Yazarlar Dr Samuel H. Wilson, ulusal çevre sağlık Bilimler Enstitüsü Bu çalışmada kullanılan hücre hatları için teşekkür etmek istiyorum.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada tanımlanan koşullara kullanarak, bir UV-A veya üretici tarafından entegre veya son kullanıcı tarafından eklenen 405 nm lazer, confocal herhangi bir mikroskopla DNA hasar bir hücre çekirdeği içinde ikna etmek ve DNA onarım proteinler sitesine alımı izin verebilirsiniz izlenecek DNA hasarı indüklenen. Ancak, belirtilen iletişim kuralı ve temsilcisi sonuçları, dalga boyu seçimi, güç, uygulanan ve hasar karakterizasyonu, ilk kullanıcı tarafından belirli bir DNA çalışması için ele alınması gereken sorunlar yolu tamir tüm önemli. Ayrıca, aynı zamanda kullanıcıların dikkate alınmalıdır deneysel tasarım ile ilgili diğer konular bulunmaktadır.
Protein davranış canlı hücreleri sonrası izlemek için mikro-ışınlama, fluorescently etiketli bir protein oluşturulması gerekir. Geniş bir hayalice ayrılmış floresan proteinlerin kullanılabilirliğini hücresel yanıt DNA hasarı indüksiyon için karakterize için kullanılabilir protein füzyon oluşturmak için araçlar sunar. Stabil transfected hücreleri sunarken daha ifade seviyeleri üzerine kontrol ve diğer biyokimyasal izin ilgi floresan proteinlerin geçici transfection zararlı koşullar, mutasyonlar veya hatta inhibitörleri, hızlı tarama için sağlar karakterizasyonu gerçekleştirilecek, mikro-ışınlama sonuçları doğrulanıyor. Hayalice farklı floresan proteinler de aynı hücrede protein aynı yolu içinde veya farklı yolları arasındaki etkileşimleri izlemek için yararlı olabilir. Floresan proteinler de ilgi her protein için özel antikorlar ihtiyacını ortadan kaldırmak ve canlı hücre hasarı indüksiyon sonra uzun süreler için protein davranışını izleme sağlar.
Ancak, floresan proteinler kullanımı da sakıncaları vardır. Genetik arka plan eksik faiz protein(s) içinde endojen proteinler fluorescently tagged proteinler ile yarışacak. Konjugasyon floresan etiketinin protein N ve C terminus için protein katlanması değiştirme, anahtar protein-protein etkileşimleri engel veya translocation sinyalleri engellemek; işlevini değiştirme ve potansiyel olarak işe alım dynamics etkileyen. Bu etkiler nerede immünfloresan boyama önemli ölçüde farklı işe alma ve saklama defa endojen proteinleri hasar site28için gösterilen raporlar bir dizi gösterilmiştir. Geçici transfection veya istikrarlı klonlar da gözlenen, genellikle protein ifade düzeyleri değişimler aracılığıyla yanıt değiştirebilirsiniz. Ayrıca, birden çok floresan proteinler arasında tek bir deneme kullanımı da işe alım, dinamikleri protein düzeyleri de equilibrated değil mi yoksa daha büyük fluorescently öğesini protein alımı diğer protein alımı engeller değişebilir . Son olarak, floresan proteinler Reaktif oksijen türleri oluşumu artan ve potansiyel olarak DNA hasarı karışımları indüklenen46,47değiştiren zayıf Sensitizasyonu aracıları olarak hareket edebilir. Bu sakıncaları rağmen floresan proteinler bir dizi farklı avantajlar eğitim DNA mikro-ışınlama ile onarım ve kullanıcılar burada, açıklanan zarar nitelemesi gibi uygun denetimler dahil onlar-ebilmek sağlamak yeni bir bakış açısı sunmak içine yanıt ve protein-protein etkileşimleri3zarar.
Canlı hücre görüntüleme gerekli değilse, ayirt indüklenen zarar yanıtı izlemek için kullanılabilir. Hücreleri belirli zamanlarda sabitleme tarafından hasar indüksiyon ve ile antikor protein ve lezyonlar faiz, hasar indüksiyon statik anlık görüntüleri ve işe alma ve saklama proteinler inşa edilebilir onarım için özel boyama sonrası. Antikorlar, faiz ve/veya translasyonel modifikasyonlar DNA hasarı yanıt tarafından indüklenen birden fazla protein alımı izlemek için kullanılabilir. Ayirt kullanımı floresan protein gereksinimini ortadan kaldırır ve endojen protein davranış incelenmesine izin verir. Ancak, bu yöntem çok sakıncaları vardır. Çok özel antikorlar gereklidir ve permeabilization ve engelleme yordamlar işe alım tespiti için yeterli sinyal yoğunluğu ile izin için optimize edilmiş olması gerekir. Sabitleme yordamlar anlık değildir ve bu fiziksel sınırlama bu yaklaşımın zamansal çözünürlük sınırlar. Hücre boyama sonra yeniden bulunduğu böylece hasar indüksiyon site eşleme önemli sorunlar da mevcut. Hasarlı hücreleri yüksek hassasiyetle taşındı nedenle bu çalışmada kullanılan confocal mikroskop yansıma tabanlı kayıt için yukarıda açıklandığı gibi sağlar. Sahne kayıt veya kabartma coverglass yatırım dahil zaman, yoksa taşındıktan hücreleri hasar indüksiyon ve görüntülü işe alım arasındaki doğal gecikme ile birleştiğinde sahne kayıt olmadan ayirt yapabilir bazı kullanıcılar için itici. Ancak, en doğru ve eksiksiz mikro-ışınlama deneysel tasarımlar bu tür yaklaşımlar paralel floresan proteinler, kullanımı ile sunulan protokolünde açıklandığı gibi dahil edecektir.
Burada, canlı hücre görüntüleme ve ayirt lazer mikro-ile yardımcı programı göstermek için kullanılır. İmmünfloresan boyama doğru bir şekilde oluşturulan DNA hasarı karışımı incelemek için bize izin verir ve bize daha iyi izin her lazer güç tarafından indüklenen protein alımı yorumlamak işe alım ve muhafaza edilmesine XRCC1 GFP gözlenen değişiklikler. Bu sonuçlara dayanarak, 405 nm lazer kullanımı BER ve SSBR proteinlerinin incelenmesi için sınırlı olmalıdır. Ayrıca, en iyi deneysel tasarım amacı, tam hasar karışımı karakterizasyonu için kullanılan her hücre kültürünü ve işe alım doğrulanmasını sonra güç ölçümleri yer alacağını ve saklama fluorescently gözlenen proteinler ile etiketlendi ayirt. Belli ki, ekipman, zaman ve maliyet dikkat edilmesi gereken noktalar bu en iyi deneysel tasarımlar imkansız bazı kullanıcılar için yapabilir. Ancak, bu öğelerin her birini önemini aşağıda gösterildiği ve kullanıcılar bunu göz önünde mikro-ışınlama deneylerin başlangıcında tutmalı.

