Optik loblara özel bir vurgu yaparak larva ve yetişkin Drosophila beyinlerini incelemek, immünoboyamak ve monte etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Optik lobun karmaşık üç boyutlu organizasyonu göz önüne alındığında, burada açıklanan protokolün araştırmacılara montaj oryantasyonu ile görselleştirilen optik lob yapıları arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamalarını sağlayacağı tahmin edilmektedir. Bu protokol, hem larva hem de yetişkin optik loblar için, her biri görüntüleme sırasında belirli bir optik lob yapısını görselleştirmek için en uygun açıyı sağlayan üç montaj stratejisini tanımlar.
Diseksiyona başlamadan önce, üç oyuklu bir plakanın tüm kuyucuklarını kuyu başına 400 mikrolitre PBS ile doldurun ve bir drosophila şişesinin veya şişesinin içinde sürünen 15 dolaşan üçüncü instar larvasını nazikçe seçmek için forseps kullanın. Tüm larvaları üç kuyucuklu plakanın ilk kuyusuna yerleştirin ve bir larvayı plakanın orta kuyusuna aktarın. Baskın olmayan eli kullanarak, larvanın gövdesini kuyu tabanında tutun ve larva ağız kancasını nazikçe kavramak için baskın eli kullanın.
Beyni çıkarmak için ağız kancasını vücuttan uzaklaştırın. Ardından, hayali diskler de dahil olmak üzere aksesuar dokuları çıkarın. Sonra beyni plakanın üçüncü kuyusuna yerleştirin.
Tüm beyinler diseke edildiğinde, PBS'yi üçüncü kuyudan dikkatlice çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın ve beyni su altında tutmak için yeterli çözelti bırakın. Kuyuya 500 mikrolitre taze hazırlanmış soğuk fiksasyon çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi forseps ile hafifçe karıştırın, böylece beyin tabağın içinde döner ve kuyuyu bir cam mikroskop lamı ile örtün.
Daha sonra dokuyu sabitlemek için çanağı 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Beyinleri yıkama başına 400 mikrolitre taze PBS artı triton ile beş kez yıkayın. Beyinler artık birincil antikor inkübasyonu için hazırdır.
Yetişkin beyin diseksiyonları için, 10 ila 15 yetişkin sineği uyuşturun ve onları buz üzerinde bir laboratuvar mendili üzerine yerleştirin. Bir yetişkin sineği kanattan nazikçe 400 mikrolitre PBS içeren üç kuyulu bir diseksiyon plakasının bir kuyusuna aktarmak için forseps kullanın. Sineğin göğüs kafesini kuyunun tabanına karşı tutmak için baskın olmayan elde bir çift forseps kullanın ve başını vücudun geri kalanından nazikçe çekmek için baskın el ile ultra ince forseps kullanın.
Vücudu baskın olmayan elinizle bir laboratuvar mendilinin üzerine atın ve baskın elinizi başınızı hortum tarafından kuyunun tabanına karşı tutmak için kullanın. Beyin açığa çıkana kadar gözler arasındaki kütikülün her bölgesini soymak için her iki forseps kullanın ve beyne bağlı kalan tüm aksesuar dokuları çıkarın. Temizlenmiş beyni üçüncü kuyucuğa yerleştirin ve 15 beyin elde edilene veya maksimum 30 dakikalık bir diseksiyon süresi geçene kadar gösterildiği gibi bir sonraki beyni inceleyin.
Beyinleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 500 mikrolitre fiksasyon solüsyonu ile sabitleyin ve gösterildiği gibi beyinleri PBS artı triton ile beş kez yıkayın. Yetişkin beyinleri artık birincil antikor inkübasyonu için hazırdır. Beyinleri daldırmak için son yıkamayı iki damla floresan güvenli montaj ortamı ile değiştirin ve yeni bir cam mikroskop slaytının ortasına tek bir damla montaj ortamı ekleyin.
Slayta aktarmak için her larva beynini ventral sinir kordonundan kavramak için forseps kullanın. Dış proliferasyon merkezinin merkezi bölgesinden, Lamina veya lobüla tıkacından progenitörleri ve nöronları görselleştirmek için, ventral sinir kordonunun lobların üzerinden çıkıntı yaptığından emin olun, larva beyinlerini dokunun ön tarafı yukarı bakacak şekilde slaytın üzerine yerleştirin. Dış veya iç proliferasyon merkezlerinin uçlarına ait hücreleri görselleştirmek için, ventral sinir kordonunun lobların altından dışarı çıktığından emin olun.
Larva beyinlerini, dokunun arka tarafı yukarı bakacak şekilde slaydın üzerine yerleştirin. Hem dorsal ventral hem de medial lateral eksendeki iç ve dış proliferasyon merkezlerinden nöronların hilalini görselleştirmek için, loblar arasındaki bölünme noktasından başlayarak beyin loblarını ventral sinir kordonu boyunca ayırmak için bir çift keskin forseps veya bir tungsten iğnesi kullanın. Her lobu yan tarafı yukarı bakacak şekilde yeniden yönlendirin.
