engeller yer gıda teslim olma uçar. Bir kez sinekler anestezi, sinekler üzerinde bir soğuk metal yüzey veya petri kabına oturan buz veya sinek pad yayan bir CO 2 yerleştirin. Eğer ateş analiz etmek için beyni anatomi, büyük sinekler de kullanılabilir.</li>
	<li>PTN oluşturmak için bir transfer pipet veya p200 pipet kullanarak diseksiyon çanak merkezinde, küçük bir miktar (150-200 µL) yer bir &#34; kabarcık &#34; PTN in. Stereomicroscope altında diseksiyon tabak yerleştirin ve aydınlatma ayarlayın ve böylece PTN balonu görüş alanı doldurur ve düzgün aydınlatılmış odaklanmak.</li>
	<li>Böylece onlar işlemek sinekler &#34; kadar göbek &#34; (Yani, ventral tarafı yukarı) metal veya CO 2 yastık üzerinde yatarken.</li>
	<li>Kullanarak bir çift #5 forseps, kavramak disseke ve anında tutun tutmak tamamen bu PTN diseksiyon çanak üzerinde daldırın için bir sinek karın. 
	Not: baş PTN içinde sular altında iken protokol geri kalanı için tüm adımlar gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>#5 forseps ikinci bir çifti kullanarak, sinek hortum Bankası kavrayın ve forseps ayrı vücuttan sinek kafa ayırmak için iki çift çekin. Karın ve göğüs atmak. Bu adım sırasında bu kafa değil serbest bırakmak ve PTN yüzeyinde gezmek için izin önemlidir. Bir kez başından yüzen, yine beyin ezme olmadan kavramak zor olabilir. 
	Not: Bu yöntemi kullanarak, beyin ve ventral sinir kablosu arasındaki bağlantıları kopmuş. MSS bu bölgeler arasındaki sağlam bağlantıları gerekliyse, 49 , 50 gibi bir alternatif diseksiyon protokolü takip edilmelidir. Baş kaldırılmadan önce hortum sinek baştan çıkarır, hortum neredeydi bir delik olacak. Bu durumda, bir eye yakınındaki deliğin kenarında sinek kafa kavramak. Sonra başından forseps dışında bir başka iki çift kablolarıylaberaber orta miktarda güç kullanarak kaldırın. Bazen, kafa vücuttan çıkarıldığı zaman, gut ve/veya ventral sinir kordonu kalır kafasına bağlı ve diseksiyon devam etmeden önce kaldırılması gerektiğini.</li>
	Forseps bir çift hortum kavrıyor ise <li>, ikinci çift şu sinek göz medial kenarı kavramak gerekir. Yavaş yavaş, bir başka dışında forseps çek. Bu adımı sabit yanal kuvvet küçük bir miktar ile yapılmalıdır. Forseps yavaş yavaş dışında bir başka hareket ettirdiğinizde, hortum uzak kafanı çıkar ve merkezi bir delik kafa kütikül oluşturmanız gerekir. İkinci Çift sağ gözünden medial kısmı bırakmadan forseps ilk çifti ile hortum atın. 
	Not: Yetişkin D. melanogaster beynidir Kaudal (Yani, arka/arka) bölgesinin sinek. Böylece, o bölgesinin açgözlü kaçınılmalıdır. İdeal olarak, yalnızca rostral (Yani, açık) medial retina yakınındaki baş kısmını doğrudan kavradı tarafından forseps. Beyin ve ilişkili Trakea artık manikür orta delikten görünür olmalıdır. Şu anda, delikten nefes borusu çıkıntılı herhangi bir beyaz kılçıklı konu kaldırıldı ve atılan.</li>
	<li>(Baş kütikül Merkez delik kenarındaki) sol retina medial kenarı forseps ikinci çifti ile kavramak. Retina ve ilişkili kütikül kaldırmak için yavaş yavaş birbirlerine uzak forseps 180 ° açıyla çekin. Retina temel optik LOB ayrışıp gibi gerilim hafif bir düşüş hissetmeniz gerekir. Yavaş yavaş optik LOB yırtılma önlemek için devam. 
	Not: forseps, çok hızlı bir şekilde bu adımı sırasında ayıran th yırtılma sonuçlanabilire optik LOB veya kesintileri mantar vücut yapıları. Zaman zaman, manikür kaldırılacak ancak retina adet optik LOB bağlı kalır. Mantar cesetleri Imaging, tüm retina kaldırmak gerekli değildir. Ancak, diğer beyin bölgeleri (gibi retina nöron innervasyon optik beyin LOB) analizini 48 , 51 tarafından açıklandığı gibi tamamen kaldırılacak retina gerektirebilir. 
	Not: retina yavaş yavaş beynin temel optik LOB ayrılır, optik LOB observable beyaz, kılçıklı trake ile kaplı bir opak beyaz yapısı olarak olmalıdır. Bir retina kaldırıldıktan sonra göz ardı. Kılavuz retina nöronların analiz ederken, belirli bu adımı sırasında optik lobe hasarı önlemek için özen gösterilmelidir. Ek bir protokol diseksiyon üzerinde duruldu ve canlı görüntüleme photoreceptor nöron da kullanılabilir 48.</li>
	<li>Şimdi, dikkatli bir şekilde mümkün olduğunca görünür Trakea daha fazla çıkarın. Trakea zaten içeriyor veya daha sonra hava, float ve büyük olasılıkla, daha sonra immunostaining adımları sırasında kayıp beyin neden ile doldurun. Trakea kaldırmak için #5 forseps çok keskin bir çift kullanarak beyin off al.</li>
