Bu çalışma tamamen veya kısmen Kanada Konsorsiyumu ateş ve yaşlanma (CCNA), Kanada Enstitüsü, Sağlık Araştırma (CIHR), Kanada (ALS Kanada) ALS Derneği ve Alzheimer Derneği Kanada (ASC) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Sultan Darvesh ve Andrew Reid bankadan deniz beyin dokusu FTLD beyin dokuları sağlamak için Milan Ganguly Spatio-Temporal hedefleme ve radyasyon amplifikasyon yanıt (STTARR) programı ve onun bağlı teşekkür etmek istiyorum Ajanslar gömme ve Hizmetleri ve gelişmiş optik mikroskobu tesisi (mikroskopi aletleri sağlamak için AOMF) kesit doku için finansman. Kevin Hadley el yazması kritik inceleme için teşekkür etti.

Not: Uluslararası Konferansı üzerinde uyumlaştırılması (Ich), Konsey için uluslararası kuruluşlar, tıbbi Bilimler (CIOMS) de dahil olmak üzere tanınan uluslararası standartlara uygun olarak sunulan çalışma gerçekleştirildi ve Helsinki Bildirgesi ilkeleri. İnsan dokusu kullanımı üniversite sağlık ağ araştırma Etik Kurulu onayı ile oldu. İnsan beyni örnekleri deniz beyin doku Bankası bir parçası olarak toplanmıştır. Toplanması sırasında tüm hasta Onam alındı.
 1. photobleaching cihazları ve çözümleri inşaat <ol><li>hazırla hisse senedi çözümleri.
	<ol><li>Hazırlamak 1 L / 1 x 8,77 g NaCl ve 6,06 g Tris eriterek tarafından hisse senedi Tris tamponlu tuz (1 x TBS) çözüm (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) temel GKD 2 O 800 mL ve pH HCl. Bring sesi 1 L ve basınçlı kap kullanarak 7.4 için ayarlamak. < / li > <li>% 10 (200 x hisse senedi) sodyum azid sodyum azid 10 ml GKD 2 O (%10, 200 x hisse senedi) 1 g çözülerek hazırlayın.</li>
	</ol></li> <li>1-3 standart ölçü slaytlarını tek 100 mm x 100 mm şeffaf, kare petri kabına bir slayt odası kullanın. Bir tek slayt odası için 200 x sodyum azid stokunun 0.25 mL % 0.05 azid TBS çözüm yapmak için 1 x TBS için 50 mL ekleyin. Dikey olarak ek slaytları işlemek için 2-3 slayt chambers yığını. Her oda için bir ek 50 mL azid TBS çözeltisi hazırlamak.</li>
	<li>Böyle bir lamba başlığında altında sığabilecek slayt chamber(s) yükseltmek için bir iskele oluşturmak.
	<ol><li>İçin bir 100 mm x 100 mm slayt odası, alt ve bir 100 x 100 mm x 30 mm plastik gıda konteyner kenarlarında açıklıklar kesmek ve konteyner tersine çevirin. Yan açıklıklar ve alt açıklıklı öyle ki ışık ışık kaynağından örnek odası engel olmadan ulaşır kadar büyük olduğundan emin olun bir LED ışık kaynağı uygun büyüklükte olduğundan emin olun.</li>
		<li>İskele artış kavrama iskele ve örnek odası/benchtop arasında Elektrik bandı uygulamak. Güvenli bir şekilde slayt odası ışık örnek ulaşmasını engelleyen olmadan yükseltir sürece iskele oluşturmak için alternatif herhangi bir malzeme kullanın.</li>
	</ol></li> <li>Tüm Difüzörler ve opak plastik doğrudan örnek (mümkünse) ulaşmasını LED ışık engel ve LED dizi yukarı doğru yönlendirmek masa lambası kaldırın. LED dizi yukarıda iskele ve slayt chamber(s) yerleştirin. Bir lamba ile esnek bir boyun için kolayca idare kullanın.</li>
	<li>Yapı yansıtıcı bir kubbe cihazları için slayt odası ve İskele alüminyum folyo ile karşılamak için büyük bir kutu içine astar tarafından kapsar. Kullanma a 1 mL pipet ucu kutu için tek bir oda ya da bir 150 x 150 mm x 150 mm karton kutu birden çok, dikey olarak üst üste Chambers'ı.</li>
</ol> 2. Photobleaching ön arıtma doku bölümlerinin Not: doku bölümü hazırlık doku ve fiksasyon ve kullanılan yöntemler katıştırma kaynağına bağlı olarak farklı olabilir. Burada, beyin dokusundan FTLD-T Olgusu (orbitofrontal gyri) ~ 2 gün içinde formalin, sukroz degrade çalıştırmak, Ekim gömülü ve bir cryostat kullanarak 10 µm kalınlığında bölümlerine kesmek için tespit edildi.
<ol><li>Bir 4 ºC soğuk oda, soğuk dolap veya buzdolabı, iskele altında lamba yönlendirmek ve örnek odası iskele üzerinde yerleştirin. 50 mL azid TBS çözeltisi örnek odanın içine dökün.</li>
	<li>Submerge doku bölümler standart cam mikroskop slaytlar azid TBS temiz forseps kullanarak içeren slayt odasına monte. Birden çok slayt için slaytları tek bir katmanda odasında yerleştirilir emin olmak.</li>
	<li>Aparatı ile yansıtıcı kubbe kapak, LED Lamba açmak ve 4 ºC, 48 h için kuluçkaya.</li>
</ol> 3. Ayirt fosforile tau DAPI counterstain ve Alexa 488 - ve ikincil antikorlar Texas kırmızı Birleşik kullanarak doku leke, ilk çözümleri antijen alma, permeabilization, engelleme ve ilköğretim için hazırlamak için <ol><li> antikor bağlama.
