Name: biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092 at JoVE.com

Klonlama, Gemma Harris sn-alışveriş merkezleri ve beamlines I03 ve I04 elmas ışık kaynağında bilim adamları için'yardım OPPF-İngiltere anıyoruz.

Not: sinyal peptid silindi kodlama dizisi standart bir füzyon protokol sonrası pOPINF vektörde klonlanmış; yerli protein Escherichia coli BL21 Rosetta hücrelerdeki bir etiket onun füzyon olarak ifade 28 , 29. değişken etiketli selenomethionine üretici 30 göre standart yöntemleri aşağıdaki ifade edilir. SBP daha önce saflaştırılmış rekombinant 31 , 32 açıklanan.
 1. biyokimyasal karakterizasyonu <ol><li>termal kayması tahlil <ol><li>hazırlamak 48 tampon çözeltiler 4.0 arasında değişen pH 9,5 ve NaCl konsantrasyon için 0-0, 5 M ve açıklandığı gibi bir 96-şey plaka 40 µL dağıtmak Tablo 1 33.</li> <li>eklemek için 1-2 mg/mL konsantrasyonu SBP çözümün de 5 her µL.</li>
		<li>Eklemek için 20 x için (bkz: Malzemeler tablo) protein flüoresan leke de 5 her µL.</li>
		<li>Pipetting tarafından çözümleri karıştırmak, şeffaf yapışkan film kullanarak plaka mühür ve spin 112 x g oda sıcaklığında 2 min için.</li>
		<li>Deney gerçek zamanlı bir makinede çalıştırın: 99 ° C ile 10 s ayrı tutma zamanı için 4'ten 3 ° C/dak bir sıcaklık rampa ayarlayın ve floresan her 0,5 ° C uyarma, 483 nm ve emisyon 568, okumak nm.</li>
		<li>Analiz için erime sıcaklık (T m) türevi en az tanımlayan her arabellek durumuna Floresans emisyon eğrileri. 
		Not: Bu yordam protein istikrar düzelme yardım için en iyi arabellek çözüm iyi bir göstergesi verir. PH aralığı ve tuz konsantrasyonu yüksek T m ile arabellek durumuna göre seçim ve gliserol ve 0,5 mM, %2.5 (v/v) eklemek tris(2-carboxyethyl) aşağıdaki adımları (sn-tampon) için arabellek çözüm tanımlamak için fosfamin (TCEP).</li>
	</ol></li> <li>MALS ve analitik sn <ol><li>degassed filtrelenmiş su (kullanım geniş moleküler ağırlık 24 mL sütun) ile ambalajlı jel filtrasyon sütunun iki sütunlu cilt yıkama gerçekleştirmek.</li>
		<li>Sütun ışık saçılma bulmak-e doğru bağlamak ve termal üst karakter tahlil kararlı sn arabelleğinden sütunla equilibrate.</li>
		<li>5 mg/mL dengelenmiş sn sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine, saflaştırılmış SBP enjekte 100 µL.</li>
		<li>Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve molar kütle ve tüm türler için polydispersity dizin edinme analiz yazılımı kullanarak saçılma verileri incelemek. 
		Not: bir oligomeric türlere karşılık gelen her zirve için polydispersity kontrol etmek yararlı olduğunu dizin hesaplanan molar kitle ağırlıklı molekülleri (Mw/Mn) sayısına kütle/azı kitle üzerinde ağırlıklı olarak. Polydispersity değeri 1 yakın bir monodispersed pik gösterir. 
		Not: Bütün Oligomerizasyonda türlerin tanımladıktan sonra daha yüksek konsantrasyonlarda daha büyük oligomer oluşumu lehine protein konsantrasyonu, bağımlılığını eğitim yararlı gibi.</li>
		<li>Yürütmek birden çok analitik sn çalıştırma; artan konsantrasyonları (0.1 - 10 mg/mL) dengelenmiş jel filtrasyon sütuna (kullanım geniş molekül ağırlığı 5 mL sütun), saflaştırılmış SBP 100 µL enjekte ve her zaman bir sütun birim sn-arabelleği akış.</li>
		<li>Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve 280 Absorbans Koyulukları çözümlemek için farklı başlangıç protein konsantrasyonları karşılık gelen eğrilerinin nm. Farklı doruklarına göreli yoğunluklarda sabit kalırsa, oligomeric türler arasında arası dönüştürme mevcut değildir. Farklı konsantrasyonlarda göreli Koyulukları içinde çeşididir şekilde protein konsantrasyonu bağlıdır farklı oligomeric türler arasında bir göstergesi. 
		Not: Bu karakterizasyonu hangi tür kristalizasyon için daha uygundur tanımlamak için temel adımdır. Gerçekten de, farklı monodispersed tür tanımlanmış bir konsantrasyon bir sabit oligomeric durumda olmaları durumunda kristalize daha yatkındır.</li>
	</ol></li></ol> 2. Protein hazırlık ve kristalizasyon <ol><li>partiye hazırlık sn <ol><li>bir tek sütunluk birimi sonra yıkama degassed süzülmüş suyla equilibrate sn-tampon ile (geniş bir Moleküler ağırlığı 120 mL partiye hazırlık ambalajlı jel filtrasyon sütun sütun).</li>
		<li>1-5 mL, 5-50 mg/mL saf SBP dengelenmiş jel filtrasyon sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine enjekte.</li>
		<li>Sütun akışı aracılığıyla 1 mL kesirler toplamak.</li>
		<li>Bir tek monodisperse zirveye karşılık gelen kesirler havuz; 15 mL aralıklarla filtreleri 1.500 g de örnekte spin ve istenen konsantrasyonu elde kadar konsantrasyonu ölçmek (genellikle SP0092 için 50-100 mg/mL).</li>
	</ol></li> <li>Kristalizasyon <ol><li>kristalizasyon deney öncesi kristalizasyon Test üretici tarafından açıklandığı gibi kullanarak en iyi toplama aralığını belirlemek: <ol><li>besleme 0.5 - 1.0 mL her dört kristalizasyon testi 24-iyi oturan farklı bir rezervuar çözümlerinde kristalizasyon plaka bırakın.</li>
			<li>Protein çözüm 1 µL rezervuar çözüm 1 µL ile karıştırılarak kristalizasyon damla hazırlamak, plaka mühür ve oda sıcaklığında en az 1 (bir gecede kuluçka sonra daha güvenilir sonuçlar elde edilen) s için kuluçkaya.</li>
			<li>Kontrol damla kalite 10 x büyütme mikroskop kullanarak her yoğunlaşması. 
			Not: Test en az üç farklı protein konsantrasyonu: (I) açık kalan damla çoğunu belirtmek protein çok seyreltik kristalizasyon için; (II) damla çoğu ağır çökelti varlığı bir aşırı yüksek konsantrasyon anlamına gelir; ve (III) dengeli bir oluşum açık düþer ve çökelti (Eğer ışık daha iyi) test konsantrasyon kristalizasyon için olumlu olduğunu iyi bir göstergesidir.</li>
