Die Autoren möchte Dr. Samuel H. Wilson an der National Institute of Environmental Health Sciences für die Zell-Linien, die in dieser Arbeit verwendet.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mit den beschriebenen Bedingungen hier, kann jede confocal Mikroskop mit einer UV-A oder 405 nm Laser, entweder vom Hersteller integriert oder durch den Endbenutzer hinzugefügt DNA-Schäden im Zellkern einer Zelle zu induzieren und erlauben die Einstellung von DNA-Reparatur-Proteine auf der Website von induzierten DNA-Schäden kontrolliert werden. Jedoch wie erwähnt im Protokoll und repräsentative Ergebnisse, Wellenlänge Auswahl angewendet macht, und Schaden Charakterisierung sind wichtige Themen, die vom Benutzer zuerst angegangen werden müssen, um eine spezifische DNA Studie Weg zu reparieren. Darüber hinaus gibt es weitere Überlegungen in experimentellen Design, das auch von Benutzern geprüft werden muss.
Um ein Protein Verhalten in lebenden Zellen Post überwachen muss Mikro-Bestrahlung, ein Eindringmittel beschrifteten Protein erstellt werden. Die Verfügbarkeit einer breiten Palette von fluoreszierenden Proteinen, die spektral getrennt werden können bietet Werkzeuge für die Erstellung von Protein-Fusionen, die verwendet werden können, für die Charakterisierung von zellulärer Reaktionen auf die Induktion von DNA-Schäden. Transiente Transfektion von fluoreszierenden Proteinen von Interesse ermöglicht schnelle Screening von schädlichen Bedingungen, Mutationen oder sogar Inhibitoren, während stabil transfizierte Zellen bieten mehr Kontrolle über Ausdruck Niveaus und ermöglichen anderen biochemischen Charakterisierungen ausgeführt werden soll, Mikro-Bestrahlung Ergebnisse validieren. Spektral unterschiedliche fluoreszierende Proteine können auch in der gleichen Zelle Interaktionen zwischen Proteinen innerhalb der gleichen Weg oder in verschiedene Wege überwachen genutzt werden. Fluoreszierende Proteine auch die Notwendigkeit spezifischer Antikörper für jedes Protein des Interesses und live Zelle überwachen Protein Verhalten für längere Zeit nach der Induktion der Schäden.
Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen hat jedoch auch Nachteile. Ohne genetische Hintergründe einen Mangel an die Aktivit‰tderzur von Interesse werden das Eindringmittel tagged Proteine körpereigene Proteine mithalten. Konjugation des fluoreszierenden Tags an den N oder C-Terminus des Proteins kann ändern, Proteinfaltung, wichtige Protein-Protein-Wechselwirkungen zu behindern oder zu blockieren Translokation Signale; Funktion zu verändern und möglicherweise Auswirkungen auf die Rekrutierung Dynamik. Diese Effekte wurden in einer Reihe von Berichten nachgewiesen, wo immunofluorescent Färbung dramatisch anders Rekrutierung und Retentionszeiten für körpereigene Proteine Schaden Seite28unter Beweis gestellt. Verwendung von transiente Transfektion oder stabile Klone kann auch die Reaktion beobachtet, in der Regel durch Variationen in Proteingehalte Ausdruck ändern. Darüber hinaus kann die Verwendung von mehreren fluoreszierende Proteine in einem einzigen Experiment auch die Dynamik der Rekrutierung, ändern wenn Proteingehalte nicht gut equilibriert sind oder Einstellung des größeren Fluoreszent-tagged Proteins die Rekrutierung anderer Proteine blockiert . Zu guter Letzt können fluoreszierende Proteine als schwache Sensibilisierung Agenten, erhöht die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und möglicherweise verändern die DNA-Schäden Mischungen induzierte46,47fungieren. Trotz dieser Nachteile bieten fluoreszierende Proteine eine Reihe von Vorteilen im Studium DNA zu reparieren, mit Mikro-Bestrahlung, und wenn Benutzer entsprechende Steuerelemente, z. B. die Schäden Charakterisierung, die hier beschrieben wird, integrieren sie bieten neue Einblicke in Schaden Reaktion und Proteinprotein Interaktionen3.