	<li>Kalan retina ve çevresindeki kütikül sol sinek retina medial bölge kavramak için her iki çift forseps kullanarak kaldırın. Dikkatle retina retina ve kütikül parçalarını kaldırmak için ikiye gözyaşı. Bazı durumlarda, özellikle zorlu beyin ezme olmadan kalan kütikül kaldırma kanıtlıyor. Bu gibi durumlarda, forseps diğer çifti dikkatle manikür sonunu kaldırmak için kullanıldığı gibi ventral sinir kordonu kalan ipliklerini yerine forseps bir çift tarafından anlaşılacak bulduk.</li>
	<li>P200 pipet hareket ettirmek istimal disseke beyin PTN içeren 9 - veya 3-da yemek bir şey için. Aynı genotip beyinlerinin de aynı birlikte havuza alınmış ve buz tuttu. Beyin dokusu diseksiyon bir saat içinde sabit olmalıdır. Beyni küçük gruplar halinde sabit ve beyin daha çok sayıda gerekliyse havuza alınmış. Birçok durumda, deneyimli bir araştırmacı genellikle bir beynini incelememize ve cam koleksiyonu çanak yaklaşık 3-5 dak transfer</li>
</ol> 4. Fiksasyon ve immünfloresan boyama prosedürü <ol><li>p200 pipet kullanarak, disseke beyin PTN içinde seyreltilmiş %4 paraformaldehyde 0.5 mL ile dolu bir 0.5 mL microcentrifuge Tube 9-iyi yemek transfer. Aynı genotip beyinlerinin en az 10-15 bir microcentrifuge tüp içine birleştirilebilir. 0.5 ml microcentrifuge tüplerde (kadar beyin slaytlar üzerine montajı) tüm kalan adımları tamamlanır. 
	Dikkat: Paraformaldehyde (PFA) bir duman mahallede ele alınmalıdır. İngiltere'de yılın atık kaydedilir ve düzgün pislikleri atmak için kullanmamıştım. cam ampul içinde satın alınan % 20 paraformaldehyde microcentrifuge tüpler içine bölünmemeli ve saklı-20 ° c kadar gerekli olabilir.</li>
	<li>Bir duman başlık içinde oda sıcaklığında sallanan yavaş hızı ile %4 paraformaldehyde 20 dk için beyinlerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Fiksasyon beyin yerçekimi tarafından microcentrifuge tüp altına yerleşmek izin. 
	Not: Bazen, beyin microcentrifuge tüp tarafına yapışabilir. Bu durum ortaya çıkarsa, yanal başparmak ve işaret parmağı arasında tüp döndürmek veya tüp beyni batan tanıtmak için tezgah üzerinde hafifçe dokunun genellikle yardımcı olur.</li>
	<li>Kaldır sabitleştirici bir p1000 kullanarak pipet ve iki gerçekleştirmek &#34; hızlı &#34; yıkar 500 µL PTN, beyin yıkama arasında microcentrifuge tüp altına yerleşmek izin ile. Tüm beyin tarafından yerçekimi microcentrifuge tüp altına yerleşmiş bir kez bu hızlı yıkama sırasında PTN hemen taze arabelleği için değiştirilebilir; hiçbir ek yıkama zamanı gereklidir. 
	Not: Genellikle, tüpe ilave arabellek bırakarak beyin kaldırma riske için tercih edilir. Pipet ucu dikkatli muayene genellikle beyinsiz tüp sizden yanlışlıkla kaldırılmıştır emin olmak için gereklidir. Beyin belgili tanımlık uç pipetted kaza olması gerekir, onları geri microcentrifuge tüpüne dağıtmak, yerleşmeye beynim bekleyin ve kalır herhangi bir ilave PTN kaldırmaya devam.</li>
	<li>Son hızlı yıkama sonra üç gerçekleştirmek için p1000 pipet kullanın &#34; uzun &#34; yıkar: bir rock'çı / nutator üzerinde oda sıcaklığında PTN ve yıkama 20 dk için 500 µL ekleyin. Gelecekteki tüm &#34; uzun &#34; yıkar 20 dakika için olmalıdır. 
	Not: Bu yıkar, beyin sabit takip gecede PTN 4 ° C'de depolanmış olabilir.</li>
	<li>P1000 pipet kullanarak son yıkama kaldırmak ve kuluçkaya beyin bir rocker veya nutator, oda sıcaklığında en az 30 dakika oda sıcaklığında için çözüm [PTN + % 5 normal keçi serum (NGS)] engelleme 0.5 ml.
	<ol><li>Keçi ikincil antikorlar sonraki Protokolü adımda kullanılacak. Başka bir tür ikincil antikorlar kullanılacaksa bu tür (yerine NGS) normal serum engelleme ve antikor çözümlerinde kullanılmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>P1000 pipet kullanarak, engelleme çözüm kaldırın ve PTN (PTN + %5 NGS + seyreltilmiş birincil antikor) seyreltilmiş birincil antikor ekleyin. Birincil bir antikor ilk kez kullanırken, bu antikor en uygun seyreltme ampirik olarak tespit edilmelidir. 
	Not: mantar vücut nöronlar görüntülenmesi için Fas2 tanıma antikorlar genellikle kullanılır. Bu antikorlar antikor 1 d 4 gelişim çalışmaları Hibridoma banka (DSHB) üzerinden kullanılabilir ve sulandırılmış 1:20 PTN + % 5 olmalıdır NGS. 