Floresan mikroskopi hücresel mimarisi görselleştirmek, protein yerelleştirme incelemek ve protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri izlemek için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan mikroskopi küresel DNA ajanlar, ultraviyole (UV) ışık gibi zarar uygulamadan sonra DNA hasarı yanıt çalışmaya iyonizan radyasyon, kimyasal oksitleyici veya etmen ajanlar, ve/veya chemotherapeutics sağlanan kullanarak yeni fikir başlatma, sinyal ve DNA alımı proteinler DNA hasar1,2sitelere onarabilirsiniz. Ancak, bu genel ve zaman uyumsuz olaylar zarar, işe alım emri, dernek veya ayrılma Kinetik hakkında ayrıntılı bilgi verirseniz sınırlı hale gelir ve anahtar DNA onarım proteinler arasındaki ilişkileri aranır. Neyse ki, lazer confocal mikroskoplar tarama gelişmeler, hasar inducing lazer dalga boyu ve floresan proteinler gelişmeler son 25 yılda daha geniş kullanılabilirlik olması koşuluyla araştırmacılar gelişmiş araçlar ile bunlar incelenmesi için DNA yönleri, hedeflenen DNA hasarı indüksiyon onarın.
Işınlama lazer microbeams hücresel ve hücre altı işlevleri çalışma için içeren hücrelerin hücre ve radyasyon Biyoloji3köklü bir araçtır. DNA onarım çalışması için bu teknik uygulama ortaya Cremer ve ortak çalışanlar son derece odaklanmış UV kullanıldığında (257 nm) 0.5 µm Çin hamster Over (CHO) nokta üzerinde DNA hasar ikna etmek için lazer microbeam sistemi hücreleri4 ve indüksiyon kurulan Bu sistem5DNA photolesions. Önemli gelişmeler UV microbeam yöntemleri üzerinde zaman, bu kabulü sisteme zarar sunan kendi özel kurulum ve oluşturmak için onun yetersizlik nedeniyle sınırlı iken (DSBs)6Kişilik strand tatili. Sonraki çeşitli UV-B (290 320 nm) ve UV incelenmesi-UV photoproducts, oksidatif lezyonlar, temel (320-400 nm) dalga boyu grup sayısı tarafından ortaya tek iplikçik keser (SSBs) ve DSBs indüklenen bağlı olarak lazer dalga boyu ve güç4,7,8,9,10 ( 3gözden geçirme) uygulanır. Ama güç için gereken daha fazla, bu UV-B ve UV-A dalga boylarında ajanlar, psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) ve Höchst boya, gibi duyarlılığı ile kombinasyonları da DNA hasar dalga boyu, güç ve maruz kalma süresi üzerinde bağımlı ikna etmek için bulunmuştur Neden hasar genellikle bu ajanlar11,12,13,14,15huzurunda indirdi. Bu yöntemlerin daha geniş kabulü için ele alınması gerekiyor hala teknik engel olmamasına rağmen bu gelişmeler mikro-ışınlama, kullanımı genişletilmiş.
Cremer ve iş önemli ölçüde tam olarak hücredeki son derece lokalize bir alana önemli zarar verici enerji uygulamak için UV microbeam odaklanarak mikro-radyoterapi alan gelişmiş. Gelişmiş confocal mikroskoplar ve lazer mikrodiseksiyon sistemleri gibi sıkıca odaklanmış ışık daha geniş erişilebilir; Ancak, UV kaynakları kapsamları için kaplin ve onlar hala indüklenen renk sapmalarını ile ilgili çoğu kullanıcılar3,6,16önemli zorluklar sundu. UV boya popülerlik 1990'larda, boyunca optik odaklanan yetenekli arttı ve yakalama UV-heyecanlı Floresans daha yaygın olarak kullanılan16oldu ve lazer tarama gelişmeler kullanıcılarına son derece oluşturma yeteneği UV odaklı hücreleri6,17uyarma noktalar. Ancak, bu kadar 2000'lerin DNA kırılmalara ve sensitizers içinde olmayan indüklenen gösteren çok sayıda rapor ortaya çıktı ne zaman gerçek etkisi ile daha yüksek yoğunluklu lazerler sıkıca odaklanmış ışınlar bu birleşimi, hissettim değil UV-A aralığı6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26ve artık görünür dalga boylarında 488 nm27gibi bile. Bu gelişmeler daha yaygın ticari sistemleri bir dizi mikro-ışınlama tekniğine kabulü için izin. Bu gelişmelere paralel olarak, İki fotonlu teknikleri de DNA hasarı kesin indüksiyon izin ortaya çıktı; Bu gelişmeler burada tartışılan değil rağmen bu metodolojileri9,28,29,30tartışırken inceleme makaleler vardır.
Confocal mikroskoplar çok odaklı UV ışık ve floresan proteinlerin DNA onarım proteinlerin gerçek zamanlı izleme izin vermek için yaygın kullanılabilirlik sunma yeteneğine sahip geçerli erişilebilirlik ile mikro-ışınlama teknikleri içine geliştiğini DNA hasarı yanıt ve onarım yolları incelenmesi için güçlü araçlar. Ancak, kullanıcılar DNA hasarı nesil lazer dalga boyu ve alt nükleer bölgesine uygulanan güç son derece bağımlı olduğunu unutmayın gerekir. UV-C kullanımı (~ 260 nm) dalga boyu doğrudan DNA uyarma ve yüksek seçicilik UV photoproducts7,8indüksiyon için izin verir. UV-B ve UV-A dalga boylarında DNA hasar (temel lezyon, SSBs ve DSBs) karışımları üretmek,7uygulamalı güç ve hücresel arka plan bağımlı için kullanılmaktadır. Endojen dezenfeksiyon ve anti-oksidan düzeyleri hedef hücrelerde bu boyları tarafından üretilen DNA hasarı karışımları etkisi altına alabiliyor. Ayrıca, eksojen dezenfeksiyon (BrdU, vb) kullanımı DNA hasarı indüksiyon için gerekli enerji düşürerek yardımcı olabilir. Ancak, bu ajanların kendileri tarafından DNA hasar neden olabilir ve bunların kullanımı kullanıcı tarafından dikkat edilmesi gereken istenmeyen etkiler üretmek onlar hücre döngüsü ve Kromatin yapısı, değiştirmek. Bu nedenle, mikro-ışınlama DNA hasarı yanıt ve onarım çalışması için kullanılmadan önce dikkatli bir değerlendirme DNA onarım yolun faiz, dalga boylarında kullanıma hazır ve oluşturulan DNA hasarı karışımı gereklidir.
Burada, iki yaygın olarak kullanılan dalgaboyu, 355 lazer mikro-ile gerçekleştirilir nm ve 405 nm, bu dalga boyu ve bu hasar karışımları var tamiri inceleyerek üzerinde etkileri tarafından indüklenen DNA hasarı karışımları göstermek için sensitizers olmadanSSBs ve DSBs. kullanıcılar bu dalga boylarında kırılmalara veya temel lezyonlar tek bir tür oluşturmak değil bilmeniz gerekir. DNA onarım yolları arasında ayırımcılık için kullanıcılar gerekir dikkatli bir şekilde uygulanan güç çekirdeği belirli bir bölge üzerinde kontrol ve birden çok strand sonu işaretçileri ve DNA lezyon antikorları kullanarak indüklenen zarar karakterize. Doğru uygulanmış ve karakterize lazer mikro-ile bazı türler DNA hasar onarım temel lezyonlar ve SSBs veya DSBs, bazı özgüllük ile değerlendirmek Vikimapya, zenginleştirebilirsiniz. Bu nedenle, biz bırakmak kullanıcı tekrarlanarak lazer mikro-ile gerçekleştirmek, tarafından uygulanan lazer doz indüklenen DNA hasarı karışımları karakterize ve veri analizi gerçekleştirmek bir yöntem sağladı.