Wenn live Cell Imaging nicht erforderlich ist, kann Immunfluoreszenz verwendet werden, um die Reaktion auf induzierte Schäden zu überwachen. Durch die Festsetzung von Zellen zu bestimmten Zeiten post Schaden Induktion und Färbung mit Antikörper spezifisch für Proteine und Läsionen, statische Momentaufnahmen der Schaden Induktion und die Rekrutierung und Bindung von Reparatur, die Proteine aufgebaut werden können. Antikörper können verwendet werden, um die Rekrutierung von mehreren Proteinen Interesse und/oder post-translationalen Modifikationen durch die DNA-Schäden-Reaktion induziert zu überwachen. Verwendung von Immunfluoreszenz eliminiert die Notwendigkeit für fluoreszierende Proteine und ermöglicht eine endogene Protein Verhalten untersucht werden. Diese Methode hat jedoch auch seine Nachteile. Hochspezifische Antikörper sind notwendig und Permeabilisierung und blockierende Verfahren müssen optimiert werden, um eine Erkennung der Rekrutierung mit ausreichender Signalstärke ermöglichen. Befestigung Verfahren werden nicht sofort ausgeführt, und diese körperliche Einschränkung schränkt die zeitliche Auflösung dieses Ansatzes. Ortsbild des Schadens Induktion zuordnen, so dass Zellen nach dem färben wieder entfernt werden können, kann auch erhebliche Herausforderungen darstellen. Confocal Mikroskop, die in dieser Arbeit verwendeten ermöglicht Image-basierte Anmeldung wie oben beschrieben, also geschädigte Zellen mit hoher Präzision verlegt werden können. Wenn Bühne Registrierung oder geätzten Deckglas nicht zur Verfügung, die Zeit ist, die Investitionen beteiligt können versetzten Zellen ohne Bühne Registrierung, gepaart mit der inhärenten Verzögerung zwischen Schaden Induktion und die abgebildeten Rekrutierung Immunfluoreszenz machen. für einige Nutzer unattraktiv. Jedoch werden die genaue und vollständige Mikro-Bestrahlung experimentellen Designs derartiger Ansätze parallel mit der Verwendung von fluoreszierenden Proteinen enthalten, wie in dem vorgestellten Protokoll beschrieben.
Hier wird live Cell Imaging und Immunfluoreszenz verwendet, um das Dienstprogramm von Mikro-Laserbestrahlung zu demonstrieren. Immunofluorescent Färbung ermöglicht es uns, die Mischung von DNA-Schäden erstellt genau zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteine induziert durch jede Laserleistung, die es uns, besser ermöglichen interpretieren die beobachteten Veränderungen in der Rekrutierung und Bindung von XRCC1-GFP. Basierend auf diesen Ergebnissen, sollte die Verwendung von 405 nm Laser zur Untersuchung von Proteinen, BER und SSBR beschränken. Darüber hinaus die optimale Versuchsplanung wären Leistungsmessungen nach dem Ziel, einen vollen Schaden Mischung Charakterisierung für jede Zelllinie verwendet und Validierung der Rekrutierung und Aufbewahrung in Gewebekulturen beobachtet getaggt Proteine mit Immunfluoreszenz. Offensichtlich, Ausrüstung, Zeit und Kostengründen diese optimalen experimentellen Designs nicht mehr können für einige Benutzer. Jedoch gezeigt, wie wichtig jedes dieser Elemente ist hier, und Benutzer sollten diese Überlegungen im Hinterkopf behalten, wenn Mikro-Bestrahlung Experimente ab.

Fluoreszenz-Mikroskopie ist entstanden, als eine leistungsfähige Technik zu visualisieren zellulären Architektur, Protein Lokalisierung zu prüfen und überwachen von Protein-Protein und Protein-DNA-Wechselwirkungen. Fluoreszenz-Mikroskopie, um DNA-Schäden Reaktionen nach der Anwendung des globalen DNA Beschädigung Mittel, wie ultraviolettes (UV) Licht zu studieren mit lieferte ionisierender Strahlung, chemische Oxidation oder alkylierende Vertreter und/oder Chemotherapeutika neue Einblicke in Initiierung, Signalisierung und Rekrutierung von DNA Reparatur Proteine zu Websites von DNA-Schäden1,2. Aber diese globale und asynchrone Ereignisse zu beschädigen sind begrenzt, wenn detaillierte Informationen über die Rekrutierung Ordnung, Kinetik der Assoziation und Dissoziation, und die Beziehungen zwischen den wichtigsten DNA-Reparatur-Proteine werden gesucht. Glücklicherweise, Fortschritte in der Laser-scanning-konfokale Mikroskope, breitere Verfügbarkeit von Schäden-induzierende Laserwellenlängen und Verbesserungen in fluoreszierende Proteine in den vergangenen 25 Jahren haben zur Verfügung gestellt Forscher mit verbesserten Tools für diese Prüfung Aspekte der DNA Reparatur, durch gezielte DNA-Schäden-Induktion.
