我々 は最初の教材 SMK 脳解剖技術 Changhui 朴とたラン Vrailas モーティマーを感謝したいです。私たちも批判的に、原稿を読み取るためケン モーベリの実習グループ、特にクリス ラウンドのメンバーに感謝します。Fas2 を認識する抗体 (1 4) chaoptin (24B10) が銀行ハイブリドーマ発達研究から得られました。シーモア ・ ベンザー、南司・ コリー24,60,61抗体 24B10、DSHB に預けて、コーリー ・ グッドマン22,23,56抗体 1 4、DSHB に預けています。はえの在庫は、ブルーミントンのストック センターから得られました。図 4A に脳をイメージするオハイオ州の農業研究および開発センター (OARDC) MCIC イメージング センター共焦点顕微鏡の使用のために感謝したい、B. SMK は発育からの助成金によってサポートされる (1 R15 HD084241 01A1)。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

上記郭清と可視化の方法はさまざまな免疫染色で使用することができ、ライブ イメージング アプリケーション。我々 は一般的な免疫染色プロトコルの概要を示しているし、個々 のきのこ体ニューロンの軸索形態を視覚化するために MARCM を使用できます 1 つの方法を強調しています。さらに、これらの一般的な手順は固定で他の頭脳領域を画像にも使用できます。 または新たに切り裂かれた大人脳48,65。ライブ イメージングは、例えば模倣66、やレポーター遺伝子エンハンサー トラップの発現パターンを解析するときより効率的なアプローチにあります。防ぐために未固定組織で GFP のライブ イメージ投射の間の細胞死からの人工物をキャプチャするには、脳必要がありますリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) または HL3 メディア48x 1 に解剖、PBS (または HL3) x 1 の橋のスライドのマウントし、未満 15 20 分ケアのイメージそれは GFP 蛍光の可視化と干渉できるので解剖脳イメージング前からできるだけ多くの気管を削除するも撮影する必要があります。
きのこ体と光受容ニューロンの形態を評価するための染色条件では比較的老舗24,61,67, これらの細胞への関心の特定の蛋白質の局在化種類は、広範なトラブルシューティングと最適化に必要があります。特に、抗体希釈、ブロック バッファー成分濃度、固定などいくつかの重要なステップは、最も再現性のある、信頼性の高い結果を生成する最適化必要があります。まず、一次抗体の最適濃度を決定する必要があります。市販抗体はしばしば推奨希釈を持って (とその濃度を使用して、まず、多くの場合最初)、これらの値はほとんど経験的に決定ショウジョウバエのティッシュの。したがって、テストは上と下の開始提案を多くの場合で、製造元の範囲がより特定の染色による一次抗体希釈液のシリーズ。一次抗体希釈精度を染色に大きな影響を持つことができ、的確に判断する必要があります時間の脳は一次抗体を含む培養しながらソリューションすることができます全体の結果にはほとんど影響によって大きく変動。たとえば、我々 は 4 ° C で 3 つ、または 4 日間、2 つの脳 Fas2 抗体一次抗体とインキュベート解剖と同様の結果を観察しています。少なくとも 2 泊をお勧めしますがまた一次抗体溶液中の脳を一晩インキュベートし、再現性のある染色を取得しました。脳組織へ二次抗体の制限非特異的結合が重要なは、脳に部屋の温度 (または 4 ° C で 1 泊) 3 h に二次抗体の孵化の時間の量を制限できます。
第二に、不要なバック グラウンド信号を除去するために追加「ブロッキング」試薬を使用する必要があります。オプションがあります 1-10% ウシ血清アルブミン (BSA) を追加するブロックやプライマリ/セカンダリ抗体ソリューションまたはショウジョウバエの胚 (を参照してください 4 ° C で一晩一次抗体の前吸着 〜 10% に NGS の濃度を増加させる68、セクション 2.9、および参照手順 3)。