<table style="border-collapse:collapse;width:548pt" width="730">
	<colgroup>
		<col style="width:220pt" width="293" />
		<col style="width:119pt" width="158" />
		<col style="width:84pt" width="112" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">NIS Elements software</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">355 nm laser</td>
			<td class="xl23">PicoQuant VisUV</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Galvanometer photoactivation miniscanner</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Bruker</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Microscope slide photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S170C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fiber photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S150C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Digital handheld optical power and energy meter</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">PM100D</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">CHO-K1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158"></td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Minimal essential media</td>
			<td class="xl28">Hyclone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">SH3026501</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fetal bovine serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Atlanta biologicals</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S11550</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">XRCC1-GFP</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Origene</td>
			<td class="xl27">RG204952</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Jetprime</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Polyplus transfection</td>
			<td class="xl27">11407</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Geneticin</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl27">10131035</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155382</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">8 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155409</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 53BP-1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Novus</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">NB100304</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti-phospho-histone H2AX&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Millipore</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">05-636-I</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti cyclobutane pyrimidine dimer</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Cosmo Bio clone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">CAC-NM-DND-001</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 8-oxo-2&#180;-deoxyguanosine&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Trevigen</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">4354-MC-050</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 488 goat anti-mouse</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11029</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 546 goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11010</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">R37606</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Phosphate buffered saline</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">0780</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Normal goat serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">31873</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Jackson Immuno Research</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">001-000-162</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">37% Formaldehyde</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">9311</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Ethanol</td>
			<td class="xl20">Decon Labs</td>
			<td class="xl20">2716</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Methanol</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">VWR</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">BDH1135</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">HCl</td>
			<td class="xl20">Fisher</td>
			<td class="xl20">SA49</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Sodium azide</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:84pt" width="112">S2002</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Tris Hydrochloride</td>
			<td class="xl20">Amresco</td>
			<td class="xl20">O234</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Triton X-100</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">T8787</td>
			<td class="xl29"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells

Son derece koordineli DNA onarım yolları tespit etmek, tüketim ve hasarlı DNA üsleri yerine ve DNA kırılmalara tamiri koordine adlı biri yok. Moleküler Biyoloji teknikleri yapısı, enzimatik işlevleri ve Kinetik onarım proteinlerin açıklık var iken, hala nasıl onarım çekirdeği içinde koordineli olduğunu anlamak için bir gerek yoktur. Lazer mikro-ile DNA hasar inducing ve onarım protein alımı izleme için güçlü bir araç sunar. İndüksiyon DNA hasar tarafından lazer mikro-ile dalga boylarında bir dizi ortaya çıkabilir ve kullanıcıların güvenilir tek kırılmalara, temel lezyonlar ve çift doz aralığı ile kırılmalara neden olabilir. Burada, lazer mikro-ile tek ve iki ortak confocal lazer dalgaboyu 355 tarafından indüklenen çift kırılmalara tamir incelemek için kullanılır nm ve 405 nm. Belirli hasar karışımları inducing için uygulanan lazer doz daha fazla, doğru karakterizasyonu açıklanan, kullanıcılar tekrarlanarak lazer mikro-ışınlama veri toplama ve analizi gerçekleştirebilirsiniz.

İndüklenen DNA hasarı karakterizasyonu Temel lezyonlar ve kırılmalara indüksiyon seçili nükleer bölgesine uygulanan lazer doz bağımlı ve hücre modeli hücresel microenvironment7kullanılır. Floresan proteinler erimiş gibi XRCC1, 53BP1, Ku70 veya Rad51 protein onarmak için sağlamak yararlı tek ve Çift Kişilik strand bir hasar ROI yukarıdaki içinde floresan bir protein birikimi görmek için gereken en az enerji oluşturmak için sonu işaretçileri arka plan Floresans9,19,31. Bir yanıt neden koşulları bulunca, o belirli dalga boyu ve doz tarafından indüklenen zarar karışımı ayırdetmek önemlidir. Zayıflama doz ve süre sonunda kullanılan dalga boyu karmaşık hasar karışımları oluşumunu en aza indirmek kullanıcı izin verebilirsiniz. UV-A aralığı düşük lazer dozlarda ağırlıklı olarak SSBs ve temel lezyonlar, SSBR ve BER yolları10,28eğitim için uygun küçük bir miktarda üretmek için gösterilmiştir. Dozu artan daha karmaşık temel lezyonlar, oksidatif oluşturur ve UV indüklenen ve daha fazla sayıda DSBs7,10neden olmaktadır. İndüksiyon DNA hasar tek bir türün belirli DNA onarım yolları incelenmesi için arzu edilir iken, kullanıcıların temel lezyonlar veya DSBs çok daha sık olmak SSBs gibi belirli bir lezyon ile DNA lezyonlar karışımı inducing daha yüksektir. Hidrojen peroksit (H2O2) ya da metil methanesulfonate (MMS)32gibi kimyasal maddeler tarafından indüklenen DNA hasarı karışımları benzer. Kullanıcılar karışımları zarar sonuçları ortaya çıkabilir ve doz ve lezyonlar indüklenen zarar sitesinde dikkatli karakterizasyonu tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilir onların sonuçları sağlamak gerekli bildirdiğimde bilmeniz gerekir.
Mikro-ışınlama çalışmalarda XRCC1 GFP genellikle temel lezyonlar ve SSBs9,28indüksiyon bir marker kullanılır. XRCC1 SSB onarım (SSBR) önemli bir rol oynadığı bir iskele protein ve temel eksizyon (BER) onarmak ve nükleotid eksizyon tamir (NER)33,34,35 gibi diğer onarım yolları da katılmaktadır . DNA tamiri, anahtar protein poly(ADP-ribose) polimeraz 1 (PARP-1), DNA polimeraz β dahil olmak üzere, bir dizi ile etkileşim içinde önemli bir denetleyici rol oynar (Pol β) ve DNA ligaz III. Biz XRCC1-stabil CHO-K1 hücrelerde ifade SSBs ve DSBs oluşturmak için gerek duyulan lazer dozlarda belirlemek için GFP kullanılmaktadır. Biz ilk kez XRCC1 GFP gözlemlenebilir bir işe her dalga boyu (şekil 1) için ikna etmek için gerekli en düşük doz tespit. 355 nm dalga boyları için 2 s yaşamak zamanla tanımlanmış hasar ROI (şekil 1A) arka plan üzerinde tespit DNA hasarı indüksiyon gösteren ki ROI içinde artan bir floresan sinyal oluşturulan. İçin 405 nm, bir 8 fps tarama hızı gözlemlenebilir bir işe alım için yatırım Getirisi (şekil 1A) hasar oluşturmak için ihtiyaç vardı. Doz daha sonra arttı (10 s 355 nm ve 0.5 fps için 405 nm) daha yoğun oluşturmak için ROI (şekil 1A) zarar.
İşe Alım ve muhafaza edilmesine XRCC1-GFP indüklenen zarar yerinde sonra timelapse görüntüleme tarafından izlenen. Ayrılma indüklenen zarar sitesinden proteinin kez BER veya SSBR tamamlanması için bir işaret olarak kabul edilir iken bir protein DNA hasarı yerinde tutma devam DNA tamiri, gösterebilir. Ancak, lazer kaynaklı DNA hasarı sitelerden XRCC1 ayrılma onarım tamamlanması ile bağlama hiçbir açık delil oldu. Siteye zarar protein alımı üzerinde tüm çekirdek (şekil 1B) ölçülen ortalama floresan sinyal floresan sinyal bozuk ROI içinde ortalama yoğunluğu bildirerek ölçülür. Diğer normalleştirme teknikleri ilgi protein hücresel dağıtım bağlı olarak istihdam edilebilir olsa da bu tür normalleştirme adresi şiddeti dalgalanmalar nükleer sinyal içinde yardımcı olur. Burada, böylece zarar yatırım Getirisi için sinyal yeniden dağıtılması normalleştirme nükleer alanına ölçer XRCC1 nükleer kompartımanda yerelleştirilmiştir. Yatırım Getirisi ortalama floresan yoğunluğu sonra ön hasar görüntü de dahil olmak üzere ve zaman (şekil 1C) bir fonksiyonu grafiği çizilecek timelapse her resim için kaydedilir.