Bestrahlung von Zellen mit Laser Microbeams um zellulärer und subzellulärer Funktionen zu studieren ist ein etabliertes Werkzeug in Zelle und Strahlung Biologie3. Anwendung dieser Technik auf die Untersuchung der DNA-Reparatur entstanden bei Cremer und Mitarbeiter ein hoch konzentriert UV (257 nm) Laser Microbeam System induzieren DNA-Schäden über eine 0,5 µm vor Ort in Chinese Hamster Eierstock (CHO) Zellen4 und etabliert die Induktion von DNA Photolesions durch dieses System5. Während bietet deutliche Verbesserungen gegenüber UV-Microbeam-Methoden zur Annahme dieser Zeit Schäden an System aufgrund seiner spezialisierten Einrichtung und seine Unfähigkeit, generieren beschränkte bricht Doppelstrang (DSB)6. Spätere Untersuchung einer Vielzahl von UV-B (290-320 nm) und UV-ein (320-400 nm) Wellenlängen durch eine Anzahl von Gruppen ergab, dass UV Photoproducts, oxidativen Läsionen, Basis Einzelstrang bricht (SSBs) und DSB können abhängig von der Wellenlänge des Lasers angeregt werden und 4,7,8,9,10 (rezensiert in 3) eingeschaltet. Darüber hinaus Kombinationen dieser UV-B und UV-A-Wellenlängen mit sensibilisierenden Agenten, wie Psoralen, Bromodeoxyuridine (BrdU) und Hoechst Farbstoffe, fand man auch induzieren DNA-Schädigung abhängig von der Wellenlänge, Kraft und Dauer der Exposition, wenn benötigt, die Macht zu induzieren Schaden ist oft in Anwesenheit dieser Agenten11,12,13,14,15verringert. Diese Neuerungen erweitert den Einsatz von Mikro-Bestrahlung, gäbe es noch technische Hürden für weitere Verbreitung dieser Methoden angegangen werden.
Cremer und Mitarbeiter deutlich erweiterten Bereich der Mikro-Bestrahlung durch die präzise Fokussierung der UV-Microbeam um signifikante schädliche Energie stark lokalisierte großflächig in der Zelle zu übernehmen. Wie konfokale Mikroskope und Lasersysteme ermöglichen erweiterte, war eng gebündelte Licht ganz allgemein zugänglich; Allerdings präsentierte Kupplung UV-Quellen zu Bereichen und den Umgang mit der chromatische Aberrationen, die sie noch induziert erhebliche Herausforderungen für die meisten Benutzer3,6,16. Wie UV Farbstoffe in der Popularität in den 1990er Jahren in der Lage, mit Schwerpunkt Optik stieg und gefangennehmende aufgeregt, UV Fluoreszenz zugänglicher16 wurdeVerbesserungen in der Laser-scanning-Benutzer angeboten konzentriert die Möglichkeit zur Erstellung sehr UV Erregung-Spots innerhalb Zellen6,17. Aber es war nicht bis in die frühen 2000er Jahre, dass die tatsächlichen Auswirkungen dieser Kombination von eng fokussierten Strahlen mit höherer Intensität Laser fühlte, wenn zahlreiche Berichte entstanden demonstrieren, dass DNA-Strangbrüchen mit und ohne Sensibilisatoren in ausgelöst werden könnte, die UV-A-Bereich6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, und sogar bei mehr sichtbare Wellenlängen wie 488 nm27. Diese Weiterentwicklungen für eine breitere Anwendung von Mikro-Bestrahlungstechnik auf eine Reihe von kommerziellen Systemen erlaubt. Parallel zu diesen Entwicklungen entstanden zwei-Photonen-Techniken auch, erlaubt präzise Induktion von DNA-Schäden; Obwohl diese Fortschritte hier nicht diskutiert werden, gibt es eine Reihe von Review-Artikel diskutieren diese Methoden9,28,29,30.
