Bu çalışma onun KFTR 3D-Yapı Konsorsiyumu aracılığıyla ABD Kistik Fibrozis Vakfı (CFF) tarafından finanse edildi. TR İngiltere&#39;de BBSRC öğrencilikle tarafından İngiltere CF Güven öğrencilik ve NC tarafından finanse edildi. Biz onların yardım ve tavsiye için ve kodon-optimize edilmiş tavuk KFTR dizisi ve arıtma etiketleri tasarımı için CFF CFTR 3D yapısı konsorsiyum meslektaşlarımızı kabul.

Tamponlar 1. Hazırlanması <ol><li> Proteaz inhibitörünün 100x stok yapmak için (PI) bir kokteyl 96 mg AEBSF, 3.5 mg kimostatin, 10 mg E64, 16.5 mg löpeptin, 16.5 mg Pepstatin 348 mg PMSF, ve 20 ml DMSO içinde 4 mg bestatin çözülür. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza olun Benzamidin bir 100X stok yapmak için, 720, 20 ml ultra saf su içinde mg (GKD 2 O) ve -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik alikolar içinde çözülür mağaza Bu miktar, bir saflaştırma için yeterlidir. Tüm tampon olarak, PI ve benzamidin stokları 1:100 dilüsyonda kullanılmıştır. </li><li> &#39;MPIB&#39; (0.3 M Tris, pH 8, 0.3 M sukroz, 2 mM DTT) ve &quot;CFTR &#39;hazırlayın (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 mM DTT) 4 ° C&#39;ye tamponlar ve soğuk . Kullanmadan önce, proteaz inhibitörü kokteyli 1:100 ekleyin ve mPIB hacmine göre 1:100 benzamidin (örneğin, 350 ml mPIB bir toplam hacim içinde 3.5 ml PI ve 3.5 ml benzamidin kullanın) hücre pelletini için kullanılır. </li><li> S hazırlayınolubilization tamponlar. Lizo-fosfatidil gliserol-14 (LPG) solübilizasyon tampon maddesi (50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) gliserol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, proteaz inhibitörleri (PI) ve% 4 (a / h) LPG) ve dodesil maltozit (DDM) solübilizasyon tampon maddesi (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, proteaz inhibitörleri,% 4 (a / h) DDM). Bu kabarcıklar oluşturur gibi tampon, deterjan dağılmasına yardımcı olmak, ancak karışımın vorteks önlemek için bir sonikatör banyosuna (35 B, 40 kHz) içerisinde soniklendi edilebilir. Kullanımdan önce 4 ° C&#39;ye soğutun. </li><li> LPG saflaştırılması için CFTR saflaştırma tampon, 50 mM Tris,% 10 (v / v) gliserol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT,% 0.1 (ağ / hac) LPG-14 ve proteaz inhibitörleri olduğunu. Bu tampon 350 ml ve aynı tamponu artı 1 M imidazol, 150 ml hazırlayın. 8 Her iki tampon pH ayarlayın. </li><li> DDM saflaştırma için tampon, 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 M NaCl, 1 mM DTT,% 0.1 (ağ / hac) DDM oluşur. Bu tampon 350 ml, ve aynı tampon 150 ml ve 1 M imidazo hazırlanmasıle. 8 Her iki tampon pH ayarlayın. </li><li> LPG ihtiva eden jel nüfuz kromatografisi (GPC) tamponu sağlamak için, 50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) gliserol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT,% 0.05 (ağ / hac) LPG-14 hazırlar. DDM kullanılarak GPC 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 M NaCl, 1 mM DTT,% 0.1 (ağ / hac) DDM bir tamponu hazırlamak için. GPC kolonu üzerinde kullanılan bütün tampon ve GKD 2 O, süzüldü (0.2 mikron filtre) ve kullanılmadan önce gazı alınmış olmalıdır. </li><li> SDS-PAGE örnek tamponu (çalışma konsantrasyonunun 2): 50 mM Tris-HCl pH 7.6,% 5 (v / v) gliserol, 5 mM EDTA,% 0.02 (ağırlık / hacim) bromofenol mavisi. -20 ° C&#39;de 700 ul alikotları ve mağaza olun Kullanımdan önce,% 20 200 ul (w / v) sodyum dodesil sülfat (SDS) ve taze 0.5 M DTT, 100 ul ilave edin. Jeli üzerinde yüklemeden önce, oda sıcaklığında numune ile en az 10 dakika boyunca inkübe edin. Isı etmeyin; Bu GFP denatüre ve CFTR araya neden olabilir. </li><li> Sulandırılacak lipid stok yapmak için E: bir 4:1 (ağ / ağ) karışımı çözülür coli lipidler bird kloroform ve metanol içinde kolesterol (2:1 v / v) ve bir lipid film oluşturmak için 2 saat boyunca N2 gazı altında cam bir şişede kuru. Ml 40 mg / bir lipid konsantrasyonu (no NaCI) ile GPC tamponu ilave edin ve çözeltiyi netleştirmek için tekrar vorteks ve sonikasyon (35 B, 40 kHz) kullanın. </li><li> ATPaz testi için, GKD 2 O 1 M DMSO, NaSCN 1 mM&#39;ye SCH28080 eritilmesi ile ve 100,% 2.5 mM (v / v) etanol ile oligomycin ATPase inhibitörlerinin 100x stokları hazırlamak. -20 ° C &#39;de parçalar halinde saklayın 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NH4CI, 5 mM MgSO 4 ile% 0.02 (ağırlık / hacim) NaN3 ile ATPase tamponu 100 ml olun. Bu, oda sıcaklığında depolanır ve çeşitli deneyleri için de kullanılabilir. Kullanımı ve buz üzerinde tutmak için hemen önce, 5 mM ATP stok hazırlayın. (NB kullanımlar Na 2 ATP deneyinde fosfattan fazla arka plan sinyalini önlemek için). SDS durdurma çözeltisi (% 12 (ağ / hac) SDS içinde GKD 2 O) hazırlayın. </li><li> Chifflet tespiti için w (A (% 3 tampon hazırlamak/ V) askorbat,% 0.5 (ağ / h) amonyum molibdat, 0.5 M HCI) kullanımdan hemen önce ve tampon B&#39;ye (% 2 (w / v) sodyum sitrat,% 2 (w / v) sodyum meta-arsenit,% 2 (v / v) asetik asit). </li></ol> Mantar mikrozomları 2. Izolasyonu <ol><li> O&#39;Ryan ve diğerleri de tarif edildiği gibi ifade eden tavuk CFTR S. cerevisiae büyütülür. (2012) 14. En fazla 6 ay boyunca -80 ° C &#39;de iki kısım halinde, bir 20 L fermantasyon malzemeyi saklayın. </li><li> Hızlı bir şekilde hücre, bir kısım buzunu ve hücre gramı başına 3 ml soğuk mPIB içinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 425-600 um çapında cam boncuklar kullanılarak, bir bilyalı değirmen içinde hücreleri bozabilir. 