	Not: photoreceptor nöronlar görüntülenmesi için chaoptin tanıma antikorlar genellikle kullanılır. Chaoptin antikor DSHB antikor 24B10 olarak kullanılabilir ve sulandırılmış 1:20 PTN + % 5 olmalıdır NGS. 
	Not: Fiksasyon işlemi genellikle floresan yeşil flüoresan protein (GFP) gibi floresan protein üzerinden ortadan kaldırır. Bu nedenle, MARCM aksonal rehberlik bireysel MB nöronların analiz etmek için kullanırken, GFP tanıma bir antikor kullanın.</li>
	<li>2-3 gece 4 birincil antikor çözüm üzerinde bir rocker/nutator beyinlerinde kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Beyin microcentrifuge tüp altına yerleşmek ve birincil antikor çözümü kaldırmak birincil antikorlar ile kuluçka izin.</li>
	<li>P1000 pipet kullanarak yerine 2 &#34; hızlı &#34; yıkama ve 3 &#34; uzun &#34; 20 dk adımları 4.4 ve 4.5 yukarıda açıklandığı gibi PTN 0.5 mL ile yıkar, dikkatli bir şekilde izin microcentrifuge tüp her yıkama arasında altına yerçekimi tarafından yerleşmek beyin</li>
	<li>Incubate beyin fluorescently etiketli uygun ikincil antikorlar ile oda sıcaklığında 3 h için. İkincil antikorlar genellikle seyreltilmiş 0.5 mL PTN + % 5, 1: 200 bir konsantrasyon NGS. 
	Not: floresan ikincil antikorlar ekledikten sonra beyin deneme geri kalanı için karanlıkta tutulmalıdır. 
	Not: benzer uyarma/emisyon dalga boylarında GFP sahip bir fluorophore ile etiketli bir ikincil antikor kullanmak için tavsiye MARCM çözümleme işlemi sırasında büyük kalıntı GFP Floresans kalır içinde (örneğin, Fluoroscein isothyocyanate (FITC) veya Alexa488).</li>
	<li>İkincil antikor kuluçka, takip izin microcentrifuge tüp altına yerleşmek ve ikincil antikor çözümü kaldırmak beyin.</li>
	<li>Gerçekleştirmek 2 &#34; hızlı &#34; yıkama ve 3 &#34; uzun &#34; 20 dk adımları 4.4 ve 4.5 yukarıda açıklandığı gibi PTN 0.5 mL ile yıkar, dikkatli bir şekilde izin microcentrifuge tüp her yıkama arasında alt yerleşmek beyin</li>
	<li>Üçüncü takip &#34; uzun &#34; 20 dk yıkama, kullanım mümkün olduğunca fazla arabellek kaldırmak için p200 pipet.</li>
	<li>Ekleyin 75 µL floresan Anti-fade in montaj orta beyin ve. Pipet beyin ve montaj orta içine karıştırmak için bir kez pipet ucu. Beyin kap veya microcentrifuge tüp kısımlarına sıkışmış beri tüp ters değil. 
	Not: süspansiyon montaj orta beyin, tüpler olabilir fluorophore Şoklama yavaşlatmak için alüminyum folyo sarılı ve gecede 4 ° C'de depolanan. Gerekli, beyin birkaç gün 4 ° C'de depolanan Eğer, ama ideal olarak en kısa zamanda slaytlar monte edilmelidir.</li>
</ol> 5. Yetişkin D. melanogaster beyin mikroskop slaytlar ve görüntüleme üzerine montaj <ol><li>Yapı bir &#34; Köprüsü &#34; slayt. İki pozisyon &#34; temel &#34; coverslips yaklaşık 1 cm pozitif yüklü bir slayt üzerinde ayrı. Slaydın pozitif yüklü yan bakan emin olun. Coverslips tırnak Lehçe içeren şekil 3 ' te A gösterilen uygun. Ortam takma altında bu temel kapak paket fişi fitil değil emin olmak için tırnak Lehçe ile temel her kapak notu üç dış kenarlarını mühür genellikle yararlıdır. Tırnak Lehçe tamamen kuru izin (10-15 dk) devam etmeden önce.</li>
	<li>Stereomicroscope altında slayt yerleştirin ve iki coverslips arasındaki boşluğa disseke beyin içeren montaj medya çözüm pipette. Daha fazla karşıtlık sağlamak için böylece tezgah üstü paralel boynu ışıklar manevra yararlıdır.</li>
	<li>Beyin slaydın dışına pipette değil dikkatli ekstra bir pipet kullanarak slayttan ortam takma kaldır.</li>
	<li>Fitil uzakta ilave montaj medya. Bu beyin daha doğrusu sonraki adımı sırasında konumlandırılmış olması izin verir.</li>
	<li>Forseps ve stereomicroscope bir çift kullanarak beyin antennal loblar yukarıya bakan ile ızgara desen slaytta getirin</li>
	<li>Yer bir kapak kayma (&#34; Köprüsü &#34;) beyin ( şekil 3 A) bitti. Nerede onlar iletişim köprüsü kapak notu kenarlarında imzalamaya tırnak Lehçe kullanmak &#34; temel &#34; kapak notları.</li>
	<li>P200 pipet kullanarak yavaş yavaş taze montaj medya ( şekil 3 B) ile köprü altında Merkezi boşluğu doldurmak. Merkezi coverslip açık kenarında bir seferde bir damla yerleştirin ve montaj medya merkezi Köprüsü coverslip altında fitil sağlar. Ortam, takma ile tüm boşluğu doldurulana kadar devam sonra mühür üst ve alt açık tırnak boyasıyla.</li>
	<li>Kez tırnak Lehçe kuru, slaytları hemen görüntü veya mağaza lightproof sıkı slayt kutusunda, -20 ° c</li>