Mit der aktuellen Zugänglichkeit der konfokalen Mikroskopen in der Lage, hochspezialisierte UV-Licht und die weit verbreitete Verfügbarkeit von fluoreszierenden Proteinen ermöglicht Echtzeit-Tracking der DNA-Reparatur-Proteine liefern haben zu Mikro-Bestrahlung Techniken entwickelt. leistungsstarke Tools für die Prüfung von DNA-Schäden als Reaktion und Reparatur Wege. Benutzer müssen sich jedoch bewusst sein, dass die Generation der DNA-Schädigung hängt stark von der Wellenlänge des Lasers und die Kraft auf die Sub-atomaren Bereich angewendet wird. Einsatz von UV-C (~ 260 nm) Wellenlängen ermöglichen direkte DNA-Anregung und hohe Selektivität für die Induktion von UV Photoproducts7,8. UV-B und UV-A-Wellenlängen produzieren Mischungen von DNA-Schäden (Basis Läsion, SSBs und DSB), abhängig von der angewandten Kraft und zellulären Hintergrund verwendet7. Endogener Photosensitizer und Anti-Oxidationsmittel Ebenen in den gezielten Zellen können die DNA-Schäden-Mischungen produziert durch diese Wellenlängen beeinflussen. Darüber hinaus kann die Verwendung von exogenen Photosensibilisatoren (BrdU, etc.) unterstützen, senken den Energiebedarf für die Induktion von DNA-Schäden. Aber diese Agenten können DNA-Schäden induzieren, indem sich, und sie können den Zellzyklus und Chromatinstruktur verändern, damit ihre Verwendung unerwünschte Effekten führen kann, die vom Benutzer berücksichtigt werden müssen. Daher muss vor der Verwendung von Mikro-Bestrahlung, um DNA-Schäden als Reaktion und Reparatur zu studieren, reiflicher Überlegung des DNA-Reparatur-Signalwegs von Interesse, die Wellenlängen zur Verfügung und die DNA-Schäden-Mischung erstellt.
Hier, Mikro-Laserbestrahlung erfolgt bei beiden häufigsten verwendeten Wellenlängen, 355 nm und 405 nm, ohne Sensibilisatoren, demonstrieren die Mischungen von DNA-Schäden durch diese Wellenlängen und die Einflüsse, die diese Schäden Mischungen haben bei der Prüfung der Reparatur der induzierteSSBs und DSB Nutzer sollten sich bewusst sein, dass diese Wellenlängen nicht zu einer einzigen Art von Strangbrüchen oder base Läsionen. Um DNA Reparatur Wege zu unterscheiden, müssen Nutzer sorgfältig die angewandte Kraft die Kontrolle über eine bestimmte Region des Kerns und charakterisieren den verursachten Schaden mit mehreren Strang Pause Markierungen und DNA-Läsion Antikörper. Wenn Sie richtig angewendet und dadurch gekennzeichnet, kann Mikro-Laserbestrahlung bereichern einige Arten von DNA-Schäden, so dass Anwender beurteilen, Reparatur von base Läsionen und SSBs oder DSB, mit einigen Besonderheiten. Daher haben wir eine Methode erlaubt Benutzern, reproduzierbar durchzuführen Mikro-Laserbestrahlung, charakterisieren die DNA-Schäden-Mischungen induziert durch die angewandte Laser-Dosis und Datenanalyse zur Verfügung gestellt.

<table style="border-collapse:collapse;width:548pt" width="730">
	<colgroup>
		<col style="width:220pt" width="293" />
		<col style="width:119pt" width="158" />
		<col style="width:84pt" width="112" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">NIS Elements software</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">355 nm laser</td>
			<td class="xl23">PicoQuant VisUV</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Galvanometer photoactivation miniscanner</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Bruker</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Microscope slide photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S170C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fiber photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S150C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Digital handheld optical power and energy meter</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">PM100D</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">CHO-K1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158"></td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Minimal essential media</td>
			<td class="xl28">Hyclone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">SH3026501</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fetal bovine serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Atlanta biologicals</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S11550</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">XRCC1-GFP</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Origene</td>
			<td class="xl27">RG204952</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Jetprime</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Polyplus transfection</td>
			<td class="xl27">11407</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Geneticin</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl27">10131035</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155382</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">8 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155409</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 53BP-1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Novus</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">NB100304</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti-phospho-histone H2AX&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Millipore</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">05-636-I</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti cyclobutane pyrimidine dimer</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Cosmo Bio clone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">CAC-NM-DND-001</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 8-oxo-2&#180;-deoxyguanosine&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Trevigen</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">4354-MC-050</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 488 goat anti-mouse</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11029</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 546 goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11010</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">R37606</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Phosphate buffered saline</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">0780</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Normal goat serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">31873</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Jackson Immuno Research</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">001-000-162</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">37% Formaldehyde</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">9311</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Ethanol</td>
			<td class="xl20">Decon Labs</td>
			<td class="xl20">2716</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Methanol</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">VWR</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">BDH1135</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">HCl</td>
			<td class="xl20">Fisher</td>
			<td class="xl20">SA49</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Sodium azide</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:84pt" width="112">S2002</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Tris Hydrochloride</td>
			<td class="xl20">Amresco</td>
			<td class="xl20">O234</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Triton X-100</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">T8787</td>
			<td class="xl29"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells

Hochgradig koordinierten DNA Reparatur Wege vorhanden sein um zu erkennen, Verbrauchsteuern und ersetzen Sie beschädigte DNA-Basen und Reparatur von DNA-Strangbrüchen zu koordinieren. Während molekularbiologische Techniken Struktur, enzymatische Funktionen und Kinetik der Reparatur-Proteine geklärt haben, gibt es noch eine Notwendigkeit zu verstehen, wie die Reparatur innerhalb des Zellkerns abgestimmt ist. Mikro-Laserbestrahlung bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Induktion von DNA-Schäden und Überwachung der Rekrutierung von Reparatur-Proteine. Induktion von DNA-Schäden durch Mikro-Laserbestrahlung kann auftreten, mit einem Bereich von Wellenlängen, und Benutzer können zuverlässig induzieren Einzelstrang Pausen, Basis Läsionen und doppelte Strangbrüchen mit einer Reihe von Dosen. Hier, Mikro-Laserbestrahlung wird verwendet, um prüfen, Reparatur von Einzel- und Doppelzimmer Strangbrüche induziert durch zwei gemeinsame konfokale Laserwellenlängen, 355 nm und 405 nm. Weitere, richtige Charakterisierung der angewandten Dosis zur Induktion von konkreten Schaden Mischungen wird beschrieben, so dass Benutzer reproduzierbar Laser Mikro-Bestrahlung Datenerfassung und Analyse durchführen können.