深遠な違い、洗浄、抗体培養手順 (PLP と PEM、材料表に記載) など他のバッファーでティッシュの固定可能性があります一方、我々 はすべて固定用推奨バッファーとして PTN を使用して上記プロトコルを書かれている、信号の強さ。たとえば、以前の調査は示したサイクリン E は組織が、PBS で希釈した伝統的な 4% パラホルムアルデヒドで固定するとき、幼虫成虫ディスクで検出可能ですが、組織は PLP バッファー (ケン モーベリ、個人で修正されるときがはっきりと見える通信、および参照69)。バッファーの変更に加えて、コンポーネント、ティッシュの固定、蛍光にも大きく影響するため、温度、時間を変更することは染色および必要な場合経験的決定ことができます。一般に、固定時間細胞成分の十分な架橋を許可するのに十分な長さでありながら全体として細胞の形態の長期的な保守限定に架橋し蛋白質エピトープの「埋め」を防ぐために十分。ですから、当初新たに買収した一次抗体の染色条件を最適化するとき通常約 20 分固定時間制限より冷たい温度で組織を修正することはしばしば。
第一次および二次抗体の特異性だけでなく、観察された表現型の遺伝子/遺伝的背景の影響を調査するため, 蛍光抗体法実験のいくつかのコントロールが含まれます。具体的に使用されている一次抗体が興味の蛋白質を認識するかどうかを確認、このタンパク質やタンパク質を過剰発現組織に欠けているハエから組織をコントロールとして含まれている必要があります。一次抗体がハエの脳に他のエピトープを認識するかどうかを決定するため余分な精製抗原タンパク質添加を含めることもできます。最後に、任意の蛍光信号の一次抗体を省略すると、現在は選択した二次抗体による非特異的結合のレベルを表します。
遺伝的背景の貢献や染色強度または細胞の遺伝子の存在を評価するためにいくつかの重要なコントロールが含めます。たとえば、図 5の MARCM 実験で使用されるハエを含む複数の遺伝子 (hsFLP、UAS CD8 GFP、FRT82B、浴槽 &#62;、GAL80 と OK107 GAL4)、きのこ体の形態に及ぼす影響を個別に分析します。ハエの非常に最低、きのこボディ形態で OK107 GAL4 と UAS CD8 GFP の両方を含むを分析する必要があります。ヒート ショックの影響を評価する必要があります、分析によってきのこ体における Flp リコンビナーゼ生産ハエ hsFLP と FRT82B の両方を含みます。MARCM は、特定のタンパク質が自律的軸索ガイダンスを制御するかどうかの重要な洞察を提供できますが、この結論を正確に行うために必要なコントロールの数は、この技法のマイナーな制限をすることができます。それほど複雑な実験では、類似のコントロールも適用されます。例えば、 GAL4/UASシステムがすべてのニューロンの興味の蛋白質のノックダウン式に RNAi 遺伝子との組み合わせで使用されている実験を取る。この実験では、少なくとも 2 つの遺伝子がある: elav-GAL4とUAS RNAi遺伝子などのパン神経 GAL4 ドライバー。ハエが同じ場で両方の遺伝子を抱く実験条件に加えて、単独でこれらの遺伝子の各を含むハエのきのこ体神経細胞の形態を調べる必要があります。
最後に、きのこ体神経に興味の蛋白質を表現するかどうか判断する必要がある通常共同染色脳に Fas2 抗体また、 GAL4/UASシステムを使用し、興味の蛋白質を認識する抗体と組み合わせて使用される蛍光タンパク質 GFP、RFP、または膜が CD8 GFP をバインドされているようを表すこともできます。Fas2 だけきのこ体の α と β の葉を形成した軸索が認識、GAL4 駆動、膜結合型 CD8 GFP の使用が以来きのこ体神経をマーキングする場合に役立ちます。
軸索ガイダンスの欠陥は、しばしば 100% の浸透と同じ遺伝子型のも脳は、いくつかの変動を示すことがあります。したがって、きのこ体や光受容体経路で生成される欠陥の突然変異体の対立遺伝子と新しく分析、異なる対立遺伝子とアプローチの組み合わせを利用する必要があります。文献の研究のほとんどはタンパク質が軸索ガイダンスを制御する細胞自律的役割を果たしているかどうかを調査するいくつかの異なるアプローチを使用: 私) (できれば異なるニューを使用して null のホモのハエで欠陥経路の解析ll の対立遺伝子)、ii) (RNAi) によって通常のニューロンにだけ興味の蛋白質に欠けているハエの欠陥経路の解析 iii) 草分け欠陥と iv の MARCM 解析) 遺伝子のホモ null のニューロンの再発現実験を救出ハエ。理想的には、遺伝子ごとのいくつかのダース脳神経細胞形態の欠陥を分析します。
プロトコルは固定ティッシュ内の蛋白質の蛍光像定位に主に焦点をここで説明するがこの手法のいくつかの将来のアプリケーションは、画像ライブ脳組織に開発されています。25 ° C で数日間、その後培養することができます脳は、(通常の細胞培養媒体) は解剖して、一度彼らこれら体外培養方法は、さまざまな傷害70,71, 細胞軸索再生を促進するタンパク質の活性などの生物学的プロセスを調査するために開発されています。シグナル伝達ダイナミクス72と神経の開発73。