	<li>Bir hafta içinde beyni uyarma lazerler ile lazer tarama confocal mikroskop kullanarak görüntü ve filtre küpleri için seçilen ikincil floresan antikor uygun. Z-yığın görüntüleri mantar vücut nöronların genellikle 20 X veya 40 X hedefleri kullanarak elde edilir. Görüntüleme retina photoreceptor nöron daha yüksek büyütme gerektirebilir.</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Yukarıda açıklanan diseksiyon ve görselleştirme yöntemi immunostaining çok çeşitli olarak kullanılabilir ve düşsel kullanma yaşamak. Biz bir genel immunostaining protokol belirttiğimiz ve MARCM içinde bireysel mantar vücut nöronların aksonal Morfoloji görselleştirmek için kullanılabilir bir yol çizer. Ayrıca, bu genel yordamları da diğer beyin bölgeleri sabit içinde görüntüleme için kullanılabilir veya taze disseke yetişkin48,65beyin. Canlı görüntüleme ifade desenleri artırıcı tuzakları, muhabir gen veya mimik çizgileri66, örneğin analiz ederken daha verimli bir yaklaşım sağlar. Önlemek için hücre ölümü GFP sabitlenmemiş dokusunda canlı görüntüleme sırasında yapılardan yakalama, beyin gereken 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) veya HL3 medya48x disseke, köprü slaytlar 1 x PBS (veya HL3) üzerine monte ve daha az 15-20 dk. bakım görüntüsü Ayrıca GFP Floresans görselleştirme ile etkileyebilir beri--dan disseke beyin görüntüleme önce mümkün olduğu kadar Trakea kaldırmak için alınmalıdır.
Mantar beden ve photoreceptor nöronlar morfolojisi değerlendirmek için boyama koşulları nispeten iyi kurulmuş24,61,67, bu hücredeki ilgi belirli bir protein lokalizasyonu iken türleri kapsamlı sorun giderme ve en iyi duruma getirme gerektirebilir. Özellikle, antikor seyreltme, engelleme arabelleği bileşeni konsantrasyon ve fiksasyon, dahil olmak üzere birkaç önemli adımlar en tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar üretmek için optimize edilmelidir. İlk olarak, birincil antikor en yüksek konsantrasyonu tespit edilmelidir. Piyasada bulunan antikorlar genellikle önerilen bir seyreltme (ve genellikle başlangıçta bu konsantrasyon kullanarak başlatın rağmen), bu değerler nadiren Drosophila dokular üzerinde ampirik olarak belirlenir. Bu nedenle, aralığın üstündeki ve altındaki üreticinin başlangıç öneri kez daha özel boyama sonuçları birincil antikor dilutions bir dizi test. Birincil antikor seyreltme doğruluk boyama üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir ve tam olarak belirlenir, birincil antikor içeren zaman beyin inkübe çözümler genel sonuç küçük etkisi ile önemli ölçüde değişebilir. Kuluçka beyin Fas2 antikor birincil antikor ile iki, üç, hatta dört gün 4 ° C'de disseke zaman örneğin, benzer sonuçlar gözlemledim Her ne kadar en az iki gece tavsiye, ayrıca tek bir geceliğine birincil antikor çözüm beyinlerinde inkübe ve tekrarlanabilir boyama elde. Önemlisi, beyin içinde oda sıcaklığında (ya da bir gece 4 ° C'de) 3 h ikincil antikor inkübe saat miktarını sınırlayarak sınırı non-spesifik bağlama ikincil antikorların beyin dokusu ile yardımcı olur.
İkinci olarak, istenmeyen arka plan sinyal ortadan kaldırmak için ek "engelleme" reaktifler kullanmak gerekli olabilir. NGS konsantrasyon ~ %10 1-%10 sığır Serum Albumin (BSA) engelleme ve birincil/ikincil antikor çözümleri veya gecede 4 ° C'de Drosophila embriyo (bkz: ile birincil antikorların öncesi adsorpsiyon ekleme, artan seçenekler şunlardır: referans68, Bölüm 2.9, adım 3).
Biz PTN önerilen tampon olarak tüm fiksasyon için yukarıdaki iletişim kuralı'nı yazılı iken, yıkama ve antikor kuluçka adımları, doku fiksasyon (PIP ve Malzemeler tabloPEM gibi) diğer arabelleklerindeki derin farklılıklar neden olabilir sinyal gücü. Örneğin, önceki çalışmalarda siklin E dokuları da PBS içinde seyreltilmiş geleneksel %4 paraformaldehyde sabit olan zaman içinde larva Imaginal yuvarlak yüzey mümkün değildir ama doku PLP arabellekte (Ken Moberg, kişisel tamir ederken açıkça görülmeye başlıyor göstermiştir iletişim ve başvuru69). Arabellekteki değişikliklere ek bileşenleri, doku fiksasyon de önemli ölçüde immünfloresan etkileyebilir için zaman ve sıcaklık değiştirme boyama ve gerekirse ampirik olarak belirlenebilir. Genel olarak, fiksasyon zaman hücresel bileşenleri yeterli polietilenin için izin vermek yeterince uzun olmalıdır ve uzun vadeli olurken genel olarak hücresel Morfoloji bakımından yeterli bitti-çapraz ve "protein epitopları gömme" önlemek için sınırlı. Bu nedenle, başlangıçta yeni alınan bir birincil antikor boyama koşullarını iyileştirirken, genellikle yaklaşık 20 dk fiksasyon zaman sınırı ve genelde doku soğuk sıcaklıklarda ortadan kaldırır.