	<ol><li>Hazırlamak 500 mL antijen alma arabellek (10 mM sitrik asit, 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit, % 0.05 arası 20; pH 6.2) 0,92 g sitrik asit ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 500 mL GKD 2 O. ayarlama pH 0.37 g eriterek tarafından 6.2 NaOH ile için ve ara 20 0.25 mL ekleyin.</li>
		<li>500 mL % 0,025 hazırlamak Triton X-100 Triton X-100 0,125 mL 500 mL 1 ekleyerek TBS çözüm (TBS-Triton) TBS. x</li>
		<li>Hazırlık %1 sığır serum albumin (BSA) çözeltilerine 0.1 g 10 ml TBS. BSA eriterek tarafından TBS (BSA-TBS arabellek)</li>
		<li>Engelleyen bir çözüm için 1,8 mL %1 0.2 mL normal keçi serum ekleyerek hazırlamak BSA/TBS.</li>
		<li>Her slayt için birincil antikor çözümü (1: 100 seyreltme) 150 µL tarafından anti-fosfo-PHF-tau pSer202 + Thr205 pipetting 1,5 µL hazırlamak (AT8) antikor 148,5 µL BSA-TBS tampon ve buz üzerinde bırakın % 1 içine</li>
	</ol></li> <li>Antijen alma gerçekleştirmek için dikey olarak antijen alma arabelleği 25 mL içeren bir slayt toplayıcı photobleached slaytları daldırın. Öyle ki toplayıcı su banyosu düşmek değil toplayıcısı teyp ve/veya dizeleri ile güvenli. Toplayıcı için 30 dk 90 ºC, bir su banyosu içinde ısı ve toplayıcı slaytları kaldırmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika soğuması izin. Yapmak değil Kaldır slaytlar hemen olarak bölümler kurumasına neden olur.</li>
	<li>Slaytları TBS-Triton 30 mL ile dolu bir boyama kavanoza antijen alma toplayıcı aktarım ve nazik sallayarak ile bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 5 min için bölümler yıkayın. Yıkama taze TBS-Triton ile bir kez yineleyin. Wick bir hav bırakmayan dokusu ve anahat hidrofobik kalem ile doku ile dış görev aşırı arabellek. Slaytlar kurumasına izin vermemeye özen.
	<ol><li>Her slayt için doku doku üzerine çözüm engelleme pipetting 200 µL tarafından blok ve slayt oksijen bir odaya koyun. Odası ıslak kağıt havlu içeren bir pipet ucu kutusunun içinde bir slayt raf yerleştirerek oluşturmak. Bir yüzeyin 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. Engelleme çözüm tam olarak doku kapsar olun.</li>
	</ol></li> <li>Aspirasyon tarafından engelleme çözümü kaldırmak ve 100-150 µL birincil antikor çözüm doku üzerine pipette. Yeterli miktarda antikor mevcuttur ve bölüm antikor çözüm bir yana havuzu oluşturma önlemek için bir yüzeyin üzerinde olduğundan emin olun. Oksijen odasında gecede 4 ºC, kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil antikor karışımı ve DAPI nükleer counterstain hazırlayın.
	<ol><li>Her slayt için karışımı keçi Anti-fare Alexa 488 1,5 µL ve keçi Anti-fare BSA-TBS 147 µL Texas kırmızı 1,5 µL ekleyerek ikincil antikor (1: 100 dilutions) 150 µL hazırlamak ve buz üzerinde bırakın</li>
		<li>Hazırlama 0,1 µg/mL DAPI seri seyreltme tarafından counterstain. Hisse senedi çözüm iyice karıştırın ve 1 µL olarak hisse senedi 5 mg/mL 5 µg/mL solüsyon 1 mL yapmak TBS 999 DAPI oranında seyreltin. Her slayt için seyreltik 3 µ5 µg/mL solüsyon L ile TBS 147 µL son konsantrasyonu olarak 0.1 µg/mL. 
		Dikkat: DAPI bilinen bir alkil olduğunu ve dikkatle ele alınmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>Aspirasyon tarafından birincil antikor kaldırın. TBS-Triton ve nazik bir orbital Çalkalayıcı karıştırma ile 5 min için yıkama 30 mL içeren kavanoz boyama bir cam slayt daldırın. Taze TBS-Triton ile yıkama adımı yineleyin. Dış görev aşırı TBS-Triton fitil ve 100-150 µL her slayt için ikincil antikor karışımı pipet.
	<ol><li>Emin olun doku tarafından antikor karışım tamamen kaplıdır. Karanlıkta oksijen odasında oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Ve slayt içeren TBS (Triton) 30 mL kavanoz boyama cam içine transfer aspirasyon tarafından ikincil antikor karışımı çıkarın. Nazik bir orbital Çalkalayıcı karıştırma ile 5 dakika yıkayın. Taze TBS. yıkama adımla 0.1 µg/mL DAPI counterstain 100-150 µL her slayta uygulamak ve karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya Yinele.</li>
	<li>Slaytları bir cam kavanoz TBS içeren boyama transfer ve 3 kez nazik 5 min her, taze TBS her yıkama için kullanarak için karıştırma ile yıkayın. Fitil uzakta aşırı arabellek.</li>
	<li>Sulu montaj orta doku olarak uygulamak 3 damla. Forseps kullanarak, bir temiz cam coverslip bir kenar ile başlayan ve yavaş yavaş diğer kenarına hava kabarcıkları yakalama önlemek için düşürücü dokusu üzerine yavaşça indirin. Coverslip hemen Imaging Eğer çıkarmak değil için dikkat ediniz. Aksi takdirde, karanlıkta 4 ºC, saklamadan önce kuru montaj orta izin.</li>