O zaman DNA baz lezyonlar oluşumunu incelemek için iki seçili lazer doz tarafından indüklenen zarar daha fazla karakterize. İlk olarak, CPD, UV kaynaklı bir hantal lezyon oluşumu NER türü lezyonlar (Şekil 2A) için bir işaretleyici olarak ayirt tarafından probed. Sonra oxidatively indüklenen temel lesion8 oxodG BER türü lezyonlar (Şekil 2B) için bir işaretleyici olarak probed. Her iki dalga boylarında düşük doz pozda CPD lezyonlar önemli hiçbir artış gözlendi (2 s 355 nm ve 405 için 8 fps için nm), yüksek doz ise her iki dalga boyu tedavi (10 s 355 nm ve 405 için 0.5 fps için nm) floresan içinde önemli bir artış gösterdi hasar ROI (Şekil 2A) içinde gözlenen sinyal. Bir dağılım çizim CPD Roi hasar oluşumu ve algılama dalga boylarında ve CPD lezyonlar düşük düzeyde düşük dozlarda mevcut olabilir, ama yük önemli ölçüde olmayabilir gösteren doz, her bozuk hücre gösterir heterojenite için yoğunluk demek daha yüksek bir doz uygulanana kadar algıladı. Scatterplot da hasar karışımları doğru miktar sınırlayabilir antikor saptama bu verimsizlik önerir.
Bu daha fazla işaret 8-oxodG tarafından oxidatively indüklenen DNA lezyonlar algılama içinde vurgulanır. Floresan sinyal zarar içinde hiçbir net artış yatırım Getirisi için 8-oxodG dalga boyunda veya kullanılan doz (Şekil 2B) gözlenmiştir. Bu iş için kullanılan antikor önceki yayınları9,10,36ile tutarlıdır; Ancak, bu sınırlamalar içinde 8-oxodG antikorlar37,38ile oluşumu gözlem olabilir unutulmamalıdır. Onay oxidatively indüklenen lezyonlar eksikliği aynı zamanda 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), enzim DNA10' dan sorumlu 8-oxodG kaldırılması için işe alım gibi ikinci bir işaret tarafından tavsiye edilmektedir. Biz DNA hasarı sitemize OGG1 işe alım gözlemleme; Ancak, oxidatively indüklenen DNA hasar seviyesinin düşük oluşumu tamamen kullanılabileceği belirlenmemiştir.
Son olarak, iki işaretleri, γH2AX ve 53BP-1, selecte kullanarak DSBs oluşumu muayened lazer dozlarda ayirt tarafından (şekil 3 &#38; 4). ΓH2AX yaygın bir iplikçik sonu işareti olarak kullanılır, ancak DSBs için onun özgüllüğü sayısı raporları39,40sorguladı. Ayrıca, bir iplikçik Break sinyal lokalizasyonu nedeniyle bu sinyal yayma sınırlı olabilir bu yüzden strand sonu sitesinden yayar bir fosforilasyon olaydır. Bu nedenle, γH2AX 53BP-1 ile birleştirerek DSB formasyonu içerisinde hasar yatırım Getirisi daha doğru değerlendirilmesi için sağlar.
ΓH2AX ve 53BP-1 mikro-ışınlama için dalga boyu ve doz bağımlı yanıttır. Düşük doz (2 s) uyarımı de 355 nm 5 ve 20 dk ve her iki işaretleyiciyi de bir zayıf ve değişken yanıt 10 dk sonrası radyoterapi (şekil 3A) yanıt aydınlığa çıkartıyor. Yüksek doz (10 s) 355 nm mikro-ışınlama zarar yatırım Getirisi 5, 10 ve 40 dk (şekil 3B) azalır 20 dk sonrası radyoterapi içinde artan bir floresan sinyal neden oluyor. Bu sonuçlar bu dikkatli 355 nm doz titrasyon gerekli çapraz-onarım yolları, uyarılması en aza indirmek için çift strand sonu işaretçisi γH2AX erken zaman noktalarda azaltılmış tespiti tarafından gösterildiği gibi gösterir (&#60; 20 dk), düşük doz uygulanan.
Yüksek doz (0.5 fps) 405 nm lazer stimülasyon (şekil 4) ve düşük (8 fps) kullanarak benzer deneyler yapıldı. Bu dalga boyu 53BP-1 ve bu doz neredeyse tek ve Çift Kişilik kırılmalara karmaşık bir karışımı oluşturmak gösteren uygulanan doz ne olursa olsun γH2AX için önemli hasar ROI içinde floresan yoğunluğu birikimi gözlenmiştir hemen sonra indüksiyon DNA hasar (şekil 4). Ayrıca, 405 nm Haritayı pan-nükleer γH2AX hasar indüksiyon (şekil 4B, alt) 10 dk içinde boyama bir artış yüksek dozda bu yatırım Getirisi hasar tespiti için rapor, 53BP-1 birikimi ise daha zorlaştırır hasar ROI içinde yer.
Bu sonuçlar açıkça 405 nm mikro-ışınlama SSBR veya BER izlenmesi için uygun değildir ve DNA'ın birden çok işaretleri adducts ve sonları strand indüklenen lezyonlar ve DNA onarım yanıt-e doğru tam olarak karakterize etmek için istihdam edilmelidir gösteriyor.