Birden çok denetimi birincil ve ikincil antikorları özgüllük yanı sıra transgenes/genetik arka plan gözlenen fenotip üzerindeki etkisini araştırmak için herhangi bir ayirt denemede dahil edilmelidir. Özellikle kullanılan birincil antikor protein ilgi tanır olup olmadığını tespit etmek için bu protein ve/veya protein overexpressing doku eksik sinekler dokudan denetimleri dahil edilmelidir. Aşırı saf antijen protein ek birincil antikor sinek beyindeki diğer epitopları tanır olup olmadığını belirlemek için de kullanılabilir. Son olarak, herhangi bir floresan sinyal zaman birincil antikorlar atlanırsa mevcut seçili ikincil antikorlar tarafından non-spesifik bağlama düzeyini temsil eder.
Birkaç önemli denetimleri de genetik arka plan katkısını veya transgenes boyama yoğunluğu veya nöronal Morfoloji varlığı değerlendirmek için dahil edilmelidir. Örneğin, birden çok transgenes şekil 5 MARCM deneyde kullanılan sinekler içerir (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, küvet &#62; GAL80 ve OK107-GAL4), her biri ayrı ayrı mantar vücut Morfoloji üzerindeki etkileri için analiz edilmelidir. Sinekler bir çok az, mantar vücut Morfoloji OK107-GAL4 ve UAS-CD8-GFP içeren analiz edilmelidir. Ayrıca ısı şok etkisini değerlendirmek için gerekli olabilir ve hsFLP ve FRT82B içeren Flp recombinase üretim mantar vücut geliştirme analiz tarafından üzerinde uçar. MARCM olup olmadığını denetler verilen bir protein özerk aksonal rehberlik hakkında önemli fikir sağlamasına karşın, bu sonuç doğru bir şekilde yapmak için gerekli denetimlerin sayısını bu tekniğin küçük bir sınırlama olabilir. Daha az karmaşık deneylerde benzer denetimler de geçerlidir. Örneğin, nerede GAL4/UAS sistemi bütün nöronlar ilgi bir protein devirme ifade için bir RNAi transgene ile birlikte kullanılan bir deneyi ele alalım. Bu deneyde, en az iki transgenes mevcut olacaktır: Elav-GAL4 ve UAS RNAi transgene gibi bir pan-nöronal GAL4 sürücüsü. Her biri bu transgenes yalnız içeren sinekler nöronlarda mantar vücut morfolojisi ek olarak her iki transgenes aynı sinek içinde sinekler nerede liman deneysel durumu araştırılmalıdır.
Son olarak, protein ilgi mantar vücut nöronlarda ifade olup olmadığını belirlemek için bu ortak leke beyin için genellikle Fas2 antikorlar ile gereklidir. Alternatif olarak, floresan proteinler gibi GFP, RFP veya membran CD8-GFP bağlı aynı zamanda GAL4/UAS sistemi kullanılarak ve faiz protein tanıma antikorlar ile birlikte kullanılan ifade edilebilir. Fas2 sadece mantar vücut α ve β loblar formu fasciculated akson tanır, GAL4 dayalı, membran bağlı CD8-GFP kullanımı mantar vücut nöronlar işaretlemek için özellikle yararlı beri.
Kusurları aksonal rehberlikte genellikle % 100 penetrant değildir ve hatta aynı genotip beyinlerinin bazı değişkenlik gösterebilir. Ne zaman yeni analiz mutant gen kusurları için mantar vücut veya photoreceptor bunun içinde oluşturulan, bu nedenle, farklı gen ve yaklaşımların bir arada kullanılan. Literatürde en çalışmaları bir protein aksonal rehberlik kontrol hücre özerk bir rol oynar olup olmadığını araştırmak için birkaç farklı yaklaşım kullanın: Ben) bunun analizini kusurları (tercihen farklı nu kullanarak homozigoz null sineklill allelleri), II) bunun analizini kusurları nöronlar (genellikle üzerinden RNAi), sadece ilgi protein eksik sinek içinde III) kılavuz kusurları ve IV MARCM analizi) kurtarma gene nerede homozigoz null nöronlarda yeniden ifade deneyler uçar. İdeal olarak, genotip başına birkaç düzine beyin nöronal Morfoloji kusurları için analiz edilebilir.
İletişim kuralı öncelikle odaklanır sabit doku içinde proteinlerin immünfloresan yerelleştirme burada açıklanan rağmen bu tekniğin bazı gelecekteki uygulamalar görüntü canlı beyin dokusu ile geliştirilmektedir. Bir kez beyin (genellikle hücre kültür medyada) disseke, onlar sonra birkaç gün 25 ° C'de kültürlü olabilir Bu ex vivo kodlamayla yöntemleri çok çeşitli yaralanma70,71, hücre içi takip axon rejenerasyon teşvik protein aktivite gibi biyolojik süreçleri araştırmak amacıyla geliştirilmekte olan sinyal dynamics72ve nöronal gelişim73.