</ol> 4. Floresans mikroskobu <ol><li>dönüş floresan lamba, mikroskop hem de bilgisayarda ve 15 dk. lekeli doku slaytlar floresan mikroskop aşamasında yer için ısıtmak lamba sağlar. 10 x büyütme oranında dokuyu bulmak için parlak alan görüntü kullanın.</li>
	<li>Bir damla GKD 2 O coverslip yüzeye uygulamak ve bir 20 x su daldırma objektif lens kullanmak (NA = 1,0). 4-line ortalama uçak tarama ayarı seçin. İğne deliği boyutu ~ 3 mikron optik bir dilim veren 1 havadar birimini ayarlayın. Lazer uyarma ve emisyon dalga boylarında her fluorophore için en iyi sinyal için ayrı parça seçin. 
	Not: Alexa 488: λ ex 488 nm (argon lazer) λ em = 493-570 nm; = λ Texas kırmızı: ex 561 = nm (DPSS 561 nm lazer), λ em 601-635 nm; = λ DAPI: ex = 405 nm (diyot 405 lazer), λ em 410-507 nm =.
	<ol><li>Lazer güç ayarlamak ve sinyal şiddeti her parça için en iyi duruma getirmek için ayarları kazanç. Bileşik görüntü toplayabilir ve kaydedebilirsiniz. Floresans yoğunluklarda farklı bir slayt içinde karşılaştırmak için aynı lazer ayarları kullanın.</li>
	</ol></li> <li>Floresan yoğunluğu her kanaldaki görselleştirme için RGB profil araçları makro ImageJ 10 için yükleyin. Makroyu Microsoft Web sitesinden (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt) metin dosyası olarak kaydedin. ImageJ menüde Eklentiler - &#62; makrolar - &#62; yüklemek; RGB profillerini aracını yüklemek için metin dosyasını seçin.
	<ol><li>İçinde ImageJ confocal görüntü dosyasını açın ve bileşik görüntüler 3 yığınları RGB'ye aşağıdakileri gerçekleştirerek dönüştürmek: görüntü - &#62; renk - &#62; kanal aracı. Seçin &#34; kompozit &#34; açılır menü ve onay tüm üç kanal. Sonra görüntü - seçin &#62; türü - &#62; RGB renk.</li>
		<li>RGB profil Araçları simgesini seçin ve profiled için görüntünün bölümünde arasında bir çizgi çizin. Komplo için bir elektronik tablo olarak yoğunluğu verileri kaydetmek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+.">Lipofuscin .</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).</li><li>Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+fixation,+exciting+light+and+section+thickness+on+the+primary+fluorescence+of+samples+for+microfluorometric+analysis.">Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis.</a> Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).</li><li>Ottis, P., Koppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+rat+brain+lipofuscin+proteome.">Human and rat brain lipofuscin proteome.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).</li><li>Sun, Y., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+elimination+of+lipofuscin+fluorescence+from+formalin-fixed+brain+tissue+by+white+phosphor+light+emitting+diode+array.">Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array.</a> Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).</li><li>Davis, A. S., Richter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+and+its+applications+in+live+cell+microscopy.">Spectral imaging and its applications in live cell microscopy.</a> FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).</li><li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispectral+LED+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue.">A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li><li>Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diode+flashlights+as+effective+and+inexpensive+light+sources+for+fluorescence+microscopy.">Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).</li><li>Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+neuropathology+of+frontotemporal+dementia:+insights+into+disease+mechanisms+from+postmortem+studies.">Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies.</a> J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).</li><li>Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticobasal+degeneration:+a+pathologically+distinct+4R+tauopathy.">Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy.</a> Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu el yazması açıklanan dokuların photobleaching ön arıtma kapalı bileşenleri kullanarak autofluorescence etkili eleme için sağlar. Protokol ayirt görüntüleme fosforile tau toplamları insan beyninin formalin sabit doku ikincil antikorlar Alexa 488 ve Texas kırmızı, DAPI bir nükleer counterstain olarak Birleşik kullanarak açıklar. Diğer dokulara yöntemi uygulamak için bir başlangıç noktası olarak örnek bir 48 h photobleaching ön arıtma yapmak tavsiye. Photobleaching sonra için iletişim kur...