ショウジョウバエ神経系は人間および齧歯動物のそれより小さいが、その複雑さは、脊椎動物の対応を理解するための強力な親しみやすいモデルを提供します。多くのケースでは、ハエと脊椎動物のゲノムは神経系発達のメカニズムを定める非常によく似たタンパク質をエンコードします。実際には、遺伝子の多くは脊椎動物の神経の開発のため含め、ハエのオルソログ遺伝子関与しているシグナル伝達経路の制御パターン、ニューロン新生、軸索ガイダンス1,2,3、必要な ,4,5。たとえば、ネトリン哺乳類とキイロショウジョウバエ6,7,8の軸索ガイダンスに必要なリガンドであり。ネトリンだった鶏胚脳組織6から分離されたが、その後の研究によって、そのネトリンショウジョウバエ8胚中枢神経系 (CNS) の開発中に保存された役割を果たしているが明らかにしました。他の研究は、保存されたリガンドと受容体のショウジョウバエと脊椎動物の両方9の経路探索に必要な識別するために萌芽期のショウジョウバエ中枢神経系における遺伝子スクリーニングを使用しています。
中枢神経系胚のフライは過去にリガンド、受容体と軸索ガイダンス8,9に必要な細胞内シグナル伝達タンパク質を識別するために広く使用されています、一方の最近の作品の多くで方法を調査します。これらの蛋白質はまた開発の後の段階の間に経路決定を制御します。具体的には、そのコントロールの草分け、シナプス形成、軸索プルーニングおよび神経の他のいくつかの側面きのこ体 (MB) および網膜光受容ニューロンの開発 (図 1) の調査は、メカニズムに洞察力を提供して開発10、11,12,13,14,15,16,17。光受容器ニューロンは、ラミナと呼ばれる大人の脳の領域に飛ぶ網膜を接続し、延髄と脳 (18,19によって再検討されました)、きのこ体神経細胞中に視覚情報を中継するための重大である、一元的にハエの脳に位置し、学習と記憶の20,21に必要な。ケニヨン細胞と呼ばれるきのこの体の本質的なニューロンと光受容器ニューロン シナプス ターゲットを見つけるに進化上保存された拡散性と接触依存性軸索ガイダンス機構を利用します。成虫の表示だけでなく、感光体と MB ニューロンも直接で視覚化すること幼虫と蛹抗体やレポーター遺伝子22,23,24,25。ニューロン発達の異なる時点でのこれらの 2 つのセットを簡単に視覚化する能力は、神経の開発の多くの側面の見事なモデルとしての使用を推進しています。
通常の神経系発達のメカニズムを理解するためのモデルとして使用されているだけでなく最近の研究を示しているハエがさまざまな壊れやすい X シンドローム (FXS)26 を含む人間の病気の正確なモデルとしても利用できます。、知的障害者 (ID)27,28,29,30,31, その他32。たとえば、ZC3H14 の分子機能を勉強する最近人間の知的障害にリンクされて遺伝子我々 モデルを作成飛ぶ Nab230と呼ばれるフライ ZC3H14 相同のヌル対立遺伝子を使用して ID の。ハエ Nab2 を欠けている重度の記憶障害があると人間の患者で観察されるものの概説ポリ a の尾を拡張、または患者由来細胞ライン33,34。重要なは、Nab2 にまた欠けているハエは、その大人のきのこ体34, FMR135FXS 症候群遺伝子に欠けているハエで観察されるものと同様で重篤な脳形態の欠陥を表示します。したがって、ハエは、通常の脳の発達やそれを混乱させる疾患を研究する重要なモデル有機体として使用できます。
最後に、利用可能な遺伝的ツールの広大な配列と組み合わせて、動作を監視する高スループット メソッドのアクセシビリティをショウジョウバエなど複雑な行動を制御する脳の領域を識別するための選択のモデル生物学習、記憶、睡眠、求愛、口渇等36,37,38,39。ハエの遺伝学者の「ツールボックス」の中心には特に役に立つツールの 1 つは、GAL4/UA システム (図 2) です。このシステム40,41は、遺伝子または遺伝子下流の上流活性化シーケンス (UAS) の発現を増強するのに Gal4 転写活性化因子の組織特異的発現を使用します。このシステムの変更は、たとえば、正確に特定のニューロン42,43、過剰または関心44,の特定の遺伝子をノックダウンの興奮性を制御する研究者を許可している45、リアルタイムのカルシウム動態体内46を分析し、神経系統41をマークするレポーター遺伝子を表現。分裂の再結合が抑制型セル マーカー (MARCM) システム12,47モザイク解析の作成も許可と GAL4/UAS システムの組み合わせ。MARCM は、単一ニューロン トレースで軸索ガイダンス12,47に必要な細胞のシグナリングのコンポーネントを識別するために広く使用されています。これらおよび他の技術は、神経系の働きに必要な細胞メカニズムに関する貴重な洞察力の数を提供している、ほとんどが必要; 最初ショウジョウバエ脳の解剖脳を慎重に除去が頭脳の地域間の正しい脳形態と接続パターンを保持する必要です。次のプロトコルを使用して、きのこ体と光受容ニューロン例として神経集団に従って郭清と免疫蛍光染色大人のショウジョウバエ脳します。