1 dakikalık dinlenme periyotları ile ayrılan hücre bozulması beş 1 dk dönemleri kullanın. (Dinlenme süreleri hücreler kesintileri sırasında ısıtılan emin olmak için gereklidir.) </li><li> Bilyalı değirmen alınan hücre lisatı bir 1 ml numunesinin santrifüjle hücre parçalanmasından sonra izlenmesi. Bir tezgah üstü centr Santrifüj (12.000 xg, 4 ° C, 5 dakika)ifuge. Bir küvet içinde mPIB ile 1:50 seyreltin ve süpernatant A 380 ölçer. A 380&gt; 0.1, ya da birkaç tekrarlanan boncuk yenerek döngüleri rağmen artan durduysa, aşağıdaki adıma geçin. Eğer değilse, 2,3-2,4 tekrarlayın. </li><li> Toplam hücre lizatı (12,000 x santrifüj g, 4 ° C, 20 dak.) Süpernatantı saklayın. (Kırılmamış hücreler ve mitokondri içeren) pelet atın, ama hücre kırılma verimliliği konusunda herhangi bir şüphe (bkz 2.4) varsa, o zaman da pelet korumak. </li><li> Önceki basamakta (200,000 xg, 4 ° C, 1.5 saat) süpernatant santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve CFTR tamponu peletlendi mikrozomal zarları tekrar süspansiyon. Mikrozomlar DDM kullanarak arıtma için tasarlanmıştır, 1 M NaCI ile tampon CFTR tamamlar. </li><li> 100,000 x (yeniden süspansiyon haline getirilmiş membran fraksiyonunun tekrar santrifüj g, 4 ° C, 1 saat) ve süpernatant atın. </li><li> Pelet haline mikrozomlarında süspanseCFTR tamponu minimum hacmi (nihai hacim 5-15 mi, total mikrozomal protein 70-200 mg). A Bradford tahlili mikrozomal proteinlerinin 25 toplam konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak membran floresans emisyon spektrumu ölçülmelidir (uyarım = 485 nm, emisyon = 500-600 nm) ve ayrı bir GFP floresan tepe (512 nm &#39;de maksimum) sahip olmalıdır. CFTR özel GFP floresan koşullar altında taranan bir SDS-PAGE jel üzerinde (Şekil 1) üzerine tespit edilebilir. </li><li> Flaş dondurularak sıvı azot içine daldırma ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve mikrozomları -80 ° C&#39;de saklayın, ya da 3 Adım devam edin. </li></ol> Mikrozomların 3. Çözündürülmesi <ol><li> Dondurulmuş, hemen 10 ° C&#39;ye ayarlanmış bir su banyosu içinde kullanılmadan önce mikrozomları defrost </li><li> Membran çözünmesi için, bir nihai deterjan konsantrasyonu vermek üzere, ilgili solübilizasyon tampon maddesi (Aşama 1.3) eşit hacmi ile mikrozomları seyreltik% 2 (a / h) ve bir mikrozomal protein konsantrasyonu 5 mg / ml. Çalkalama ile 4 ° C&#39;de (tüp döndürücü) 1 saat boyunca bu karışımın inkübe edin. Analizi için 200 ul saklayın. </li><li> Karışım (100,000 xg, 4 ° C, 45 dakika) santrifüje. Çözündürülmüş zar proteinleri içeren süpernatantı, 0.45 um&#39;lik bir şırınga filtresinden geçirin ve buz üzerinde saklayın. (Aşama 2.8 &#39;de olduğu gibi) süpernatanın flöresan ölçülür. </li><li> % 1 çözünmeyen fraksiyonu, çözünebilir fraksiyon eşit bir hacme kadar (ağ / hac) SDS çözeltisi yeniden süspanse edin. Bu fraksiyonun bir kısmı olarak floresan ölçülür ve SDS-PAGE analizi için 50 ul bir kısım korur. </li></ol> CFTR 4. Nikel afinite saflaştırma <ol><li> Seri bağlantı, iki 5 ml nikel sefaroz sütunlar. Daha sonra 1 M imidazol içeren, (1,4-1,5 Aşama) çözündürme tamponu 2 CV ile sütun yıkama, GKD 2 O 2 CV ardından (v / v) etanol, 2 kolon hacmi (CV) ile% 20 yıkayın. Solubilizat 2 CV ile tekrarlayıniyon imidazol eksik tampon. </li><li> Çözelti halindeki materyale (Basamak 2.8) ile 5 mM arasında nihai bir konsantrasyona kadar imidazol ilave edin ve otomatik bir sıvı kromatografi cihazı kullanılarak elle kolona veya bir örnek döngüye malzemeyi yüklemek. </li><li> 0.5 ml / dk &#39;lık bir akış hızında kolona çözündürülmüş malzeme yük, ve bağlanmamış malzemenin bertaraf edilmesi için aynı akış hızında imidazol-eksik tamponu 2 CV ile yıkayın. 50 ml Falcon tüpleri içinde fraksiyonlar toplayın. </li><li> İlk yıkama için, 1 ml / dk &#39;lık bir akış oranında, 40 mM imidazol ile arıtma tamponunun 3 CV kullanın. 2 ml fraksiyonlar toplayın. </li><li> İkinci yıkama, 100 mM imidazol ile arıtma tamponunun 3 CV kullanın. 2 ml fraksiyonlar toplayın. </li><li> 400 mM imidazol ile arıtma tampon 3 CV ile HisTrap kolondan Elute CFTR. 2 ml fraksiyonlar toplayın. </li><li> Yıkanmış fraksiyonlar (2.8 Aşama) içinde floresan izleyin. </li><li> SDS-PAGE analizi için pik fraksiyonların alikotları saklayın. Flaş dondurma kalan zirve fraction örnekler ve mağaza -80 ° C &#39;de, ya da bir sonraki saflaştırma aşaması için devam edin. </li></ol> CFTR 5. Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) saflaştırılması <ol><li> 1.2 CV GPC tamponu ile ve ardından 1.2 CV GKD 2 O sütunu (Superpose 6 10/300 GL) dengelenmesi. </li><li> Aşama 5.1 sırasında, 4 ° C &#39;de, bir santrifüj 100,000 bir MWCO filtre kullanılarak, en yüksek GFP floresan olan Ni-afinite ile saflaştırılmış fraksiyonları konsantre DDM içinde temizleme, bu önemli bir örnek kaybına neden olacak şekilde 0.3 mg / ml protein, protein konsantrasyonu Yukarıdaki örnekte konsantre kaçının. 100,000 x de konsantratör ve santrifüjden bakiyenin kaldırma büyük parçacıklar pelet 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca g. </li><li> Kolon üzerine enjekte edilir ve bu örnek 1,2 CV GPC tamponu izokratik gradyanı ile elüte. 0.5 ml fraksiyonları toplayın. </li><li> CFTR ihtiva eden kesirler belirlemek için bölüm 2.8 olarak GFP floresan ölçün. Küçük bir hacim korumak (örneğin &lt;/ Em&gt; SDS-PAGE ile analiz için her biri 50 ul). </li><li> -80 ° C&#39;de, sıvı azot ve mağaza fraksiyonlar Freeze </li></ol> CFTR 6. Sulandırma <ol><li> Lipid-to-protein oranı 100:1 (a / a) de saflaştırılmış CFTR için lipitleri (Basamak 1.8) ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Benzer şekilde GPC tamponu aynı hacmi ile saflaştırılmış protein ile ikame, bir lipid tek kontrolünü ayarlayın. </li><li> Hidrofobik yüzerme boncuklar kullanılarak protein / yağ karışımından deterjan çıkarın. 5 CV GKD 2 O, 5 CV% 70 (v / v) etanol, 5 CV GKD 2 O ve deterjan eksik 5 CV GPC tamponu içinde adsorbent boncuk yıkayın. Saflaştırılmış proteinin ml başına yıkandı emen tanelerin 200 mg eklenir ve yavaşça çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ince uçlu bir pipet kullanarak yeni bir tüp içine emen boncuklardan yeniden oluşturma örnek toplamak. </li></ol> ATPaz aktivitesi 7. Ölçümü <ol><li> CFT oranını belirlemek96 oyuklu bir plaka biçiminde bir tadil edilmiş Chifflet 26,27 tahlili kullanılarak R-özgü ATPaz aktivitesi. Sodyum fosfat stok çözeltisi ile (0.65 mM) standartları olarak 50 ul nihai hacim içinde 0-20 nmol fosfat hazırlar. Fosfat stok seyreltilmesi CFTR tampon ve tampon ATPaz bir 1:1 karışımı kullanın. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde 1:100 (v / v) ATPase inhibitörleri (Basamak 1.9) ile yeniden CFTR ve boş hem de lipozomlar inkübe edin. Yeniden CFTR en az 5 ug kullanın. </li><li> 2 mM&#39;lik nihai konsantrasyona ATP (Basamak 1.9) ilave edilir ve 1 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. (Standartlar dahil olmak üzere) her bir (ağırlık / hacim) SDS (1.9 Aşama)% 10, 40 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun. </li><li> Tampon A içinde 100 ul (1,10 Aşama) ve 10 dakika boyunca inkübe edilir. Her bir oyuğa 100 ul tampon B (1.10) ilave edin ve 96 oyuklu bir plaka uyumlu bir UV / Vis spektrofotometresinde 800 nm&#39;lik bir dalgaboyunda absorbans ölçümü. </li><li> Kullanarak serbest fosfat miktarında içine 800 nm&#39;de absorbans dönüştürmefosfat standartları. Arka plan sinyalinin (lipozom sadece kuyu) çıkarıldıktan sonra, ATP hidroliz hızını hesaplar. </li><li> Non-yeniden CFTR için plan okumaları için CFTR tampon kullanarak aynı protokolü izleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+(ABCC7)+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel.">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li><li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK:+1947-2003.">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li><li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li><li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration.">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li><li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung.">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li><li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology:+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates.">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li><li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line.">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li><li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+of+MRP1+(ABCC1)+and+related+ATP-dependent+drug+transporters.">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li><li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li><li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis.">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li><li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter.">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li><li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter.">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li><li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate/tungstate+ABC+transporter.">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