İşe Alım ve muhafaza edilmesine XRCC1 GFP doz bağımlı değişiklik Bir kez indüklenen DNA hasarı ile karakterize, lazer mikro-ile DNA onarım proteinler dinamikleri eğitim için ideal bir platform olabilir. XRCC1 GFP tutma ve ayrılma Kinetik tarafından her dalga boyu farklı hasar karışımları indüksiyon verilen beklenmedik değildir doz bağımlılık (şekil 1) gösterir. En yüksek ışınlama doz (10 s ve 0.5 fps) XRCC1-GFP daha düşük dozlarda göre daha yüksek bir yoğunluk alımı ve hasar yerinde XRCC1 GFP uzun tutma 20 dk zaman boyunca (şekil 1C) gösterir. Bu görünüm ve saklama DSB işaretleri, γH2AX ve 53BP-1 ile tutarlıdır deneme seyri sırasında çözülemeyen 355 ve 405 nm için yüksek dozda oluşturulan DNA hasarı olasılığı olduğunu gösterir (şekil 3 &#38; 4 ).
İlginçtir, daha düşük hasar dozlarda (2 s ve 8 fps) XRCC1-GFP hasar sitelere hızlı alımı ve XRCC1 GFP ayrılma öncesi ışınlama düzeyleri (şekil 1C) deneysel saat boyunca gösterir. Hasar karışımı tam karakterizasyonu, bu SSBs ve temel lezyonlar tamamen bu zararlı koşullar kullanarak çözülebilecek olan bu sonuca neden olabilir. Ancak, γH2AX ve 53BP-1 40 dk için 355 nm ve 5 min için 405 nm farklı yorumlara neden olabilir. 355 nm 2 s doz için 40 dk DSB işaretleri görünümünü Düzeltilmemiş bazı lezyonlar DSBs için lider veya bu enerji tarafından oluşturulan DSBs daha uzun bir zaman ölçeği üzerinde onarılır gösteriyor olabilir bu yüzden hasar karışımı SSBs, ağırlıklı olarak olabilir. Zaman ölçeği farklılıklar arasında SSBR ve DSB onarım daha önce raporlanmış28,41,42olmuştur. Benzer şekilde, 405 nm düşük doz (8 fps) ayrılma SSBs düşük düzeyde gösterebilir veya bir hızla DSBs için dönüştürülür SSBs, hangi kaydetti için yüksek kümeleme ajanlar zararlı mikro-ışınlama ve diğer DNA hasar daha önce43, 44 , 45.
Birlikte bu sonuçlar indüklenen zarar karışımları karakterize önemini vurgulamak ve kullanan birden çok DNA onarım proteinler ve işe alma ve saklama DNA'ın yorumlamak için işaretleri proteinler sitelerde indüklenen zarar onarım.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
Resim 1 . Lazer mikro-ile XRCC1 GFP alımı neden olmaktadır.  (A) CHO-K1 hücreleri stabil XRCC1 GFP ifade ışınlanmış ve önce ve hemen sonra hasar indüksiyon görüntüsü. Oklar, mikro-ışınlama doz konumunu gösterir ve ölçek çubuğu var. 10 µm (B) işe alım ortalama floresan yoğunluğu içinde hasar ROI belirlenmesi ve tüm çekirdeği floresan ortalama yoğunluğu normalleştirme tarafından ölçülür. (C) işe alım dinamiklerini her timelapse görüntü için ölçülebilir. Grafikler ile SEM temsil eden hata çubukları iki bağımsız deneyler temsilcisi vardır (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
Resim 2 . Lazer mikro-ile nükleotit hasar neden olmaktadır.  CHO-K1 hücreleri mikro-ışınlama lazer tabi ve hemen sonra hasar indüksiyon sabit. Ayirt CPD algılamak için gerçekleştirilmiş ve 8-oxodG adducts. (A) top, dağılım çizim yoğunluklarda gözlenen yatırım Getirisi ortalama Floresans in CPD boyama sonra hücreler zarar görmüş. Alt, CPD boyama temsilcisi görüntüler. Oklar, mikro-ışınlama konumunu gösterir ve ölçek bar 10 µm (n = 12). (B) 8-oxodG boyama için temsilcisi görüntüler. Oklarmikro-ışınlama konumunu belirtmek ve ölçek çubuğu 10 µm. mı <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
Şekil 3 . DNA Çift Kişilik strand sonu işaretçileri 355 nm mikro-ışınlama için bir doz bağımlı şekilde yanıt.  CHO-K1 hücreleri mikro-ışınlama için tabi ve zaman Puan belirtilen sonrası uyarımı de sabit. Ayirt DSB işaretleri γH2AX ve 53BP-1 için gerçekleştirildi. (A) YG demek ölçülen Floresans yoğunluklarda hasarsız ve hasarlı hücreleri için normalleştirilmiş hasar Çizim dağılım. Hata çubukları çoğu SEM temsilcisi (n = 12). (B) γH2AX ve 53BP-1 boyama için temsilcisi görüntüler. Oklar, mikro-ışınlama konumunu gösterir ve ölçek çubuğu 10 µm. mı <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
Şekil 4. DNA Çift Kişilik strand sonu işaretçileri sağlam 405 nm mikro-ışınlama için yanıt. CHO-K1 hücreleri mikro-ışınlama için tabi ve zaman Puan belirtilen yazı uyarımı de sabit. Ayirt DSB işaretleri γH2AX ve 53BP-1. (A) YG demek ölçülen Floresans yoğunluklarda hasarsız ve hasarlı hücreleri için normalleştirilmiş hasar Çizim dağılım. Hata çubukları çoğu SEM temsilcisi (n = 12). (B) γH2AX ve 53BP-1 boyama için temsilcisi görüntüler. Oklar, mikro-ışınlama konumunu gösterir ve ölçek çubuğu 10 µm. mı <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