Drosophila sinir sistemi insanlar ve kemirgenler, karmaşıklığı daha iyi anlamak, omurgalı karşıtları için güçlü ve ulaşılabilir bir modelini sağlayan daha küçük olmasına rağmen. Birçok durumda, omurgalı ve sinekler genleri sinir sistemi gelişimi mekanizmaları dikte çok benzer protein kodlamak. Aslında, birçok gen omurgalılarda nöronal gelişim için de dahil olmak üzere, sinekler orthologs sinyal yollar bu denetim desenlendirme, neurogenesis ve aksonal rehberlik1,2,3 bu işe gerekli ,4,5. Örneğin, netrin bir ligand memeliler ve D. melanogaster6,7,8' aksonal rehberlik için gerekli olur. Netrin ilk olarak embriyonik piliç beyin doku6izole iken, sonraki çalışmalar bu netrin korunmuş bir rol oynar embriyonik merkezi sinir sistemi (MSS) geliştirilmesi sırasında Drosophila8' ortaya çıkardı. Diğer çalışmalar genetik ekranlar embriyonik Drosophila içinde CNS korunmuş ligandlar ve reseptörleri Drosophila ve omurgalıların9bunun için gerekli belirlemek için kullandık.
Embriyonik anında CNS kapsamlı bir şekilde geçmişte ligandlar, reseptörleri ve hücre içi sinyal proteinleri aksonal rehberlik8,9için gerekli belirlemek için kullanılmıştır iken, son iş hangi birçok şekillerde araştırmış Bu proteinler de geliştirme daha sonraki aşamalarında bunun kararları denetler. Özellikle, soruşturma mantar vücut (MB) ve retina photoreceptor nöron geliştirme (şekil 1) mekanizmaları içgörü bu denetimi kılavuz, sinaps oluşumu, akson budama ve çeşitli diğer yönleri nöronal sağlamıştır geliştirme10,11,12,13,14,15,16,17. Photoreceptor nöronlar sinek retina lamina denilen yetişkin beyin bölgelerine bağlanmak ve medulla ve mantar vücut nöronlar ise beyin, (18,19tarafından gözden) görsel bilgi geçişi için kritik vardır Merkezi olarak sinek beyinde bulunan ve öğrenme ve hafıza20,21için gereklidir. Photoreceptor nöronlar ve içsel nöronlar Kenyon hücreleri denilen mantar organlarının Post sinaptik hedefleri bulmak için evrimsel korunmuş diffusible ve ilgili kişi-bağımlı aksonal rehberlik mekanizmaları kullanmaktadır. Yetişkin sinekli görünür olmasının yanı sıra, photoreceptor ve MB nöronlar da doğrudan larva ve pupa antikorlar veya muhabir gen22,23,24,25ile görüntülenmeyecektir. Yetenek kolayca farklı gelişim zaman noktalarda nöronlar bu iki kümesi görselleştirmek için nöronal gelişim birçok yönleri için süper model olarak bunların kullanımı teşvik etmiştir.
Bir model olarak normal sinir sistemi gelişimi mekanizmaları anlamak için kullanılan ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda sinekler de insan hastalıkları, kırılgan X Sendromu (FXS)26 da dahil olmak üzere çok çeşitli doğru modelleri hizmet verebilir göstermiştir , Fikri Engellilik (ID)27,28,29,30,31ve diğerleri32. Örneğin, ZC3H14 moleküler işlevinin çalışması için son zamanlarda insan Fikri Engellilik için bağlantılı bir gen biz sinek manken Nab230denilen anında ZC3H14 ortholog, bir null alleli kullanarak kimliği oluşturdu. Nab2 eksik sinekler ciddi hafıza bozuklukları ve Poli(a) kuyruğu genişletilmiş, ne recapitulating insan hastalarda gözlenen veya hasta hücre hatları33,34türetilmiş. Önemlisi, sinekler Nab2 de eksik onların yetişkin mantar organları34, FXS Sendromu gen FMR135eksik sinekli gözlenen için benzer şiddetli beyin Morfoloji hataları görüntüler. Böylece, sinekler normal beyin gelişimi ve bunu bozmaya hastalıkları eğitim için önemli model organizma hizmet verebilir.
Son olarak, davranışı, genetik araçlar, geniş dizi ile birlikte izlemek için yüksek aktarım yöntemleri erişilebilirlik olun Drosophila bir model organizma gibi karmaşık davranışlar, kontrol beyin bölgeleri tanımlamak için tercih öğrenme ve bellek, uyku, Kur yapma, susuzluk ve diğerleri36,37,38,39. Bir sinek genetikçi'nın "araç kutusu" merkezinde bir özellikle yararlı bir araç (Şekil 2) GAL4/UAS sistemidir. Bu sistem40,41 Gal4 transkripsiyon harekete geçirmek doku belirli ifade genleri veya transgenes aşağı, bir yukarı etkinleştirme sıra (UAS) ifade artırmak için kullanılır. Bu sistemin değişiklikler, örneğin, tam olarak kontrol uyarılabilirlik belirli nöronlar42,43, overexpress veya knock-down belirli genler faiz44, , araştırmacılar izin 45, gerçek zamanlı kalsiyum dynamics in vivo46çözümlemek ve hızlı reporter genler nöronal soy41işaretlemek için. Mitotik rekombinasyon de mozaik analizi ile bir Repressible hücre işaretçisi (MARCM) sistem12,47yaratılması için izin GAL4/UAS sistemiyle birleşimi. MARCM kapsamlı tek nöron izleme aksonal rehberlik12,47için gereken hücresel sinyal bileşenlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bunlar ve diğer teknikleri değerli bakış açısı çok sayıda sinir sistemi işlevi için gerekli hücresel mekanizmaları üzerinde sağlanan rağmen çoğu Drosophila beyin ilk disseke gerekir; dikkatli kaldırma beyin beyin bölgeleri arasında doğru beyin morfoloji ve bağlantı desenleri korumak için gereklidir. Aşağıdaki iletişim kuralı olarak mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanırörnek olarak nöron popülasyonları diseksiyon ile yol gösterir ve immünfloresan yetişkin boyama Drosophila beyin.