li><li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA:+Alternating+access+with+a+twist.">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li><li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter:+structure+and+allosteric+regulation.">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li><li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding.">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li><li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids.">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+functional+characterization,+and+NMR+studies+of+human+KCNE1,+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome.">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein:+Application+to+lens+ATPases.">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li><li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence.">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını ne de bu işe ilişkin diğer çelişkili çıkarları var.

Daha önce sıçangil CFTR 14&#39;ün aşırı ifadesi için bir yöntem tarif eder. Bu protokol yayınlanmasından bu yana, aynı sistemi kullanarak CFTR birkaç farklı ortologlarını ifade ve saflaştırılmış var. DDM arıtma farklı ortologlar karşısında daha fazla varyasyon (veriler gösterilmemiştir) gösterdi iken, test edilen tüm ortologlar kadar, LPG deterjan iyi arıtılmış. Bu esneklik, maya yaklaşımın gücünü gösterir: belirli bir amaç için bir seçmek için göreli bir hızla çok yapıları taranması mümkündür. 1 M NaCl önce temiz bir mikrozom preparatında DDM sonuçlar, çözünürleştirme ve daha sonraki aşamada kirletici azaltır ihtiva eden tampon ile maya mikrozomları yıkama. Nihai CFTR örnek mikrozom yıkaması olmaksızın&gt;% 90 saf olduğu için bu adım, LPG protokolünde gereksizdir. Ayrıca, DDM saflaştırma çözündürme a için tamponlar için çeşitli değişiklikler gerektirirnd saflaştırılması, gliserol ve ilave tuzu yani eklenmesi. Hep birlikte, bu ilave önemli kolona DDM-çözündürülmüş proteinin bağlanma artmıştır. DDM saflaştırma metodolojisi iyileştirilmesi için, özellikle de kütle spektrometresi ile karar, bir 40 kDa ana kirleticinin kaldırılması, nikel reçinesi için doğal bir afiniteye sahip görünen maya ribozomal alt birimine L3, kaynaklanmaktadır bir kapsama sahiptir. Orada L3 protein içinde belirgin bir polyHis sekansıdır, ancak ribozom bağlandığmda da 3 boyutlu yapısının incelenmesi (PDB = 1FFK) katlanmış alt birim L3 potansiyel polyHis küme sahip olduğunu göstermektedir. Bu bant LPG-saflaştırılmış malzeme daha az sorunlu olduğu sert LPG deterjan nedeniyle olabilir. DDM yılında arıtma LPG daha fakir gibi görünüyor olsa da, bu tür DDM gibi hafif deterjanlar fonksiyonel ve yapısal analizler ile daha uyumlu olabilir ve zaten birkaç X-ışını crystall kullanılmıştırMembran proteinlerinin 15-21 arasında ographic çalışmaları. Ayrıca, sonuçlar LPG kullanımı DDM in saflaştırmaya CFTR nispetle ATPase fonksiyon kaybına yol açtığını göstermiştir. Bu nedenle bu tür post-translasyonel modifikasyonlar karakterizasyonunda gibi uygulamalarda örneğin, ya da antikorların üretilmesine de, LPG tabanlı bir protokol seçilecektir, saflık önemlidir CFTR üretilmesi için LPG-bazlı saflaştırma protokolü tavsiye . Proteinin aktivitesi, ve tam olarak yerel durum gerekli olduğu uygulamalarda Öte yandan, daha iyi bir seçenek olarak DDM tabanlı bir protokol önerecek olacaktır. Sonuç olarak, bu protokol zitteriyonik deterjan LPG-14 ya da non-iyonik deterjan DDM CFTR izolasyonu için tekrarlanabilir bir yöntem tarif eder. Gibi daha önce 10-13 bildirilmiştir daha CFTR için arıtma koşullarının daha geniş bir yelpazede gösterir. Ilave miligram arıtılmış CFTR miktarları olabilirBöyle bir 20 L&#39;lik fermente edici ve bir 6 L düşük hızlı santrifüj rotoru olarak yüksek kapasiteli bir hücre toplama sistemi olarak, bir yüksek hacimli maya büyüme sistemi ile bir araya getirildiğinde, bu prosedürler kullanılarak elde edilmiştir. Elde edilen CFTR çeşitli biyokimyasal ve biyofiziksel tahlillerinde protein kolayca izlenmesini sağlayan bir bölünebilir GFP etiketi vardır. Bu makalede (tavuk CFTR ihtiva eden plasmid veya dondurulmuş maya hücreleri) de tarif edilen reaktif Kistik Fibroz Vakfı (USA) ile elde edilebilir.