application-laser-micro-irradiation-for-examination-single-double

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.6K Görüntüleme.  University of South Alabama Mitchell Cancer Institute. DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Video: Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Kanser Araştırmaları

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

Meme kanseri Sentinel düğüm biyopsi tek bir tekniği olarak 1% metilen mavi boya uygulaması

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% with current standard of care. Tumors often recur within 9 months following initial surgery, radiation and chemotherapy, at which point treatment options become limited. This highlights the pressing need for the development of better therapeutics to prolong survival and increase the quality of life for these patients.
Tumor Treating Fields (TTFields) therapy was developed to take advantage of the effect of low frequency alternating electrical fields on cells for cancer therapy. TTFields have been demonstrated to disrupt cells during mitosis and slow tumor growth. There is also growing evidence that they act through stimulating immune responses within exposed tumors. The advantages of TTFields therapy include its noninvasive approach and increased quality of life compared to other treatment modalities such as cytotoxic chemotherapies. The Food and Drug Administration approved TTFields therapy for the treatment of recurrent glioblastoma in 2011 and for newly diagnosed glioblastoma in 2015. We report on the effects of TTFields during mitosis, the results of electric fields modeling, and proper transducer array placement. Our protocol outlines the clinical application of TTFields on a patient post-surgery, using the second-generation device.