		</ol></li> <li>96-şey oturma inis kristalizasyon tabak hazir; her rezervuar iyi 34 , 35 , farklı ticari kristalizasyon çözeltinin 100 µL dağıtmak 36 , 37.</li> <li>dağıtmak 100 nL kristalizasyon Robotik sistem kullanarak tüm kristalizasyon damla Wells önceden tanımlanmış konsantrasyonu (Adım 1.1.6) adlı protein örneği.</li>
		Karşılık gelen kristalizasyon <li>dağıtmak 100 nL farklı baraj gölünün çözümler adım 2.2.3 reçete protein ile karıştırmak için kuyu bırak. Buharlaşma önlemek ve kristalizasyon damla ile havzanın denge etkinleştirmek için kristalizasyon plaka mühür.</li>
		<li>Kontrol damla düzenli olarak (başlangıçta her 1-2 günde, daha sonra her hafta) 10 x (en az) kullanarak kristal oluşumu ve büyüme değerlendirmek için büyütme mikroskobu. 
		Not: protein kristalizasyon için kullanılan için otomatik görüntüleme sistemi görselleştirme ve yakalama düşüyor.</li>
	</ol></li></ol> 3. Kristal karakterizasyonu ve x-ışını veri toplama <ol><li>kristal montaj <ol><li>hazırlamak cryoprotectant çözüm % 25'i (v/v) gliserol (son konsantrasyonu) ekleyerek (böylece ilk suda % 25'i yerine kristalizasyon durumuna karışımı) 38.</li>
		<li>Doldurmak bir köpük dewar sıvı azot ve yer dewar içine uni-Pak örnek muhafaza parçası ile. Sıvı azot sıcaklık için soğumasını bekleyin.</li>
		<li>Kes ve mühürleme teyp kristalizasyon plaka nerede kristalleri oluşan açılan kaldır.</li>
		<li>Bir damla hedef damla yakın konumlandırılmış bir coverslide üzerine cryoprotectant çözüm 1 µL yerleştirin.</li>
		<li>Seçili kristal bir manyetik değnek 39 , 40 üzerinde monte edilmiş bir omurga standart üsteki bir naylon cryo-döngü kullanarak cryoprotectant çözüm damla özgün damla--dan transfer.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde kristal cryoprotectant damla--dan sıvı azot döngüsü uni-Pak örnek sahibi ilk boş pozisyon yerleştirerek, transfer.</li>
		<li>İstenen kristalleri hasat ve uni-Pak örnek tutucu içinde depolanan kadar (sızdırmazlık bandı kesme) tekrarlayın.</li>
		<li>Yer uni-Pak temel uni-Pak puck değnek kullanarak ve beamline (sıvı azot koşullarda) Pak almak. 
		Dikkat: Son derece düşük derece!</li>
		<li>Kullanmak cryo-maşa ve Pak dewar yükleme aracı uni yüklemek için-puck(s) beamline örnek değiştirici robot içine dewar. Uni-Pak örnek sahibi örnek döngü sahipleri örnek robotun içine dik bırakarak temel kapak üzerinden ayırmak dewar ve böylece sıvı nitrojeni maruz ve örnek değiştirici robot tarafından erişilmesini.</li>
	</ol></li> <li>Kristal karakterizasyonu Not: hasat kristaller daha sonra bir laboratuvar x-ışını kaynağı'nı kırınım kalitesi için veya bir sinkrotron radyasyon (SR) x-ışını kaynağı ekranlı. Makromoleküllerin kristalografisi (MX) beamlines yapı çözüm için anormal kırınım yararlanmak için ayarlanabilir enerji kaynağı sağlamak. Aşağıdaki bölümde, deneysel yetenekleri doğrultusunda çalışma talimatların elmas ışık kaynağı MX beamlines bir dizi teklif edilir ancak bu yönergeleri de MX beamlines, diğer synchrotrons dünya çapında adapte edilebilir.
	<ol><li>İlk adım olarak, onaylamak veya anormal scatterers kristal tanımlamak yararlıdır. Bu uygun bir x-ışını Floresans spektrum kristal üzerinden ölçerek elde edilebilir. İlk beamline x-ışını enerji tüm öğeler genellikle makromoleküllerin kristalleri için beklenen heyecanlandırmak için yüksek ayarlanır emin olun (14 keV veya daha yüksek).</li>
		<li>Örnek değiştirici robot tarafından monte edilebilir örnek seçmek için beamline kontrol yazılımı kullanın; döngü otomatik olarak x-ışını ışının içinde ortalanır ve kristal merkezleme beamline kontrol yazılımı kullanarak el ile onaylanabilir.</li>
		<li>Kayıt beamline kontrol yazılımı kullanarak bir x-ışını Floresans spektrum: kullanıcı bir çekim hızı seçer ve ölçüm başlatır (floresan/floresan spektrum ayarı, &#8594; koş, şekil 2A). Beamline kontrol yazılımı otomatik olarak Floresans dedektörü yerleştirin ve en az olay Floresans dedektörü okunabilir bir sinyal almak için x-ışını akı belirler X-ray konumlandırır. Edinsel spektrum sonra doğal olarak meydana gelen için donatılmış emisyon zirveleri ile otomatik bir biçimde analiz biyolojik öğeler. Bu yordamlar beamline kontrol yazılım grafik kullanıcı arabirimi (GUI) - GDA (www.opengda.org) Firmamız ve synchrotrons Europe 41 , 42 boyunca içinde kullanılabilir.</li>
		Eğer uygun öğeleri tespit <li>bu anormal kırınım deney için yararlanılabilir, kristal anormal kırınım veri toplama için en uygun dalga boyu belirlemek için bir x-ışını soğurma kenar enerji taraması gerçekleştirin: beamline tarihinde kontrol yazılımı, öğeyi seçin ve tarama başlatmak (floresan/floresan ayarı, inceden inceye gözden geçirmek &#8594; Atom adı, &#8594; koş, şekil 2B). 
		Not: bir tek anormal kırınım deneme için emme kenar zirvesine anormal saçılma en üst düzeye çıkarmak için kullanılır. Deneysel dikkat edilmesi gereken noktalar bir çok dalga boyu anormal kırınım deneyi gerçekleştirmek için daha önce ayrıntılı 43 olmuştur.</li>
		Kristal birim hücre parametreleri, simetri ve kırınım sınırı belirlemek için <li>salınım yöntemini kullanarak 45 ° aralıklarla üç x-ışını kırınım desen ölçmek (veri toplama/tarama &#8594; geçerli, koşmak Şekil 2C). Beamline kontrol yazılımı, salınım açısı ve çekim hızı ve röntgen ışını yüzdesi ayarlamak için yeteneği ile kullanıcıya sunar. Standart kristal tarama için 0.5°, bir çekim hızı 0.5 s ve % 5 x-ışını demeti iletim salınım açısı önerilir. Ölçülen kırınım görüntüleri EDNA boru hattı tarafından otomatik olarak analiz edilir ve stratejileri tam veri kümesi 22 topluluğu için bir dizi dönmek.</li>