Kistik fibrozis (CF) 2,500 canlı doğumda yaklaşık 1 insidansı ile Avrupa ve Kuzey Amerika&#39;da en sık görülen genetik bir hastalıktır. CF oluştuğunda, kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü (CFTR) epitel hücrelerinin 1 plazma membranında işlevi protein kaybı nedeni mutasyonlar. Bu kusurun en ciddi sonucudur yaşı 2,3 &lt;40 yıl hastalarının ömrü kısaltır dönüşümsüz akciğer hasarı vardır. CFTR bir iyon kanal 1,4 haline dönüşmüştür bir ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcı olduğunu. Hücrelerin plazma membranında onun oldukça değişmiş fonksiyonu olmasına rağmen, yine de, diğer ABC taşıyıcıları ile anlamlı bir sekans benzerliği korur. İlgi çekici, CFTR (yani düzenleyici bölge ve N-ve C-termini) &#39;nin özel bir parça, diğer metazoan ABC taşıyıcıları ile anlamlı bir sekans benzerliği paylaşan, dolayısıyla inci hiçbir ipucu vardırCFTR bu dizilerin e kökeni. Birincil yapısının temelinde, CFTR ABC transportör ailesinin bir C-aile üyesi olarak sınıflandırılır, ancak bu alt-aile için artık fonksiyonel bir bağlantı için güçlü bir kanıt yoktur. Diğer raporlar azalmış glutatyon ziyade gösteren daha, CFTR ATPaz aktivitesini inhibe olabileceğini düşündürmektedir rağmen, diğer C-aile üyelerinin 8,9 rolleri ile tutarlı olurdu, CFTR 5-7 için glutatyon taşımacılık faaliyetlerinin bazı raporlar olmuştur ABC nakliyecilere 10 karakterize tabaka kaynaklı uyarım. Iyon iletkenliği ölçümü bir CFTR moleküllerin kanal aktivitesi 1 incelenecek kanal özellikleri ve CFTR zamanın bir fonksiyonu, sıcaklık, ATP konsantrasyonu, membran potansiyeli ve fosforilasyon durumu yanı sıra olarak takip edilmiştir izin vermek için yeterince hassastır , küçük molekül inhibitörleri, kuvvetlendirici ve modifiye bir ana varlığı. Bunlarçalışmalar da ABC taşıyıcıları nasıl işlediğini bizim bilgilerimize önemli ekledik. Bununla birlikte, önemli miktarda ve daha sonra saflaştırma CFTR ekspresyonu özellikle zor ve başarı birkaç 10-13 laboratuarlar ile sınırlı olmuştur olduğu kanıtlanmıştır. Daha etkili ilaçların geliştirilmesi için ihtiyaç presleme, henüz bu işlem küçük moleküllerin taranması için arıtılmış, CFTR eksikliği tarafından engellenmiştir. CFTR ifade ve arıtma sorununun çözülmesi CF birincil kusur düzeltme amaçlı yüksek verimli ilaç tarama sağlayacak ve aynı zamanda rasyonel ilaç tasarımı konusunda yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar için bir yol açacaktır. Ayrıca, bu tür fonksiyonel oligomerik durum olarak protein, etkileşen protein ve ATPaz aktivitesi bile nispeten temel biyokimyasal özellikleri zayıf bir şekilde karakterize kalır. Daha önce GFP-ve His-etiketli murin CFTR büyük ölçekli ifadesi için bir protokol bildirmiştirS. cerevisiae 14 ve şimdi daha CFTR saflaştırılması için protokolleri açıklanmıştır. Biz örnek olarak tavuk CFTR saflaştırılması için beş CFTR orthologues ve mevcut veri arındırmak için bu yöntemleri kullandık. Çözünme ve arıtma için deterjan seçimi herhangi bir zar proteininin arıtılmasında önemli bir adımdır. Birkaç deterjan CFTR çözünürlüğüne için taranmıştır, biz saflaştırılmasında kullanılmak için iki zıt deterjanlar seçtik. Dodesil-β-D-maltozit (DDM) yaygın zar proteinlerinin 15-21 hem yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir iyonik olmayan deterjandır. Iyonik deterjan 1-tetradekanoil-sn-glisero-3-fosfo-(1&#39;-rac-gliserol) (LPG-14), CFTR çözünme son derece etkili olduğunu ve daha önce fonksiyonel membran proteinlerinin 10&#39;un saflaştırılması kullanılmıştır S arasından CFTR saflaştırılması dahil olmak üzere, 22,23, cerevisiae 24. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:492px;" width="491">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;M syringe filter&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sartorius</td>
			<td style="width:161px;">FC121</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane)</td>
			<td style="width:115px;">Vivaspin</td>
			<td style="width:161px;">VS0641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">72.695</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40Ti rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;"><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Sterile Falcon Tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">62.547.254</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A26209&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid chromatography system</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28-4062-64</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A8456</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bead-beating cell disrupter</td>
			<td style="width:115px;">BioSpec</td>
			<td style="width:161px;">1107900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">HERMLE</td>
			<td style="width:161px;">Z300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5417R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop microfuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">13-100-511</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzamidine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">434760</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">114391</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">357000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">170-808</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chymostatin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C7268</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">43815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">E.coli total lipid extract</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">100500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">E3132</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass beads, acid washed</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8772</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">65017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap HP columns (5 ml)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5247-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapid Coomassie Stain</td>