<table><tbody><tr><td>Microdissection forceps/tweezers</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard dishes</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>Available from amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2 Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Antibody</td><td>Aves Lab</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Services</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Phosphate Buffer monobasic</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na phosphate Buffer dibasic</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>fingernail polish</td><td>Electron Microscope Services (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>stereomicroscope</td><td>Leica S6D with KL300 LED light source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-well dish (spot plate)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutator/rocker</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 or 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>35mm dish</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Potential Fixation Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td></tr><tr><td>PLP buffer</td><td></td><td></td><td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td></tr><tr><td>PEM buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly Stocks available from Bloomington&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Pan-neuronal GAL4 driver</td></tr><tr><td>w*;;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&gt;Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&gt;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&gt;GAL80;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub&gt;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>MARCM stock for flipping X chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td></tr><tr><td>w*; FRTG13, Tub&gt;GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&gt;GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td></tr></tbody></table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Sinir sistemi gelişimi çeşitli sinyal yolları ve düzenleyici ağları tarafından koordine olayları sıralı bir dizi içerir. Birçok bu yollar dahil proteinlerin örümceklerle memeliler ve meyve sineği Drosophila melanogasterbenzer organizasyon ilkeleri bunlar geliştirilmesi sırasında bulunduğunu düşündüren, gibi diğer Ökaryotlar arasında korunmuş organizmalar. Önemlisi, Drosophila neurogenesis, farklılaşma, aksonlar rehberlik ve synaptogenesis de dahil olmak üzere memelilerde gereken işlemlerini düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için yaygın olarak kullanılmıştır. Sinekler de başarılı bir şekilde insan nörogelişimsel hastalıkları çeşitli modellemek için kullanılmaktadır. Burada adım adım mikrodiseksiyon, fiksasyon ve yetişkin Drosophila beyin içinde proteinlerin immünfloresan yerelleştirme için bir protokolü açıklar. Bu protokol iki örnek nöron popülasyonları, mantar vücut nöronlar ve retina photoreceptors odaklanır ve bireysel mantar vücut nöronlar Repressible hücre işaretçisi (MARCM) tekniği ile mozaik analizi kullanarak izlemek için isteğe bağlı adımları içerir. Hem vahşi tipi ve mutant beyin örnek verilerden bir puanlama ölçütünü aksonal rehberlik kusurları için kısa bir açıklama ile birlikte gösterilir. Bu iletişim kuralı mantar vücut morfolojisi soruşturma için iki köklü antikorlar vurgular ve photoreceptor nöronlar, diğer Drosophila beyin bölgeleri ve diğer beyin bölgeleri içinde proteinlerin yerelleştirme da olabilir Bu iletişim kuralını kullanan araştırıldı.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