	</ol></li> <li>X-ışını veri toplama Not: Kullanıcı standart salınım modu veya Friedel arkadaşları yakın zaman ve x-ışını doz ve yaklaşık aynı emme davranışı ile kayıt altına sağlar ters ışın modu verilerini toplamak üzere seçebilirsiniz anormal farklılıklar daha doğru bir ölçüm sağlar. İkincisi özellikle küçük anormal farklılıklar bekleniyor ve/veya örnekleri radyasyon hassas anormal kırınım deney gerçekleştirirken kullanışlıdır. En iyi veri toplama stratejileri kullanmak için önemli noktalara kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiş 22 , 23 , 44 , 45 olmuştur , 46 , 47. <ol><li>beamline kontrol yazılımı kullanarak içe aktarma veri koleksiyon parametrelerini sağlayacak strateji program tarafından önerilen: ı. ω-dönme ekseninin başlangıç konumunu II. Salınım genişliği ω-eksen dönme açısı için her kırınım görüntü III. Pozlama süresi her kırınım resim için IV. Sayı-in imge (dolaylı olarak toplam ω-eksen döndürme açısını tüm veri toplama için tanımlama) tam veri kümesi için aşırı pozlama ve radyasyon zarar görmemesi için x-ışını demetinin zayıflama yüzdesi v. Not: bizim kurumu için veri toplama çalışan, toplanan verilerin otomatik işleme için yazılım boru hatları iyi kurulmuş: (i) kırınım veri (dizin oluşturulmuş, tümleşik ve ölçekli) azalır xia2 boru hattı tarafından hangi kullanıcı için yansıma mtz dosyaları üretir aşamalı ve yapı çözüm/arıtma 48 için giriş olarak. (ii) ne zaman önemli bir anormal sinyal algılandığında veri çözümlemesi sırasında SHELX kullanarak bir ilk hızlı otomatik yapı çözüm boru hattı (fast_ep) ağır atom altyapı deneysel çözmeye çalışır phasing, aşamalı elektron yoğunluğu harita sağlayan nerede mümkün. Bir ikinci daha kapsamlı yapı çözüm boru hattı otomatik olarak çözmek ve structu inşa girişimleri taahhüt ederkullanarak bağımsız yazılım suites 49 , 50 , 51 , 52; Nerede bu başarılı olmadığı durumlarda, kullanıcı bir ilk model ve elektron yoğunluğu harita ile sağlanacaktır. Bu arıtma tamamlayıp modeli seçim crystallographic yazılım paketleri ile doğrulamak kullanıcı için temel sağlar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu kağıt, açıklama ve karbonhidrat SBPs proteinler S. pneumoniaesayfasından belirli bir vurgu ile biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için entegre bir iletişim kuralı doğrulama. Yine de, bu diğer SBPs farklı organizmalar üzerinden ve hatta diğer ilgisiz çözünür proteinler analizi için standart bir prosedür olarak kullanılabilir.
Protokol ilk bölümünü protein istikrar ve protein örnekleri hazırlanırken kristalizasyon yararlanan dördüncül yapı biyokimyasal bilgilerini sağlamaya odaklanmıştır. Termal kayması deneyleri bölümünde, biz sadece pH ve bu yordamı genel hükümlerini korumak için NaCl toplama varyasyon tanımlamak. Buna rağmen birçok diğer arabellek şartlar benzer bir şekilde, örneğin, herhangi bir kimyasal bileşik teskin katkı maddesi kullanılan da dahil olmak üzere test edilebilir: özellikle belirli bir SBP bağlamak gerçek ligand(s) Tartırmada son derece etkili m bir kaç santigrat derece31tarafından. Bazı durumlarda, denaturing eğriler kötü düşük sinyal veya protein toplama veya kısmi elinde tutmasına neden bir yüksek floresan arka plan nedeniyle tanımlanabilir. Bunu önlemek için bir protein: boya titrasyon belirsiz denaturing eğrileri en iyi duruma getirmek için gerçekleştirilebilir. Hiçbir gelişme edindiyseniz, protein kararlılığını iyileştirmek çeşitli katkı maddeleri eleme tavsiye edilir ve uygun ekranları yukarıda açıklanan54olmuştur.
Genellikle, çoğu SBPs doğal ortamlarında monomeric, ama burada gösterildiği multimerization kristalizasyon deneylerde kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda oluşabilir, böylece MALS ve SEC tarafından sağlanan Oligomerizasyonda davranış karakterizasyonu kristalizasyon için en uygun istikrarlı monodisperse Oligomerizasyonda durumunu değerlendirmek için gerekli. Bununla birlikte, farklı kimyasallar proteinler Oligomerizasyonda davranışı üzerinde kristalizasyon koşul dahil etkisini tahmin etmek zordur. SN ve MALS muayene protein örneği kapsamlı toplama gösteriyorsa, bu oluşma olasılığını azaltmak için aşağıdaki tavsiye ederiz: taze protein örneği (değil donma çözdürülen) kullanmak ve termal ile gerçekleştirilen sabitleme analiz genişletin shift deneyleri, olası katkı maddeleri ve hafif deterjanlar son bir kaynak olarak toplama en aza indirmek için test. Bu yazıda, bu protokol genel hükümlerini korumak için yüksek üretilen iş seyrek matris ticari kristalizasyon tarama kullanarak kristalizasyon için temel kuralları tanıtacağız. Ancak, yüksek çözünürlüklü x-ışını kırınım protein kristalleri elde etme kristalizasyon koşulları precipitant konsantrasyonu, pH, kimyasal katkı maddeleri, farklı sıcaklıklarda, ilavesi ile ilgili olarak en iyi duruma getirmek için yinelemeli ince ayar gerekir ve diğer kristal damla ve rezervuar16,17arasında değişen denge dynamics faktörler.
Protokolünün ikinci parçası üzerinde üzgün phasing için anormal veri edinimi x-ışını kırınım veri koleksiyonu belirli bir odak için en iyi strateji tanımlamak için protein kristalleri karakterizasyonu açıklar. SBPs benzer bir genel yapısı korumak (ve potansiyel olarak kullanılabilir modeller başlangıç olarak yatırılan 3D modellerinden olsa bile), bu Proteinlerin moleküler değiştirme yöntemi tarafından aşamalı her zaman değişkenlik nedeniyle basit değil İkincil yapı elemanları ve bu proteinlerin iç esneklik. Bu nedenle, biz üzgün yöntemi teklif ve bu proteinler zaten özünde metaller veya gerçekten özel bağlama metallerin anormal diffracting öğeleri bir dizi sağlayabilir kristalizasyon arabellek koşullar bağlı olduğunu vurgulamak bir bizim genel iletişim kuralı standart adımda.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralı bir standart güdümlü iş akışı yanı sıra yapı belirlenmesi başarı oranını artırmak hızlandırmak için istismar SBPs biyokimyasal ve yapısal özellikleri ayrıntılı açıklamasını sağlayan yordamlar tanımlar SBPs yapısal karakterizasyon genel olarak.