			<td style="width:115px;">Novexin</td>
			<td style="width:161px;">ISB1L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge JA-17 rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">369691</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:115px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">108975</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG)</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">858120</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO4</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel tank SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">165-8006</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">n-dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:115px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:161px;">D310S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S6191</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NaN3</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9434</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">75351</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">392050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prestained protein standards</td>
			<td style="width:115px;">Fermentas</td>
			<td style="width:161px;">SM1811</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Desalting columns (Sephadex G-25)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-0851-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin A</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P4265</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P7626</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sch28080</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S4443</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">L37771</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium thiocyanate (NaSCN)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">251410&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel filtration 10/300 GL column</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5172-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-base</td>
			<td style="width:115px;">Formedium</td>
			<td style="width:161px;">TRIS01</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">355618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:115px;">Star Labs</td>
			<td style="width:161px;">N2400-0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:115px;">Ultrawave</td>
			<td>F0002202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode plate reader</td>
			<td style="width:115px;">BioTek</td>
			<td style="width:161px;">BTH1MF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein expressed in saccharomyces cerevisiae

Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) kusurlar protein kistik fibrozis (CF), şu anda yaş &lt;40 yıl hastalarının ortalama yaşam beklentisi sınırlar otozomal resesif hastalığa neden. CFTR aktivitesini geri yeni ilaç moleküllerinin geliştirilmesi tedavi CF önemli bir hedeftir, ve işlevsel aktif CFTR izolasyon bu hedefe ulaşmada yararlı bir adımdır. Bir ökariyotik heterolog ifade sisteminde, S&#39;den CFTR saflaştırılması için iki yöntem tarif cerevisiae. Prokaryotik sistemleri gibi, G. cerevisiae hızla düşük maliyetle laboratuvarda yetiştirilen olabilir, ama aynı zamanda trafik ve posttranslationally büyük membran proteinleri değiştirebilirsiniz. Çözünme ve arıtma için deterjan seçimi herhangi bir zar proteininin arıtılmasında önemli bir adımdır. Birkaç deterjan CFTR çözünürlüğüne için taranmıştır sonra, iki eş seçtikNihai CFTR preparat, daha sonra planlanan deneyler için uygun hale getirilmesine olanak saflaştırılmasında kullanılmak için deterjanlar ntrasting. Bu yöntemde, biz dodesil-β-D-maltoside CFTR saflaştırma (DDM) ve karşılaştırma sağlamak 1-tetradekanoil-sn-glisero-3-fosfo-(1&#39;-rac-gliserol) (LPG-14). Bu yöntem ile DDM saflaştınlabilir Protein fonksiyonel deneylerde ATPaz aktivitesi gösterir. LPG-14 arıtılmış, Protein verim ve yüksek saflıkta, post-translasyonel modifikasyonlar incelemek için kullanılabilir gösterir ve bu, küçük açı X-ışını dağılımı ve elektron mikroskopisi gibi yapısal yöntemleri için kullanılabilir. Bununla birlikte, daha düşük ATPaz aktivitesi gösterir.