Floresans mikroskobu antikorlar spesifik proteinlerin hedefleme kullanarak düzenli olarak proteinler hücre kültürü ve dokuların ilgi görselleştirmek için kullanılır. Ayirt açık ve kesin Albümdeki edinimi için büyük bir komplikasyon endogenously memeli dokusunda yaş pigment lipofuscin ve elastin ve kolajen1gibi proteinler tarafından neden olabilir autofluorescence olduğunu, 2. Autofluorescence ile ilgili diğer kaynakları aldehid fiksasyon3gibi örnek hazırlama adımlarda tanıttı olabilir. Lipofuscin granül, öncelikle oxidatively değiştirilmiş protein ve lipit bozulması artıkları, oluşan uzun-canlı hücreler artan yaş2birikir. Olarak lipofuscin floresan emisyon yelpazesi geniş ve değişken, genellikle ortak fluorophores için kullanılan emisyon dalgaboyu ile rastlayan bu beyin ve kalp veya iskelet kasları gibi postmitotic doku Imaging'de zorluğa neden oluyor 4etiketleme. Bu faktörler insan beyin dokusundan özellikle zor durumlarda da lobar dejenerasyonu (FTLD) gibi geç başlangıçlı nörodejeneratif hastalıkların görüntüleme olun.
Autofluorescence azaltmak için içinde biz beyaz bir ışık yayan diyot (LED) dizi bir ev Resepsiyon lamba5kullanarak slayt monte doku bölümleri ışınlatayım bir teknik geliştirmiştir. Bu basit tekniği kullanmak CuSO4 gibi kimyasal quenchers amonyum asetat, veya piyasada bulunan boyalar Sudan Siyah B ve Eriochrome siyah T6gibi Şoklama teknikleri bir alternatif sağlar. Önemli maliyet tasarrufu bitti spektral have LED Lamba photobleaching teknikleri ve komplikasyonlar ve spektral un karıştırma7,8gibi dijital autofluorescence kaldırma yöntemleri üretilen eserlerin önler. Beyaz fosfor photobleaching kromofor5,9çeşitli için kapalı bir bileşeni olarak idealdir geniş emisyon spektrumlu, yüksek parlaklık ve düşük üretim maliyeti, LED var.
Bu iletişim kuralı, biz erişilebilir bileşenler kullanarak bir photobleaching aparatı inşaatı göstermek ve photobleaching FTLD dokusu fosforile tau ilişkin bir antikor özel kullanarak tau-pozitif kapanımlar (FTLD-T) içeren olgusu uygulanır. Biz iki yaygın olarak kullanılan kromofor istihdam fluorescently etiketli antikorlar Imaging üzerindeki etkisi photobleaching göstermek: Alexa 488 ve Texas kırmızı. Photobleaching tedavi edilmeyen bölümleri karşı etkisini veya ticari bir kimyasal içki ile tedavi sayılabilir ve karşılaştırıldığında. Bu photobleaching ön arıtma autofluorescence bir biyolojik örnek kaldırmak için herhangi bir standart ayirt boyama Protokolü içine dahil edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Choloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>1506656</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>BioShop Canada</td><td>SAZ001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish</td><td>Sarstedt</td><td>82.9923.422</td><td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td></tr><tr><td>6 W LED Dimmable Desk Lamp</td><td>DBPower</td><td>DS501</td><td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2404</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;(EDTA)</td><td>BioShop Canada</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>BioShop Canada</td><td>SHY700.1</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Haake Fisons</td><td>K15</td><td></td></tr><tr><td>Slide collector</td><td>FisherScientific</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Staining Jar</td><td>FisherScientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Bellco Glass</td><td>&amp;nbsp;7744-08115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7878</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>FisherScientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Aurion</td><td>905.002</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z672548-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X</td><td>ThermoFisher</td><td>T862</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>ThermoScientific</td><td>28-600-42</td><td></td></tr><tr><td>Glass soverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td>Software accompanies the Confocal Microscope</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>RGB Profile Tools macro</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td></tr><tr><td>Commercial chemical quencher</td><td>Biotum</td><td>23007</td><td></td></tr></tbody></table>

simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy

Ayirt hücre altı bölmeleri görselleştirmek ve doku örneği içinde belirli proteinlerin yerelleştirme belirlemek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Yüksek kaliteli ayirt görüntüler edinimi için büyük bir engel lipofuscin gibi yaşlanma pigmentler veya aldehit fiksasyonu gibi genel örnek hazırlık süreçlerini neden doku endojen autofluorescence var. Bu protokolü nasıl arka plan Floresans büyük ölçüde beyaz fosfor ışık yayan diyot (LED) diziler önce tedavi ile floresan problar kullanarak photobleaching ile giderilebilir açıklar. Beyaz fosfor geniş spektrumlu emisyon LED fluorophores emisyon doruklarına aralığında beyazlatma için izin verir. Photobleaching aparatı çok düşük maliyetle kapalı bileşenlerden oluşturulması ve piyasada bulunan kimyasal quenchers için erişilebilir bir seçenek sunar. Photobleaching ön arıtma geleneksel ayirt boyama tarafından takip doku görüntü arka plan autofluorescence ücretsiz oluşturur. Göre kurulan soruşturma yanı sıra arka plan azaltılmış kimyasal quenchers sinyalleri, photobleaching tedavi etkili arka plan ve lipofuscin floresan azaltılmış sonda floresan yoğunluğu üzerinde bir etkisi vardı. Photobleaching ön arıtma için daha fazla zaman gerektirir, ancak daha yüksek yoğunluklu LED diziler photobleaching süresini azaltmak için kullanılır. Bu basit yöntem doku, beyin gibi lipofuscin birikir özellikle postmitotic doku ve kardiyak veya iskelet kasları çeşitli için potansiyel olarak uygulanır.