S. pneumoniae (pnömokok) olduğunu asymptomatically neden otitis, septisemi, pnömoni, sepsis normalde steril nişler geçirmek için yeteneği ile insan solunum yolu üst solunum yolları içinde bulunan gram-pozitif bir bakteri ve Menenjit1,2. Ayrıca, pnömokok enfeksiyonu bir klinik ve ekonomik yük dünya çapında3,4' e katkıda bulunan topluluk edinilen pnömoni önde gelen nedenidir. Antibiyotik dirençli S. pneumoniae suşları dünya genelinde yayılmış ve yedi valent ve on üç-valent pnömokok protein eşlenik aşı yardımcı oldu rağmen antibiyotik direnci, yedek suşları oranını azaltmak aşı kullanımı ortaya çıkmıştır ve araştırma için artan talepleri pnömokok hastalığı5,6,7,8için yeni tedavilerin geliştirilmesi içine açmıştır.
Pnömokok ev sahibi bir karbon kaynağı9,10olarak alınan şeker bağlıdır; Gerçekten de onun alma makine taşıma 32 farklı karbonhidrat11,12,%1330'u ayırıyor. Bu ithalatçılar en az sekiz ABC-taşıyıcı13içerir. ABC Taşıyıcılar hücre dışı SBPs ligand için özgüllük belirleme ve hücre alımı için integral membran taşıyıcı için sunma temel bir rol oynar. Çünkü onlar yüzey proteinleri ve hücresel onların önemli rol SBPs yeni aşılar ve antimicrobials tasarımı için geçerli hedefler temsil eder.
Hedef protein karakterizasyonu ve ligand cepler ve etki alanları arasında esneklik gibi yapısal özellikleri ayrıntılı bir açıklama yararlı bir araç için uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım14,15sağlar. X-ışını kristalografisi atomik çözünürlük yakın proteinlerin yapısal karakterizasyon için seçim yöntemi, ama kristalizasyon işleminin öngörülemeyen, zaman alıcı ve her zaman başarılı değil. Gelişmiş sistematik yöntemlerle başarı oranı ve örnek kalite ve istikrar önemli faktörlerdir. Kristalizasyon başarı oranını içindeki protein kimyasal özellikleri ve örnek hazırlama yöntemleri tarafından etkilenir. Bunlar etkisini değerlendirildi ve biyokimyasal karakterizasyonu16,17tarafından haberdar.
Bir başka komplikasyon yapısı tabanlı tasarımı için ele alınması gereken crystallographic faz sorun. Gibi daha fazla protein yapıları kullanılabilir, birçok yapılar homolog yapısı18gerektirir moleküler değiştirme yöntemi tarafından çözülebilir. SBPs esnek etki alanı yapısı sunmak, moleküler değiştirme de zorlu19olabilir. Hedef protein için yeterince benzer bir yapısal model kullanılabilir değilse, bir takım teknikler deneysel aşamalı20almak için kullanılabilir. Bunlar arasında tek dalga boyu anormal dağılımı (SAD) yöntemi birincil tekniği ortaya çıkmıştır ve yoğun faz sorun21çözmek için kullanılan. ÜZGÜN yönteminin kullanımı daha fazla donanım ve yazılım gibi algılama ve22,23, phasing için zayıf anormal sinyallerin kullanım izin vermek için veri toplama stratejileri geliştirmeleri ile gelişmiş 24. yapıları oluştururlar, hangi kırınım veri atomik çözünürlükte gerekli, geçmişte şimdi programda uygulanan olarak stereochemical bilgi Örneğin, birleştirerek yararlı olabilir için Ayrıca, doğrudan yöntemlerdeki gelişmeler ARCIMOLDO25. Kristalografi faz problem çözme yöntemleri yararlı bir daha gözden geçirme Taylor26tarafından verilir.
Burada karbonhidrat taşıma SBP, SP0092 S. pneumoniae, karakterizasyonu için ayrıştıran bir protokol biyokimyasal ve yapısal teknikleri (şekil 1) entegre mevcut. Bu adım adım iletişim kuralı hayat tüm Krallık içinde bulunan genel olarak, SBPs üzerinde yapısal çalışmaların başarı oranını artırmak için stratejiler yararlı örnek test olgusu sağlar. Özellikle, protokol hızlı ve etkili bir yöntem çözümde protein en istikrarlı oligomeric durumunu karakterize önemini vurgular ve kristalizasyon deneyler için takip etmek için en iyi tür tanımlamasını sağlar. 500'den fazla SBP yapıları içinde Protein veri Bankası27rapor olsa da, moleküler yedek bir menteşe bölgesi19tarafından bağlı iki α/β etki alanı doğal esnek yapısı nedeniyle zor olabilir. Böylece, iletişim kuralının ikinci bölümü, üzgün phasing üzgün yöntemiyle ilişkili metal iyonları SBPs ortak yanı sıra selenomethionine birleşme ve selenyum (Se) kullanımı olan phasing için açıklar.