Charakterisierung der induzierten DNA-Schäden Induktion von base Läsionen und Strangbrüche ist abhängig von der Laser-Dosis angewendet auf den ausgewählten nuklearen Bereich und der zellulären Mikroumgebung des Modells Zelle verwendet7. Fluoreszierende Proteine verschmolzen zu reparieren Proteine, wie XRCC1, 53BP1, Ku70 oder Rad51, bieten nützliche Single und double strand Pause Marker für die Festlegung des minimalen Energiebedarfs Ansammlung eines fluoreszierenden Proteins innerhalb eines Schadens ROI oben sehen die Hintergrund Fluoreszenz9,19,31. Wenn Bedingungen, die eine Reaktion auslösen gefunden werden, ist es entscheidend, die Schaden-Mischung induziert durch die spezifischen Wellenlänge und Dosis zu charakterisieren. Dämpfung der Dosis und Dauer auf die verwendete Wellenlänge können die Benutzer, die Bildung von komplexen Schäden Mischungen zu minimieren. Niedrige Laser Dosen im Bereich von UV-A wurden nachgewiesen, um überwiegend SSBs und eine kleine Menge an base Läsionen, geeignet für das Studium SSBR und BER Wege10,28zu produzieren. Erhöhung der Dosis schafft komplexere Basis Läsionen, oxidative und UV-induzierte und induziert mehr bedeutende Zahlen von DSB7,10. Während die Induktion von einer einzigen Art von DNA-Schäden für die Prüfung von bestimmten DNA-Reparatur wegen wünschenswert ist, ist es wahrscheinlicher, dass Benutzer eine Mischung aus DNA-Läsionen mit einer bestimmten Läsion wie SSBs wird viel häufiger als Basis Läsionen oder DSB induziert werden. Dies ist vergleichbar mit DNA-Schäden Mischungen induziert durch chemische Stoffe wie Wasserstoffperoxid (H2O2) oder Methyl Methanesulfonate (MMS)32. Benutzer müssen sich bewusst sein, wenn sie berichten, Ergebnisse, die Mischungen beschädigen können auftreten, und vorsichtig Charakterisierung der Dosis und die Läsionen am Standort induzierte Schäden notwendig sind, um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
In Mikro-Bestrahlung Studien dient XRCC1-GFP oft als Marker für die Induktion von base Läsionen und SSBs9,28. XRCC1 ist ein Gerüst-Protein, das eine wichtige in SSB Reparatur (SSBR Rolle) und base Excision Reparatur (BER) und beteiligt sich auch an andere Reparatur-Wege, wie Nucleotide Excision Repair (NER)33,34,35 . Es spielt eine wichtige koordinierende Rolle DNA-Reparatur, Interaktion mit einer Reihe von wichtigen Proteinen, einschließlich poly(ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP-1), DNA-Polymerase β (Pol β), und DNA-Ligase III. Wir nutzten XRCC1-GFP stabil in CHO-K1-Zellen exprimiert um festzustellen, die Laser-Dosen benötigt, um SSBs und DSB zu generieren. Wir haben zunächst die minimale Dosis erforderlich, um eine beobachtbare Rekrutierung von XRCC1-GLP für jede Wellenlänge (Abbildung 1) induzieren identifiziert. Für die 355 nm Wellenlänge erzeugt eine 2 s Verweilzeit über die definierten Schäden ROI eine erhöhte Fluoreszenzsignal innerhalb dieser ROI, unter Angabe der Induktions von DNA-Schäden, die über dem Hintergrund (Abb. 1A) nachweisbar war. Für 405 nm, ein 8 Bilder pro Sekunde-Scan-Rate war nötig, um eine beobachtbare Rekrutierung auf den Schaden ROI (Abb. 1A) zu generieren. Die Dosis wurde erhöht (10 s 355 nm und 0,5 fps für 405 nm) erstelle ich eine intensivere beschädigen ROI (Abb. 1A).