<table><tbody><tr><td>Microdissection forceps/tweezers</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard dishes</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>Available from amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2 Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Antibody</td><td>Aves Lab</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Services</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Phosphate Buffer monobasic</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na phosphate Buffer dibasic</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>fingernail polish</td><td>Electron Microscope Services (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>stereomicroscope</td><td>Leica S6D with KL300 LED light source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-well dish (spot plate)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutator/rocker</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 or 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>35mm dish</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Potential Fixation Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td></tr><tr><td>PLP buffer</td><td></td><td></td><td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td></tr><tr><td>PEM buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly Stocks available from Bloomington&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Pan-neuronal GAL4 driver</td></tr><tr><td>w*;;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&gt;Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&gt;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&gt;GAL80;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub&gt;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>MARCM stock for flipping X chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td></tr><tr><td>w*; FRTG13, Tub&gt;GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&gt;GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td></tr></tbody></table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

神経系の開発には、いくつかのシグナル伝達経路と制御ネットワークによって調整されますイベントの一連が含まれます。これらの経路に関与するタンパク質の多くは哺乳類とミバエショウジョウバエ、似たような組織化原理がこれらの開発中に存在することを示唆しているように、他の真核生物の間保存されました。生物。重要なは、ショウジョウバエは、神経新生、分化、軸索誘導、シナプス形成を含む哺乳類に必要なプロセスを制御する細胞・分子メカニズムを識別するために広く使用されています。ハエは、様々 な人間の神経疾患をモデルに正常に使用されているも。ここで順を追ってレーザーマイクロダイ セクション、固定、および大人のショウジョウバエ脳内のタンパク質の蛍光ローカリゼーションのプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、2 例の神経集団、きのこ体神経および網膜光受容体に焦点を当てし、抑制型セル マーカー (MARCM) を用いたモザイク解析を使用して個々 のきのこ体ニューロンをトレースするオプションの手順が含まれています。野生型と変異型の両方の脳からサンプル データが軸索ガイダンス欠陥の採点基準の簡単な説明と共に表示されます。このプロトコルは、きのこ体光受容器ニューロン、他のショウジョウバエの脳と他の頭脳領域内の蛋白質の局在化の形態を調査するため 2 つの確立された抗体を強調表示することができます。このプロトコルを使用して調査しました。