<table><tbody><tr><td>SelenoMethionine Medium Complete</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD12-500</td><td>Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well plate</td><td>Applied Biosystems</td><td>4306737</td><td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems&amp;reg; 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Molecular Probes</td><td>S6651</td><td>SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive film</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4362143</td><td>The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.</td></tr><tr><td>Superdex 200 increase 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.</td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II</td><td>Wyatt</td><td></td><td>DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.</td></tr><tr><td>Superdex 200 5/150 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906561</td><td>Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the &quot;increase&quot; version but this model is ideal for the standard day by day use.</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.</td></tr><tr><td>24 Well &quot;Big&quot; Sitting Drop Crystallization Plate</td><td>MiTeGen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td>The 24 well &quot;big&quot; crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.</td></tr><tr><td>PCT Pre-Crystallization Test</td><td>Hampton</td><td>HR2-140</td><td>The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.</td></tr><tr><td>96 Well CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>6098xx</td><td>Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.</td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-601</td><td>The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)</td></tr><tr><td>Standard Foam Dewar</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-35</td><td>5.7&quot; diameter by 2.8&quot; deep. 800mL capacity.</td></tr><tr><td>Mounted CryoLoop - 20 micron</td><td>Hampton</td><td>HR4-955</td><td>Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes&amp;trade; that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.</td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Puck dewar loading tool</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-607</td><td>This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.</td></tr></tbody></table>

biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092

Yeni antimicrobials ve aşı geliştirilmesi Streptococcus pneumoniae (pnömokok) için çoklu dirençli suşların hızlı artış durdurmak gerekli. Karbonhidrat substrat proteinler (SBPs) protein bazlı aşılar ve yeni antimicrobials geliştirilmesi için uygun hedefler nedeniyle ekstrasellüler onların Yerelleştirme ve pnömokok metabolizması için karbonhidrat alma merkezi temsil etmek, anılan sıraya göre. Burada açıklanan SP0092, pnömokok ve diğer bakteriler diğer karbonhidrat SBPs uzatılabilir kapsamlı bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için entegre bir ayrıştıran protokoldür. Bu yordamı inhibitörleri bu sınıfın proteinlerin yapısı tabanlı tasarımı yardımcı olabilir. Sunulan bu yazının ilk bölümünde termal üst karakter tahlil göre biyokimyasal analiz için kurallarıdır, çok ışık saçılma (MALS) açı ve dışlama Kromatografi (sn), hangi istikrar optimize boyutu ve örnek polimerlerin yönelik kristalizasyon denemeler ve bu yüzden başarı geliştirin. Bu yordamı ikinci bölümü kristalize protein çözümlemek için kullanılan ölçüm verileri için ayarlanabilir dalga boyu anormal kırınım sinkrotron beamline ve veri koleksiyon iletişim kurallarını kullanma SBP kristalleri karakterizasyonu açıklar yapısı.