Rekrutierung und Bindung von XRCC1-GLP auf dem Gelände der verursachte Schaden wurde dann von Timelapse Bildgebung überwacht. Bindung des Proteins an der Stelle des DNA-Schäden kann laufend DNA-Reparatur, hinweisen, während Dissoziation des Proteins von der Website der induzierten Schäden oft einen Marker für die Fertigstellung des BER oder SSBR gilt. Allerdings gab es keine eindeutigen Beweise, die Verknüpfung der Dissoziation von XRCC1 von Laser-induzierten DNA-Schäden Websites mit dem Abschluss der Reparatur. Einstellung des Proteins an den Ort der Schädigung wird gemessen durch die Berichterstattung der mittlere Intensität der das Fluoreszenzsignal innerhalb der beschädigten ROI über das mittlere Fluoreszenzsignal für den gesamten Kern (Abbildung 1B) gemessen. Diese Art von Normalisierung hilft Adresse Intensitätsschwankungen im nuklearen Signal, obwohl andere Normalisierungstechniken können, abhängig von der zelluläre Verteilung des Proteins des Interesses eingesetzt werden. Hier ist XRCC1 im nuklearen Fach lokalisiert, so Normierung auf die nuklearen Bereich die Verteilung des Signals auf den Schaden ROI misst. Die ROI bedeuten fluoreszente Intensität wird dann für jedes Bild im Zeitraffer, einschließlich das Bild vor Schäden und grafisch dargestellt als Funktion der Zeit (Abbildung 1C) aufgezeichnet.
Wir zeichnen dann weiter den Schaden induziert durch die zwei ausgewählten Laser-Dosen, die Bildung von DNA-base-Läsionen zu untersuchen. Erstens war Bildung von CPD, eine sperrige UV-induzierten Läsion durch Immunfluoreszenz als Marker für NER Typ Läsionen (Abbildung 2A) sondiert. Dann wurde die oxidativ induzierte Basis lesion8-OxodG als Marker für BER Typ Läsionen (Abbildung 2B) sondiert. Keine signifikante Zunahme der CPD Läsionen wurden bei der niedrigen Dosis Exposition für beide Wellenlängen beobachtet (2 s 355 nm und 8 Bilder pro Sekunde für 405 nm), während die hohe Dosis Behandlung bei beiden Wellenlängen (10 s 355 nm und 0,5 fps für 405 nm) zeigten eine deutliche Steigerung in fluoreszierenden Signal innerhalb des Schadens ROI (Abb. 2A) beobachtet. Ein Streudiagramm der CPD ROI bedeuten Intensität für jede geschädigte Zelle zeigt Heterogenität bei Schäden Entstehung und Erkennung bei Wellenlängen und Dosen, darauf hinweist, dass ein niedriges Niveau der CPD Läsionen kann bei niedrigeren Dosen vorhanden sein, aber die Last möglicherweise nicht deutlich erkannt, bis eine höhere Dosis angewendet wird. Das Streudiagramm zeigt auch diese Ineffizienz in Antikörpernachweis, die genaue Quantifizierung der Schäden Mischungen beschränken können.
Dies wird durch die Markierung 8-OxodG bei der Erkennung von oxidativ induzierten DNA-Läsionen unterstrichen. Keine deutliche Steigerung Fluoreszenzsignal innerhalb der Schaden wurde ROI für 8-OxodG Laser-Wellenlänge oder verwendete Dosis (Abbildung 2B) beobachtet. Der Antikörper verwendet für diese Arbeit steht im Einklang mit früheren Veröffentlichungen9,10,36; Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass es Einschränkungen bei der Beobachtung der Bildung von 8-OxodG mit Antikörpern37,38geben kann. Bestätigung des Mangels an oxidativ induzierte Läsionen empfiehlt sich auch durch eine zweite Markierung, wie Rekrutierung von 8-Oxoguanine DNA-Glycosylase (OGG1), das Enzym zur Entfernung von 8-OxodG von der DNA-10. Wir beobachteten OGG1 Rekrutierung unserer DNA-Schäden Seiten; jedoch kann nicht die Bildung von geringen Mengen von oxidativ induzierten DNA-Schäden vollständig ausgeschlossen werden.