Photobleaching ön arıtma adım standart ayirt protokolü hemen önce antijen alımı ve immunostaining (şekil 1A) eklenebilir. Derleme photobleaching cihazları da çeşitli, kullanarak gerçekleştirilebilir ucuz, kapalı bileşenleri (şekil 1B). Beyaz fosfor emisyon spektrum LED'ler kapsar geniş menzilli photobleaching için uygundur dalga boyu geniş bir yelpazesi ile önceki raporlar (şekil 1 c</str...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması

Arka plan autofluorescence biyolojik örneklerin kez Floresans tabanlı görüntüleme teknikleri, özellikle yaşlı insan postmitotic doku zorlaştırmaktadır. Bu protokolü nasıl autofluorescence bu örnekler üzerinden etkin bir şekilde kaldırılabilir açıklar bir ticari olarak mevcut ışık yayan diyot ışık kullanarak örnek immunostaining önce photobleach için kaynak.

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

simple-elimination-background-fluorescence-formalin-fixed-human-brain

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.1K Görüntüleme.  University of Toronto. Arka plan autofluorescence biyolojik örneklerin kez Floresans tabanlı görüntüleme teknikleri, özellikle yaşlı insan postmitotic doku zorlaştırmaktadır. Bu protokolü nasıl autofluorescence bu örnekler üzerinden etkin bir şekilde kaldırılabilir açıklar bir ticari olarak mevcut ışık yayan diyot ışık kullanarak örnek immunostaining önce photobleach için kaynak.

Video: Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Nörobilim

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

SHORT ve LSFM ile İnsan Beyninin Yüksek Çözünürlüklü 3D Rekonstrüksiyonu

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its dimensions and complexity, which make imaging with micrometer resolution particularly difficult. This paper presents a protocol to perform the reconstruction of volumetric portions of the human brain by simultaneously processing tens of sections with the SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) tissue transformation protocol, which enables clearing, labeling, and sequential imaging of the samples with light-sheet fluorescence microscopy (LSFM). SHORT provides rapid tissue clearing and homogeneous multi-labeling of thick slices with several neuronal markers, enabling the identification of different neuronal subpopulations in both white and grey matter. After clearing, the slices are imaged via LSFM with micrometer resolution and in multiple channels simultaneously for a rapid 3D reconstruction. By combining SHORT with LSFM analysis within a routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain the 3D cytoarchitecture reconstruction of large volumetric areas at high resolution in a short time, thus enabling comprehensive structural characterization of the human brain.

Yazar Spotlight: 3D Sitomimari Analizini Geliştirme - İnsan Beyninin Hızlı Hacimsel Rekonstrüksiyonu 

The present protocol provides a step-by-step procedure for rapid and simultaneous optical clearing, muti-round labeling, and 3D volumetric reconstruction of tens of postmortem human brain sections by combining the (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT tissue transformation technique with light-sheet fluorescence microscopy imaging in a routinely high-throughput protocol.

İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Büyük Ölçekli İnsan Beyni Görüntülemede Işık Tabakası Floresan Mikroskobu için Optik Temizleme ve Etiketleme

Büyük Ölçekli İnsan Beyni Görüntülemede Işık Tabakası Floresan Mikroskobu için Optik Temizleme ve Etiketleme

Büyük Ölçekli İnsan Beyni Görüntülemede Işık Tabakası Floresan Mikroskobu için Optik Temizleme ve Etiketleme