Yukarıda tarif edilen protokol ham mikrozomal hücre kopması ve hazırlık (Şekil 1) CFTR hemen hemen tamamen geri kazanımı ile CFTR bakımından zenginleştirilmiş mikrozomlarının izole etmek için etkili bir araçtır. Diğer hücre kopması yöntemler de etkili bir şekilde kullanılabilir. Biz eşit verimlilik ile bir Fransız basınç hücresi ve diğer high-pressure/cavitation cihazlar (aynı zamanda bir yakut hedefe karşı etkileyen ile birlikte) kullanmıştır. Kolaylık ve ekipman düşük başlangıç ​​maliyeti, biz boncuk dayak yöntemini iyi bulmak. CFTR çözündürülmesi ve saflaştırılması için LPG kullanılarak&gt;% 90 saflık ile (Şekil 2), 80 ug protein / L kültür vermiştir. Yüksek verim nedeniyle LPG (Şekil 2b, kuşak 2 ve 4 ile karşılaştırınız) ile CFTR etkili çözündürülmesi amaçlanmıştır. Buna ek olarak, etkili ve kolona sıkı bağlanma minimal bağlanmamış fraksiyon CFTR kaybı ve yıkama fraksiyonları CFTR yokluğunda (Şekil 2, bölmeler 3, 5 sonuçlandı ve6). Elüt edilen protein, Coomassie-lekelenmiş SDS-PAGE jelleri tarafından tahmin edilir ve CFTR ve kirletici bantların densitometrisi kullanılarak,&gt;% 90 bir saflığa sahip olmuştur. Jel geçirgenlik kromatografisi (GPC), düşük molekül ağırlıklı kirletici maddeler LPG ile saflaştırılmış CFTR (Şekil 4, alt panel) ayrıldı. DDM kullanarak CFTR arıtma için protokol, yaklaşık% 60 ve yaklaşık 50 ug / L verimle (Şekil 3) saflık verir. Yaklaşık 10 ml (Şekil 4) en elüsyon GPC olumsuz lekeli fraksiyonlarının elektron mikroskopisi (EM) DDM-arıtıldı CFTR 20-30 nm çaplı agrega hem de 10 nm çapında (veriler gösterilmemiştir) daha küçük parçacıklar içerdiğini göstermiştir. Bu küçük agregalar tersine çevrilerek EM-tespit birikimlerin çıkması için başarısız ilişkilendirmek ve bir 1 MDa kesme filtresi ile ultrafiltrasyon ayırmak için mümkündür. LPG ile saflaştırılmış malzeme dolayısıyla boyanmamış fraksiyonların Krio-EM ile incelenmiştir, bir parıltı deşarjı kılavuza adsorbe değildi. Bu gösterdinispeten küçük, çok homojen bir partikül popülasyonu (6-8 nm çap, veriler gösterilmemiştir). Son olarak, saflaştırılmış proteinlerin ATPaz aktivitesi (Şekil 5) ölçülmüştür. ABC protein ailesinin bir üyesi olarak, CFTR ATP bağlanması ve / veya hidrolize edebilen iki nükleotid-bağlayıcı etki (NBDs) sahiptir. Veriler, saflaştırılmış protein, LPG-çözündürülmüş halde ATP hidrolize etmek mümkün değildi ve DDM mevcudiyetinde (Şekil 5, dolgusuz bar) zayıf ATPase aktivitesi göstermiştir göstermektedir. Lipidler ve deterjan kaldırma ilave edildikten sonra ATPaz aktivitesi DDM (13 nmol ATP / dakika / mg protein) saflaştınlabilir edilmiş numuneler için 4 kat daha yüksekti. Lipidler ve LPG kullanılarak izole edilmiştir CFTR LPG için benzer şekilde geri aktivitesi çıkarılması, ancak ek DDM-saflaştırılmış ve yeniden malzemeden daha düşük bir oranda bir son (1.5 nmol ATP / dakika / mg protein). <img alt="Şekil 1"FO: İçerik-width = &quot;5in:&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1. Hücre lizatı tavuk CFTR (CL) izlenmesi düzeyi, yüzer (S) ve mikrozom izolasyon ve yıkama için kullanılan çeşitli santrifüj adımları sırasında peletleri (P). SDS-PAGE jelleri, GFP-jel floresan kullanılarak görselleştirilmiştir tag. 14,000 xg hücre kopması ve santrifüjlemeden sonra süpernatan (bozunma ürünleri de dahil olmak üzere) hemen hemen tüm CFTR içerir. Tüm tam uzunluklu CFTR yüzer bazı parçalarını bırakarak 200,000 xg sediment ultrasantrifugasyon. Tuz-yıkanmış mikrozomlar pelet bazı ilave parçalarının kaldırılması ile neredeyse tüm CFTR 100.000 xg&#39;de Ultrasantrifügasyon. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> Hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi ile LPG tavuk CFTR Şekil 2.. Saflaştırılması. Fraksiyonlar Coomassie lekelemesi (üst panel) ve GFP etiketi (alt panel) flüoresanla tespiti ile takip edilen SDS-PAGE ile analiz edildi. Tracks: (1) Mikrozomlar. (2) LPG-çözünür mikrozomlar. (3) bağlı olmayan bir malzeme. (4) Çözünmeyen materyal. (5) ve (6) 40 ve 100 mM imidazol yıkama. (7) malzeme 400 mM imidazol ile elüt edilmiştir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> Hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi ile DDM tavuk CFTR Şekil 3.. Saflaştırılması. Fraksiyonlar Coomassie lekelemesi ile SDS-PAGE ile analiz edildi. Sol taraftaki panel elüsyondan önce kesirler gösterir. Birkaç ardışık yıkama fraksiyonlar CFTR ile sağ panelinde gösterilirok ile endikedir. Daha sonra parçacıklar ribozomal protein L3 olarak kütle spektrometresi ile tespit edilmiş olan bir 40 kDa kirletici içinde zenginleştirilmiştir. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> Jel geçirim kromatografisiyle tavuk CFTR Şekil 4,. Saflaştırma Ni afiniteli kromatografi ile saflaştırılmıştır. CFTR konsantre edildi ve bir GPC sütununa uygulanmıştır. CFTR (üst panel) için bir elusyon profili LPG-14 (katı hat) ya da DDM (kesik çizgi) üst üste ihtiva eden tampon içinde saflandırıldı. SDS-PAGE (alt panel) CFTR 8 ve 11 ml arasında elüt olduğunu ortaya koydu. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> Şekil 5. ATPaz faaliyeteDDM veya LPG saflaştınlabilir y arıtıldı tavuk CFTR fraksiyonların. Protein F-, P-ve V tipi ATPaz (dolgusuz bar herhangi bir arka plan ATPaz aktivitesini ortadan kaldırmak için ATPase inhibitörleri kokteylinin mevcudiyetinde bir tadil edilmiş 26 Chifflet tahlili kullanılarak tahlil edilmiştir .) ATP hidrolizinin oranı, aynı zamanda deterjan ilave kaldırma ve lipid (dolu çubuklar) sonra ölçülmüştür. Arsa ortalama ve standart sapma gösterir (n = 3). Ortalama varlığı ve lipidin yokluğunda ATPase aktivitesi için değerleri ve DDM ve LPG olarak aktivitesi arasındaki fark arasındaki farklar p &lt;0.05 için önemlidir.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterolog ifade ve kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) saflaştırılması önemli sorunlar ve kistik fibrozis için ilaç tedavilerinin gelişiminde sınırlayıcı faktörler. Bu protokol, yapısal ve işlevsel çalışmalar için uygun CFTR miligram miktarları izolasyonu için iki yöntem açıklanır.

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance-regulator

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

14.4K Görüntüleme.  University of Manchester.  Heterolog ifade ve kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) saflaştırılması önemli sorunlar ve kistik fibrozis için ilaç tedavilerinin gelişiminde sınırlayıcı faktörler. Bu protokol, yapısal ve işlevsel çalışmalar için uygun CFTR miligram miktarları izolasyonu için iki yöntem açıklanır. 

Video: Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR kofaktörleridir Redox Titrasyonu İzlenen<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...