Zu guter Letzt haben wir untersucht die Bildung des DSB mit zwei Markierungen, γH2AX und 53BP-1, bei der passendesd Laser Dosen durch Immunfluoreszenz (Abbildung 3 &#38; 4). ΓH2AX wird häufig als Strang Pause Marker verwendet, aber seine Spezifität für DSB wurden in einer Reihe von Berichten39,40in Frage gestellt. Darüber hinaus ist es eine Phosphorylierung-Ereignis, das von der Strang Pause Website propagiert, so Lokalisierung des Signals zu einem Strang Bruch aufgrund dieser Signallaufzeiten begrenzt sein kann. Daher ermöglicht die Kombination von γH2AX mit 53BP-1 für eine genauere Beurteilung der DSB Bildung innerhalb des Schadens ROI.
Die Beantwortung von γH2AX und 53BP-1 Mikro-Bestrahlung ist Wellenlänge und dosisabhängig. Die niedrige Dosis (2 s) Stimulation bei 355 nm entlockt keine Antwort bei 5-20 min und eine schwache und Variable Antwort 10 min Post Bestrahlung(Abbildung 3)für beide Marken. Die hohe Dosis (10 s) von 355 nm Mikro-Bestrahlung induziert eine erhöhte Fluoreszenzsignal innerhalb der Schaden ROI auf 5, 10 und 20 min Post Bestrahlung, die bei 40 min (Abbildung 3B) reduziert wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sorgfältige Titration von 355 nm-Dosis ist erforderlich, um Kreuz-Stimulation der Reparatur Wege zu minimieren, wie gezeigt durch den reduzierten Nachweis der Doppelstrang Pause Marker γH2AX zu den frühen Zeitpunkten (&#60; 20 min) in der niedrigen Dosis angewendet.
Ähnliche Experimente wurden mit niedrig (8 Bilder pro Sekunde) und hohe Dosis (0,5 fps) 405 nm Laser Stimulation (Abbildung 4) durchgeführt. Bei dieser Wellenlänge beobachtet signifikante Häufung von Fluoreszenz Intensität innerhalb des Schadens ROI für 53BP-1 und γH2AX unabhängig von der angewendeten Dosis, darauf hinweist, dass diese Dosen ein komplexes Gemisch von Einzel- und Doppelzimmer Strangbrüche fast generieren unmittelbar nach der Induktion von DNA-Schäden (Abbildung 4). Darüber hinaus erschwert die hohen Dosen von 405 nm zeigen eine Zunahme der Pan-nuklearen γH2AX Färbung innerhalb von 10 min der Schaden Induktion (Abbildung 4B, unten), die Schadenserkennung ROI zu berichten, während die 53BP-1-Ansammlung ist mehr in den Schaden ROI enthalten.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass 405 nm Mikro-Bestrahlung nicht geeignet zur Überwachung von SSBR oder BER ist, und dass mehrere Marker für die DNA-Addukten und strand Pausen eingesetzt werden, sollte um die induzierte Läsionen und DNA-Reparatur Antworten vollständig zu charakterisieren.
Dosis-abhängige Änderung der Rekrutierung und Bindung von XRCC1-GFP Sobald die induzierte DNA-Schäden charakterisiert worden ist, kann Mikro-Laserbestrahlung eine ideale Plattform für die Untersuchung der Dynamik des DNA-Reparatur-Proteine werden. Die Aufbewahrung und Dissoziation Kinetik der XRCC1-GFP zeigt eine Dosisabhängigkeit (Abbildung 1), die nicht unerwartet die Induktion von verschiedene Schäden Mischungen von jeder Wellenlänge gegeben ist. Die höchste Einstrahlung Dosen (10 s und 0,5 fps) zeigen eine höhere Intensität Rekrutierung von XRCC1-GFP im Verhältnis zu den niedrigeren Dosen und längerer Verweildauer der XRCC1-GLP am Ort der Schädigung im Laufe 20 min Zeit (Abbildung 1C). Dies bedeutet, dass die DNA-Schäden, die bei höheren Dosen für 355 und 405 nm erstellt dürfte nicht gelöst, im Verlauf des Experiments, die im Einklang mit der Erscheinung und Aufrechterhaltung der DSB Marker, γH2AX und 53BP-1 (Abbildungen 3 &#38; 4 ).