Bu tümleşik iletişim kuralı dört ile başarılı olmak için kanıtlanmıştır (iki yayınlandı ve iki yapıları yayımlanmamış) pnömokok bağlayıcı protein hedefler altı karbonhidrat analiz32,53bugüne kadar. Bu bölümde, biz SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon SBPs yapısal çalışmaların genel rehberlik için temsil edici bir sonucu olarak mevcut.
Sonra SBP SP0092 ifade edilen ve daha önce32tanımlandığı gibi saf saf protein termal üst karakter tahlil kullanarak arabellek istikrar için analiz edildi: SP0092 sergileyen bir artan Tm pH 6,5 NaCl varlığında 0 - 0.2 M konsantrasyon aralığı (şekil 3A). Bunun ışığında, aşağıdaki adımları için arabellek çözüm olarak tanımlanmıştır: 0,02 M MES pH 6.5, 0.2 M NaCl, %2.5 (v/v) gliserol, 0,5 mM TCEP. SP0092 farklı Oligomerizasyonda durumları mutlak molar kütlesi tetrameric, trimeric, dimerik ve monomeric türleri için karşılık gelen 187.2, 140.8, 97.0 ve 49,4 kDa, moleküler ağırlık ölçme sn birleştiğinde MALS tarafından ölçüldü () sırasıyla Şekil 3B). Farklı protein dilutions sn profilde analizini artan protein konsantrasyonu, daha büyük reaksiyonlar genellikle kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda daha kararlı olduğunu düşündüren Oligomerizasyonda tetiklediği saptandı kristalizasyon. Nitekim, saflaştırılmış büyük oligomeric türler kristalizasyon denemeler için yönetmen başarıyla üretilen protein kristalleri tür did değil monomer tamamlayın.
En iyi duruma getirilmiş kristalleri yerli elde edilen ve Se-metiyonin SP0092 türlü etiketli x-ışını kırınım tarafından karakterize. Bu kristaller gelen x-ışını Floresans ölçümü Se beklendiği gibi sadece Se-metiyonin kristalleri için algılandı ise protein, bağlanan Zn için emisyon tepeler her iki durumda da ortaya koydu. Hangi olay x-ışını dalga boyu ilgili x-ışını soğurma kenarlarına Zn veya Se ayarlamak için doğrudan deneysel veri kristallerin anormal sinyal en üst düzeye çıkarmak için mevcut sağlanan x-ışını soğurma taramaları Se ve Zn kenarlarında sonra gerçekleştirilen Sonuç veri (şekil 4A-B) üzerinden elde edilebilir.
Düşük iletim adlı üç kırınım şablonlarını ölçmek sonra tam bir anormal veri kümesi EDNA (şekil 4 c) tarafından önerilen veri toplama stratejisini kullanarak elde edildi. Anormal sinyal mevcut otomatik aşamalı boru hattında alt yapısını belirlemek için beamline tetikler ve elde edilen ilk deneysel aşamalarında dayanan, üreten ilk haritalar ve sonra rafine ve doğrulanmış modelleri (şekil 4 d ).
Özet olarak, olası tehlikelere tekniği öncelikle kristal mevcudiyeti ve kalitesinden ortalanır. Optimizasyon protein kararlılığınızı geliştirmek için arabellek koşulların yanı sıra protein çözümde, birden fazla oligomer tanımlandığında kullanılacak en uygun oligomeric durumunu tanımlaması kristalizasyon başarısızlık riskini azaltabilir sahne. Erken bir aşamada teşhis ilişkili metal iyonları kullanımı istismar yapı çözüm kadar hız ve moleküler değiştirme yöntemleri başarısız olduğunda protein etiketli selenomethionine gereksiz üretimini önlemek.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
Şekil 1. Karbonhidrat SBPs biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için iş akışı diyagramı. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
Şekil 2. Kristal karakterizasyonu GDA içinde. (A)GDA beamline kontrol yazılımı x-ışını Floresans denetimi sekmesindeki ekran görüntüsü. (B) GDA x-ışını enerji kenar-tarama denetimi sekmesinde ekran görüntüsü. (C) GDA veri toplama kristal tarama sekmesinde ekran görüntüsü. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
Şekil 3. SP009239-491biyokimyasal karakterizasyonu. (A)3D-Yüzey grafiği pH bir fonksiyonu ve arabellek çözüm NaCl konsantrasyonu SP009239-491 erime sıcaklığı komplo. (B) sn ve MALS sonuçları için SP009239-491. Emme 280 nm mavi renkle gösterilir. Farklı Oligomerizasyonda Birleşik molar kitlelerin kırmızıyla gösterilir. Paneli (B)32değiştirildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
Şekil 4. SP009239-491yapısal karakterizasyonu. (A)ve (B) x-ışını soğurma enerji Zn ve Se kenarına SP009239-491 kristalleri için tarama. Zn ve kristalleri içeren Se ölçülen Floresans gösterilen mavi ve mavi, hesaplanan f' ve f "anormal saçılma kesirler are yeşil ve kırmızı, anılan sıraya göre. X-ışını kırınım şablon örnekleri (C) SP009239-491 kristalleri toplanan. (D) Cartoon SP009239-491 dimer yapısı gösterimi. Bir protomer renkli beyaz ve diğer macenta (artıkları 39-366) ve violet (artıkları 367-491), ve anormal saçılma atomları mavi ve mavi topları Zn ve Se, sırasıyla gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0,1 M sitrik asit pH 4.0</td>
			<td>0,1 M sitrik asit pH 4.5</td>
			<td>0,1 M fosfat pH 5,0</td>
			<td>0,1 M sitrat pH 5.5</td>
			<td>0,1 M Bis-tris pH 6</td>
			<td>0,1 M ADA pH 6,5</td>
			<td>0,1 M BEZLERİ pH 7</td>
			<td>0,1 M HEPES pH 7.5</td>
			<td>0,1 M Imidazole pH 8.0</td>
			<td>0,1 M Tris pH 8,5</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0.1 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.2 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,5 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
	

Tablo 1. Termal üst karakter tahlil için arabellek oluşturma.

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092 at JoVE.com

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

biochemical-structural-characterization-carbohydrate-transport

Research

JoVE Journal

Biochemistry

29.8K Görüntüleme.  Harwell Science & Innovation Campus. Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Video: Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Biyokimya

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains of &#945;1,4-linked glucose residues with branches introduced through the addition of &#945;1,6-linkages. Understanding how the synthesis and degradation of glycogen are regulated and how glycogen attains its characteristic branched structure requires the study of the enzymes of glycogen storage. However, the methods most commonly used to study these enzyme activities typically employ reagents or techniques that are not available to all investigators. Here, we discuss a battery of procedures that are technically simple, cost-effective, and yet still capable of providing valuable insight into the control of glycogen storage. The techniques require access to a spectrophotometer, operating in the range of 330 to 800 nm, and are described assuming that the users will employ disposable, plastic cuvettes. However, the procedures are readily scalable and can be modified for use in a microplate reader, allowing highly parallel analysis.

Techniques to measure the activity of key enzymes of glycogen metabolism are presented, using a simple spectrophotometer operating in the visible range.

Ökaryotik Glikojen Metabolizmasının İncelenmesi için Spektrofotometrik Yöntemler

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal infectivity of pathogenic species. Due to this, there is increasing interest in characterizing bacterial glycosylation and a need for high-throughput analytical tools to identify these events. Although bottom-up proteomics readily enables the generation of rich glycopeptide data, the breadth and diversity of glycans observed in prokaryotic species make the identification of bacterial glycosylation events extremely challenging.
Traditionally, the manual determination of glycan compositions within bacterial proteomic datasets made this a largely bespoke analysis restricted to field-specific experts. Recently, open searching-based approaches have emerged as a powerful alternative for the identification of unknown modifications. By analyzing the frequency of unique modifications observed on peptide sequences, open searching techniques allow the identification of common glycans attached to peptides within complex samples. This article presents a streamlined workflow for the interpretation and analysis of glycoproteomic data, demonstrating how open searching techniques can be used to identify bacterial glycopeptides without prior knowledge of the glycan compositions.
Using this approach, glycopeptides within samples can rapidly be identified to understand glycosylation differences. Using Acinetobacter baumannii as a model, these approaches enable the comparison of glycan compositions between strains and the identification of novel glycoproteins. Taken together, this work demonstrates the versatility of open database-searching techniques for the identification of bacterial glycosylation, making the characterization of these highly diverse glycoproteomes easier than ever before.

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Open searching enables the identification of glycopeptides decorated with previously unknown glycan compositions. Within this article, a streamlined approach for undertaking open searching and subsequent glycan-focused glycopeptide searches are presented for bacterial samples using Acinetobacter baumannii as a model.

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

Biyomühendislik

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Biyoloji

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous complexes formed by nucleotide sugar transporters (NSTs). These ER- and Golgi-resident multitransmembrane proteins carry the cytoplasmically synthesized nucleotide sugars across organelle membranes to supply enzymes that mediate glycosylation with their substrates. NSTs exist as dimers and/or higher oligomers. Heterologous interactions between&#160;different NSTs have also been reported. To verify whether the technique is suitable for studying the phenomenon of NST heteromerization, we tested it against a combination of the two Golgi-resident NSTs that have been previously shown to associate by several other means. The&#160;luciferase complementation assay appears to be particularly suitable for studying interactions between Golgi-resident membrane proteins, as it does not require high expression levels, which often trigger protein mislocalization and increase the risk of false positives.

The&#160;protocol presented here is intended to demonstrate the occurrence of heterologous interactions between Golgi-resident type III membrane proteins with cytoplasmically exposed N- and/or C-termini in live mammalian cells using the most recent variant of the split luciferase complementation assay.

Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over the past two decades, we have developed a yeast membrane protein expression platform that has been used to study many important fungal membrane proteins. The expression host Saccharomyces cerevisiae AD&#916;&#916; is deleted in seven major endogenous ABC transporters and it contains the transcription factor Pdr1-3 with a gain-of-function mutation that enables the constitutive overexpression of heterologous membrane protein genes stably integrated as single copies at the genomic PDR5 locus. The creation of versatile plasmid vectors and the optimization of one-step cloning strategies enables the rapid and accurate cloning, mutagenesis, and expression of heterologous ABC transporters. Here, we describe the development and use of a novel protease-cleavable mGFPHis double tag (i.e., the monomeric yeast enhanced green fluorescent protein yEGFP3 fused to a six-histidine affinity purification tag) that was designed to avoid possible interference of the tag with the protein of interest and to increase the binding efficiency of the His tag to nickel-affinity resins. The fusion of mGFPHis to the membrane protein ORF (open reading frame) enables easy quantification of the protein by inspection of polyacrylamide gels and detection of degradation products retaining the mGFPHis tag. We demonstrate how this feature facilitates detergent screening for membrane protein solubilization. A protocol for the efficient, fast, and reliable isolation of the small-scale plasma membrane preparations of the C-terminally tagged Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overexpressed in S. cerevisiae AD&#916;&#916;, is presented. This small-scale plasma membrane isolation protocol generates high-quality plasma membranes within a single working day. The plasma membrane preparations can be used to determine the enzyme activities of Cdr1 and Cdr1 mutant variants.

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

This article presents a small-scale plasma membrane isolation protocol for the characterization of Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) protein Cdr1, overexpressed in Saccharomyces cerevisiae. A protease-cleavable C-terminal mGFPHis double tag with a 16-residue linker between Cdr1 and the tag was designed to facilitate the purification and detergent-screening of Cdr1.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...