Glioblastoma is the most common and aggressive primary brain malignancy in adults, with most tumors recurring after initial treatment. Tumor Treating Fields (TTFields) therapy is the newest treatment modality for glioblastoma. Here, we describe the proper application of TTFields-transducer arrays on patients and discuss theory and aspects of treatment.

Glioblastoma içinde alanları terapi tedavi tümör klinik uygulama

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Application of Hemostatic Devices in Laparoscopic Hepatectomy

Laparoscopic hepatectomy is considered a conventional method for treating benign and malignant liver diseases because it is a minimally invasive method. Despite its non-invasive aspect, bleeding and bile leakage occur in liver parenchyma tissue resection during the operation or in the post-operation period, indicating the requirement for high-grade hemostatic devices, such as ultrasonic surgical aspiration, bipolar electrocoagulation, etc. The lack of availability of these high-grade hemostatic devices prevents laparoscopic hepatectomy from becoming a generalized procedure in basic medical organizations. In view of the situation mentioned above, a suite of simple and easy hemostatic devices is developed in this protocol, which includes a harmonic scalpel, monopole electrocoagulation, and a single lumen catheter, to innovatively perform liver parenchyma tissue resection. First of all, the porta hepatis or hepatic pedicle is occluded intermittently by a single lumen catheter, followed by clamping for 15 min and releasing for 5 min. Subsequently, using the harmonic scalpel, clamping and crushing of the liver are done to cut off the hepatic parenchyma tissue and to reveal the intrahepatic arteries, veins, and bile ducts. Lastly, the bleeding spots are coagulated by using monopole electrocoagulation at each spot. Intrahepatic pipeline structures are then visible by using these methods, which could stop bleeding easily, reduce the incidence rate of bile leakage, and improve the safety and feasibility of laparoscopic hepatectomy. Therefore, the simple and easy hemostatic devices shown here are suitable for conducting procedures in primary medical institutions.

High-grade hemostatic devices are essential for laparoscopic hepatectomy. However, these devices are not generalized in basic medical organizations. Therefore, a suite of simple and easy hemostatic devices is shown in this article, which can make the laparoscopic hepatectomy easier to perform.

Laparoskopik Hepatektomide Hemostatik Cihazların Uygulanması

Laparoscopic hepatectomy is considered a conventional method for treating benign and malignant liver diseases because it is a minimally invasive method. ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves different RNA-binding proteins in the nucleus. Mature miRNAs frequently mediate gene silencing, and this has become an important tool for comprehending post-transcriptional events. Besides that, it can be explored as a promising methodology for gene therapies. However, there is currently a lack of direct methods for assessing miRNA expression in mammalian cell cultures. Here, we describe an efficient and simple method that aids in determining miRNA biogenesis and maturation through confirmation of its interaction with target sequences. Also, this system allows the separation of exogenous miRNA maturation from its endogenous activity using a doxycycline-inducible promoter capable of controlling primary miRNA (pri-miRNA) transcription with high efficiency and low cost. This tool also allows modulation with RNA-binding proteins in a separate plasmid. In addition to its use with a variety of different miRNAs and their respective targets, it can be adapted to different cell lines, provided these are amenable to transfection.

We developed an intronic microRNA biogenesis reporter assay to be used in cells in vitro with four plasmids: one with intronic miRNA, one with the target, one to overexpress a regulatory protein, and one for Renilla luciferase. The miRNA was processed and could control luciferase expression by binding to the target sequence.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

Kanser Hücrelerinin İç Karotis Arter Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D tumoroids. Since patient derived tumor organoids can retain the characteristics of the original tumor, these reliable preclinical models enable cancer drug screening and the study of drug resistance mechanisms. However, CRC related death in patients is mostly associated with the presence of metastatic disease. It is therefore essential to evaluate the efficacy of anti-cancer therapies in relevant in vivo models that truly recapitulate the key molecular features of human cancer metastasis. We have established an orthotopic model based on the injection of CRC patient-derived cancer cells directly into the cecum wall of mice. These tumor cells develop primary tumors in the cecum that metastasize to the liver and lungs, which is frequently observed in patients with advanced CRC. This CRC mouse model can be used to evaluate drug responses monitored by microcomputed tomography (&#181;CT), a clinically relevant small-scale imaging method that can easily identify primary tumors or metastases in patients. Here, we describe the surgical procedure and the required methodology to implant patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice.

This protocol describes the orthotopic implantation of patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice. The model recapitulates advanced colorectal cancer metastatic disease and allows for the evaluation of new therapeutic drugs in a clinically relevant scenario of lung and liver metastases.

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...