Interessanterweise zeigen die niedrigeren Schaden-Dosen (2 s und 8 Bilder pro Sekunde) schnelle Rekrutierung von XRCC1-GFP zu Schaden-Websites und Dissoziation der XRCC1-GLP experimentelle Zeit Laufe vor Bestrahlung Ebenen (Abbildung 1C). Ohne die vollständige Charakterisierung der Schaden Mischung kann dies zu dem Schluss führen, dass SSBs und base Läsionen mit diesen schädlichen Bedingungen vollständig gelöst sind. Jedoch das Vorhandensein von γH2AX und 53BP-1 bei 40 min für 355 nm und 5 Minuten für die 405 nm kann zu unterschiedlichen Interpretationen führen. Für die 355 nm 2 s Dosis möglicherweise Schaden Mischung überwiegend SSBs, so dass das Aussehen der DSB-Marker bei 40 min angeben kann, dass einige unrepariert Läsionen zum DSB führen können oder dass DSB durch diese Energie erzeugt auf einer längeren Zeitskala repariert werden. Skala Zeitunterschiede zwischen SSBR und DSB-Reparatur wurden bisher gemeldeten28,41,42. In gleicher Weise 405 nm niedrigdosierte (8 Bilder pro Sekunde) Dissoziation deutet auf ein niedriges Niveau der SSBs oder Mikro-Bestrahlung und andere DNA Beschädigung Agenten schädigen ein clustering von SSBs, die schnell, DSB, umgewandelt werden, die für hohe gemerkt worden ist bisher43, 44 , 45.
Zusammen diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Charakterisierung der induzierten Schäden Mischungen und Nutzung mehrerer DNA Reparatur Proteine und Markierungen für die Interpretation der Rekrutierung und Bindung von DNA Reparatur Proteine an den Standorten des verursachten Schadens.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
Abbildung 1 . Mikro-Laserbestrahlung induziert Rekrutierung von XRCC1-GFP.  (A) CHO-K1 Zellen stabil auszudrücken XRCC1-GFP wurden bestrahlt und abgebildet vor und unmittelbar nach Schaden Induktion. Pfeile zeigen die Position des Mikro-Bestrahlungsdosis und Maßstabsleiste ist 10 µm. (B) Rekrutierung wird gemessen, indem die mittlere Fluoreszenz Intensität innerhalb des Schadens ROI Ermittlung und Normalisierung der mittlere fluoreszierende Intensität des gesamten Kernes. (C) Dynamik der Rekrutierung kann für jedes Timelapse-Bild gemessen werden. Graphen sind Vertreter von zwei unabhängigen Experimenten mit Fehlerbalken repräsentieren die SEM (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
Abbildung 2 . Mikro-Laserbestrahlung induziert Nukleotid Schaden.  CHO-K1 Zellen wurden um zu laser-Mikro-Bestrahlung ausgesetzt und sofort nach Induktion der Schaden behoben. Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um die CPD erkennen und 8-OxodG Addukte. (A) oben, Streudiagramm der ROI bedeuten Fluoreszenz Intensität beobachten geschädigte Zellen nach der CPD Färbung. Unten, repräsentative Bilder der CPD Färbung. Pfeile zeigen die Lage der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm (n = 12). (B) repräsentative Bilder für 8-OxodG Färbung. PfeileGeben Sie die Position der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
Abbildung 3 . DNA-Doppelstrang Pause Markern reagieren auf 355 nm Mikro-Bestrahlung in einer Dosis-abhängigen Weise.  CHO-K1-Zellen wurden Mikro-Bestrahlung ausgesetzt und auf die Zeit Punkte angegebene Post-Stimulation. Immunfluoreszenz für die DSB-Marker-γH2AX und 53BP-1 wurde durchgeführt. (A) scatter Plot normalisierte Beschädigung ROI Fluoreszenz-Intensität gemessen für unbeschädigt und beschädigte Zellen bedeuten. Fehlerbalken sind repräsentativ für die SEM (n = 12). (B) repräsentative Bilder für γH2AX und 53BP-1 zu beflecken. Pfeile zeigen die Lage der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
Abbildung 4. DNA-Doppelstrang Pause Markern robust auf 405 nm Mikro-Bestrahlung reagieren. CHO-K1 Zellen wurden Mikro-Bestrahlung ausgesetzt und die Zeit Punkte angegebenen Post Stimulation festgesetzt. Immunfluoreszenz für die DSB-Marker-γH2AX und 53BP-1. (A) scatter Plot normalisierte Beschädigung ROI Fluoreszenz-Intensität gemessen für unbeschädigt und beschädigte Zellen bedeuten. Fehlerbalken sind repräsentativ für die SEM (n = 12). (B) repräsentative Bilder für γH2AX und 53BP-1 zu beflecken. Pfeile zeigen die Lage der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.6K Aufrufe.  University of South Alabama Mitchell Cancer Institute. Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Serie: Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Forschung

Genetik

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Biologie

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

Laser-Mikrobestrahlung zur Untersuchung der DNA-Rekrutierung während der S-Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...