Larva beyinleri uygun şekilde yönlendirildiğinde, beynin her iki tarafına küçük bir damla montaj ortamı yerleştirin. Her damlanın üzerine bir kapak fişi yerleştirin ve sağ ve sol kenarlar diğer iki kapak fişinin üzerine dayanacak ve bir kapak kayma köprüsü oluşturacak şekilde beyinlerin üzerine son bir kapak fişi yerleştirin. Ardından, monte edilmiş beyinleri sabitlemek için kapak kayma köprüsünün kenarlarını kapatmak için oje kullanın.
Son ikincil antikor yıkamasından sonra, 400 mikrolitre PBS ile son bir yıkama yapın. Beyni daldırmak için PBS'yi üç damla floresan güvenli montaj ortamıyla değiştirin. Bir cam mikroskop slaytının sol ve sağ üçte birlik kısmına bir damla montaj ortamı ekleyin.
Bir kapak kayma köprüsü oluşturmak için her damlanın üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Sağ kapak fişinin dış kenarlarını oje ile kapatın ve kapak fişleri arasına tek bir damla montaj ortamı ekleyin. Forseps kullanarak, optik loblara zarar vermemek için beyinleri ekstra dikkatli bir şekilde slayta nazikçe aktarın.
Lamina ve medulla nöronlarının hücre gövdelerini görselleştirmek için, anten lobları dışa doğru çıkıntı yapacak şekilde beyinleri ön pozisyonda yönlendirmek için bir tungsten iğnesi kullanın. Lobula kompleksinin nöronlarını görselleştirmek için, beyinleri, anten lobları kayma pozisyonuna karşı aşağı bakacak şekilde bir posterior olarak yönlendirin. Tüm optik lob nöropillerini tek bir düzlemde görselleştirmek için, beyinleri yatay bir pozisyonda yönlendirin, beyinleri bir ön montajda hizalayın, ardından her bir beyni 90 derece yukarı doğru döndürmek için bir tungsten iğnesi kullanın, böylece ventral tarafına oturur, kapak kaymasının kenarına dayanır.
Yetişkin beyinleri uygun şekilde yönlendirildiğinde, sağ ve sol kenarlar diğer iki örtü fişi ile çakışacak ve bir köprü oluşturacak şekilde beyinlerin üzerine son bir örtü fişi yerleştirin, slaytı oje ile kapatın. İşte anterior montaj oryantasyonunda bir larva optik lobunun görüntüsü. Anterior montaj oryantasyonunda, merkezi yüksek proliferasyon merkezinin epiteli, medulla nöroblast ve lamina nöronları yüzeyde beynin etrafını saran hücre bantları olarak görünür.
Beynin daha derinlerinde, Z yığınının ortasında, ana dış proliferasyon merkezi epiteli ve ilgili nöroblast ve nöronları görülebilir. Ek olarak, iç proliferasyon merkezinin epiteli ve lobüla tıkacının nöronları bu ara dilimlerde görülebilir. En derin Z dilimleri, dış proliferasyon merkezinin arka uçlarının bulunduğu beynin diğer tarafını tasvir eder.
İç proliferasyon merkezinin yüzeysel ucu da mevcuttur. Optik lob arkaya monte edilirse bunların görülebilen ilk yapılar olacağını unutmayın. İşte yan tarafına monte edilmiş bir optik lobdan bir görüntü.
Yanal montajın yüzeyinde lamina hilal görülebilir ve lobüla tıkacı hilali kolları arasında bulunur. Medulla nöronal hilal biraz daha derin bir Z pozisyonunda görünür. İşte anterior oryantasyonda monte edilmiş yetişkin bir optik lobun görüntüsü.
Medulla, ön montajın yüzeyinde bulunduğundan, medulla korteksi hemen görülebilir. Korteksteki hücre gövdeleri, ağaççıklarını bir ara Z pozisyonunda görselleştirilebilen nöropil'e yansıtır. Lobula da bu seviyede, medullaya dik olarak yönlendirilmiş olarak görünür.
En derin Z pozisyonunda, optik lobun son nöropili, lobüla plakası görülebilir. Lobula plakasının, bir arka montajda görünen ilk yapı olacağına dikkat edin. İşte yatay yönde monte edilmiş bir yetişkin optik lobun görüntüsü.
Beyin yan yatarak 90 derece çevrildiğinde yatay bir pozisyona getirildiğinde, optik lobun tüm nöropilleri ve korteksleri tek bir düzlemde görülebilir. Bu protokolü gerçekleştirirken hatırlanması gereken en önemli şey, protokol boyunca beyin dokusunu çözelti içinde tutmaktır. Beyinler havaya maruz kalırsa, lekenin kalitesi ve dolayısıyla son görüntüler önemli ölçüde azalacaktır.
Montaj oryantasyonunun optik lob görselleştirmesini nasıl etkilediğinin anlaşılması, canlı görüntüleme için önemlidir. Larva ve yetişkin beyinleri, hücre bölünmelerini veya kendi morfolojinizdeki değişiklikleri takip etmek için birkaç gün boyunca kültürlenebilir ve görüntülenebilir. Burada, floresan sinyalin in vivo olarak en iyi şekilde algılanması için ilgilenilen hücre tiplerinin kapak kızağına yakın olması gerektiğinden, montaj yönü kritik öneme sahiptir.