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

19.2K ビュー.  The College of Wooster. このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

生物学

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

発生生物学

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

神経科学

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

解剖や成虫の免疫染色から<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

Direct Cryosectioning of Drosophila Heads for Enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression patterns. Traditional methods often involve challenges such as performing complex dissection, maintaining tissue integrity, and visualizing specific expression patterns during high-resolution imaging. We present an optimized protocol that combines cryosectioning with fluorescence staining and immunostaining. This method improves tissue preservation and signal clarity and reduces the need for laborious dissection for Drosophila brain imaging. The method entails rapid dissection, optimal fixation, cryoprotection, and cryosectioning, followed by fluorescent staining and immunostaining. The protocol significantly reduces tissue damage, enhances antibody penetration, and yields sharp, well-defined images. We demonstrate the effectiveness of this approach by visualizing specific neural populations and synaptic proteins with high fidelity. This versatile method allows for the analysis of various protein markers in the adult brain across multiple z-planes and can be adapted for other tissues and model organisms. The protocol provides a reliable and efficient tool for researchers conducting high-quality immunohistochemistry in Drosophila neurobiology studies. This method's detailed visualization facilitates comprehensive analysis of neuroanatomy, pathology, and protein localization, making it particularly valuable for neuroscience research.

This study presents a simplified protocol for tissue processing involving decapitation, fixation, cryosectioning, fluorescence staining, immunostaining, and imaging, which can be extended to confocal and multiphoton imaging. The method maintains efficacy comparable to complex dissections, bypassing the need for advanced motor skills. Quantitative image analysis provides extensive investigative potential.

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression ...

Visualizing Mushroom Body Neurons in Drosophila Brains via Immunostaining

Source: Kelly, S. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56174">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a detailed immunostaining protocol to visualize phenotypic defects in the mushroom bodies of mutant Drosophila brains. The protocol involves using antibodies against Fas2, a protein involved in axonal guidance that facilitates the proper morphological and functional development of the mushroom body.

免疫染色によるショウジョウバエ脳のキノコ体ニューロンの可視化

1. Fixation and Immunofluorescent Staining Procedure

	Using a p200 pipette, transfer dissected brains from the 9-well dish to a 0.5 mL microcentrifuge ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Developmental and Pediatric Disorders

Mounting Adult Drosophila Brains: A Method to Prepare Slides for Confocal Imaging

Source: Kelly, S. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56174/" target="_blank">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method of mounting intact brains from adult flies under a bridge slide and shows the protocol performed on immunostained brains for fluorescent microscopy.

成虫ショウジョウバエの脳のマウント:共焦点イメージング用のスライドを準備する方法

Source: Kelly, S. M., et al. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. ...

Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）

成虫

Drosophila Adult Brain Dissection: A Method in Fly Neurobiology

Source: Kelly, S. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56174/" target="_blank">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to dissect and isolate the adult Drosophila brain&#8211;a procedure necessary for visualizing the organ, which is otherwise obscured by the cuticle, eye, and tracheal tissue. The example protocol shows a detailed demonstration yielding high-quality preparations that can be used for immunostaining and imaging methods in Drosophila neurobiology.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

要約

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この動画の章

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

視葉可視化のためのショウジョウバエの幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

解剖や成虫の免疫染色から

ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

脳蛍光染色および免疫染色を強化するためのショウジョウバエ頭部の直接凍結切片

免疫染色によるショウジョウバエ脳のキノコ体ニューロンの可視化

成虫ショウジョウバエの脳のマウント:共焦点イメージング用のスライドを準備する方法

ショウジョウバエ成人の脳解剖:ハエの神経生物学の方法

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

要約

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キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

解剖や成虫の免疫染色から

ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

免疫染色によるショウジョウバエ脳のキノコ体ニューロンの可視化

成虫ショウジョウバエの脳のマウント:共焦点イメージング用のスライドを準備する方法

ショウジョウバエ成人の脳解剖:ハエの神経生物学の方法

視葉可視化のためのショウジョウバエの幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

脳蛍光染色および免疫染色を強化するためのショウジョウバエ頭部の直接凍結切片