19.2K Görüntüleme.  The College of Wooster. Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Video: Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Optik lob görselleştirmesi için larva ve erişkin drosophila beyinlerinin diseksiyonu, immünohistokimyası ve montajı

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Gelişim Biyolojisi

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Nörobilim

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Drosophila melanogaster'de Akson Ölümü Sırasında Aksonların ve Sinapslarının Morfolojik ve Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

Drosophila Merkezi Beyninde Yetişkin Nörogenezini Uyarmak ve Analiz Etmek

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

Direct Cryosectioning of Drosophila Heads for Enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression patterns. Traditional methods often involve challenges such as performing complex dissection, maintaining tissue integrity, and visualizing specific expression patterns during high-resolution imaging. We present an optimized protocol that combines cryosectioning with fluorescence staining and immunostaining. This method improves tissue preservation and signal clarity and reduces the need for laborious dissection for Drosophila brain imaging. The method entails rapid dissection, optimal fixation, cryoprotection, and cryosectioning, followed by fluorescent staining and immunostaining. The protocol significantly reduces tissue damage, enhances antibody penetration, and yields sharp, well-defined images. We demonstrate the effectiveness of this approach by visualizing specific neural populations and synaptic proteins with high fidelity. This versatile method allows for the analysis of various protein markers in the adult brain across multiple z-planes and can be adapted for other tissues and model organisms. The protocol provides a reliable and efficient tool for researchers conducting high-quality immunohistochemistry in Drosophila neurobiology studies. This method's detailed visualization facilitates comprehensive analysis of neuroanatomy, pathology, and protein localization, making it particularly valuable for neuroscience research.

This study presents a simplified protocol for tissue processing involving decapitation, fixation, cryosectioning, fluorescence staining, immunostaining, and imaging, which can be extended to confocal and multiphoton imaging. The method maintains efficacy comparable to complex dissections, bypassing the need for advanced motor skills. Quantitative image analysis provides extensive investigative potential.

Gelişmiş beyin floresan boyaması ve immün boyama için Drosophila kafalarının doğrudan kriyoseksiyonu

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression ...

Visualizing Mushroom Body Neurons in Drosophila Brains via Immunostaining

Source: Kelly, S. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56174">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a detailed immunostaining protocol to visualize phenotypic defects in the mushroom bodies of mutant Drosophila brains. The protocol involves using antibodies against Fas2, a protein involved in axonal guidance that facilitates the proper morphological and functional development of the mushroom body.

Drosophila Beyinlerindeki Mantar Vücut Nöronlarının İmmün Boyama ile Görüntülenmesi

1. Fixation and Immunofluorescent Staining Procedure

	Using a p200 pipette, transfer dissected brains from the 9-well dish to a 0.5 mL microcentrifuge ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Developmental and Pediatric Disorders

Mounting Adult Drosophila Brains: A Method to Prepare Slides for Confocal Imaging

Source: Kelly, S. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56174/" target="_blank">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method of mounting intact brains from adult flies under a bridge slide and shows the protocol performed on immunostained brains for fluorescent microscopy.

Yetişkin Drosophila Beyinlerinin Montajı: Konfokal Görüntüleme için Slaytlar Hazırlama Yöntemi

Source: Kelly, S. M., et al. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. ...

Drosophila melanogaster (meyve sineği)

Yetişkin

Drosophila Adult Brain Dissection: A Method in Fly Neurobiology

Source: Kelly, S. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56174/" target="_blank">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to dissect and isolate the adult Drosophila brain&#8211;a procedure necessary for visualizing the organ, which is otherwise obscured by the cuticle, eye, and tracheal tissue. The example protocol shows a detailed demonstration yielding high-quality preparations that can be used for immunostaining and imaging methods in Drosophila neurobiology.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler