Bu çalışmada Hollanda Kanser Derneği (KWF; fon tarafından mümkün yapıldı EMCR 2012-5473) ve dünya kanser araştırma fonları International (WCRF; Proje No 2014-1181)

Tüm yordamları yerel hayvan refah kanun ve kurallara göre yapıldı.
1. hazırlanması aletleri, kültür medya ve yemekleri
<ol><li>Otoklav 1 dizi bağırsak makas, normal makas ve forseps steril bir kap içinde.</li>
	<li>Bir kuluçka 37 ° C'de bir 96-iyi (düz dipli) tabak yerleştirin</li>
	<li>10 mL tam kültür ortamının malzemeleri tabloda listelenen reaktifleri ile hazır olun.</li>
	<li>Bir su banyosu içinde 37 ° C'de tam orta kuluçkaya.</li>
	<li>Tezcan bir buz kovası yerleştirerek membran Claudia adıyla yeniden düzenlendi. Sulandırılan membran 4 ° C'de sıvı hale gelir.</li>
	<li>4 Petri yemekler soğuk fosfat tamponlu tuz veya kısaltılmış PBS (4 ° C) doldurun.</li>
</ol>2. izolasyon küçük bağırsak kriptalarının
<ol><li>CO2 inhalasyon tarafından Lgr5- eGFP-DDE'ler-CreERt2 fare C57BL6/J arka plan üzerinde kurban. Karın zarını boyuna makas çifti ile incelemek.</li>
	<li>Mide Forseps ile tutun ve transversally ikiye kesilmiş.</li>
	<li>Şu andan itibaren bağırsak makas kullanırken, bağırsak çekin ve PBS içeren bir kabında yerleştirin. Not: Bağırsak makas keskin bir ve künt bir ipucu var. Bu makas künt ucu crypt-villus mimari bağırsak açılırken zarar vermemesi gerekiyordu.</li>
	<li>Künt ipucu mide yerleştirerek başlayın ve yavaşça mide itin. Makas ile kesme ve Forseps ile çekerek devam edin.</li>
	<li>Bir kez tüm ince bağırsak boyuna açıldı, soğuk PBS Forseps ile tutarak yıkayın ve yavaşça U şeklindeki hareketleri ile PBS çözümde durulayın.</li>
	<li>Bir kez tüm dışkı artıkları temizlenir, bağırsak luminal tarafı yukarı bir kesme tahtası üzerinde dümdüz devam edin. Kan damarları yokluğu ve dış kısmı ile karşılaştırıldığında soluk görünümü tarafından kolayca tanınabilir luminal takımıdır.</li>
	<li>Bir cam slayt ile düzleştirilmiş bağırsak kazıma villus yavaşça çıkarın. İki kez dokunun tüm uzunluğu boyunca bu adımı gerçekleştirin.</li>
	<li>Bağırsağın bir steril cerrahi bıçak ile 2-5 mm parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Küçük bağırsak parçaları buz soğuk PBS 10 mL içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin.</li>
	<li>Onları yukarı ve aşağı içinde PBS pipetting tarafından kalan herhangi bir yabancı maddelerin kaldırılması doku parçaları, temiz. Süpernatant atın ve PBS tamamen temizlenene kadar bu adımı yineleyin.</li>
	<li>15 mL soğuk PBS PBS son hacmi 25 mL getirmek için ekleyin. 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) eklemek ve bir silindir 4 ° C'de 45 dk için kuluçkaya</li>
	<li>PBS/EDTA atmak.</li>
	<li>PBS 10 mL ekleyin ve doku parçaları yukarı ve aşağı (en az üç kez) pipetting sert tarafından kriptalarının ayır. Süpernatant toplamak.</li>
	<li>Adımı yineleyin 2,13 dört kez. Kültür son hacmi 50 mL ulaşmak için orta ekleyin.</li>
	<li>Santrifüjü (5 min için 300 x g) tarafından hücreleri cips.</li>
	<li>Pelet 10 mL kültür orta resuspend ve aralıklarla (3 dk 80 x g) tarafından kriptalarının cips.</li>
</ol>3. tek hücre hazırlık
<ol><li>Süpernatant pelleted kriptalarının atın ve onları 1 mL tripsin benzeri-enzimler ile birlikte 50 µL resuspend Dnaz (50 µg/mL).</li>
	<li>Bir su banyosu için 2 dk 32 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.</li>
	<li>Kültür orta 10 mL ekleyin. Kriptalarının sert yukarı ve aşağı en az 5 kez pipetting tarafından tek hücrelere ayırmak.</li>
	<li>Çözüm (kümeleri ve diğer yabancı maddelerin ortadan kaldırmak için) 40 µm süzgeç aracılığıyla filtre ve 300 x g 5 min için de tek hücre.</li>
</ol>4. Akış Sitometresi ve kaplama
<ol><li>50 mL 1 x Hank tamponlu tuz solüsyonu veya HBSS/2% fetal inek serum (FCS) çözüm hazırlamak ve Pelet her 106 hücreler için 1 ml resuspend</li>
	<li>Hücre süspansiyon BV421 Lin- (CD31, CD45, TER119), 1: 100 ve CD24 APC ve CD117-PE her iki konsantrasyon için 30 dk 1:250 antikorların bir konsantrasyon, ekleyin.</li>
	<li>Sıralama Lgr5+ kök hücre ve ayrı düşük Paneth hücreleri bağlamak tüpler. İletişim kuralları için sıralama hakkında ayrıntılı bilgi için Lgr5+ ve Paneth hücreleri, lütfen bakın Roth vd. 7 ve Schewe vd. 6<ol>
<li>300 x g 5 dakika süreyle de sıralanmış hücreleri 1.3 olduğu gibi açıklanan bileşenleri ile 100 µL orta hücrelerde Resuspend santrifüj ( Tablo reçetesigörmek).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paneth hücreleri (örneğin, kimyasal ve genetik modifikasyonu ile) tedavi (n = 2000) veya Lgr5+ kök hücre (n = 2000).<ol>
<li>Hücreleri tedavi için toplam hacmi 100 µL kültür orta ve küçük müdahale RNA (siRNA) 100 bir konsantrasyon, lipozom aracılı transfection reaktif 5 µL kullanın nM. 37 ° C'de siRNA için veya seçilen değiştirilmesi için gerekli süre 30 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>500 µL kültür orta iki kez hücrelerde yıkayın.</li>
	<li>300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve 10 µL kültür orta hücrelerde resuspend.</li>
	<li>İki hücresel bileşenleri havuz (Paneth veya Lgr5+ hücreleri) 20 µl Toplam hacim ve RT., 5 min için 300 x g, santrifüj</li>
	<li>Paneth co kuluçkaya ve RT., 10 dk Lgr5+ hücreleri</li>
	<li>10 µL süpernatant, kaldırmak ve bir Menisküs sıvı emin olmak için hücre Pelet Aspire edin değil bırakın.</li>
	<li>Toplam hacmi 40 µL için hücreleri Sulandırılan membran 30 µL eklemek, hücreleri resuspend ve Önceden ısıtılmış bir 96 iyi tabak içinde plakası. 10 dakika sonra tam orta 200 µL ekleyin ( Tablo reçetesigörmek). Değişim orta her 48 h.</li>
	<li>Organoid çeşitlilik gün 5 say.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

Hiçbir rakip finansal faiz veya diğer çatışmaları yazarlar var

ORA iki temel bileşenleri bağırsak kök hücre niş, yani Lgr5+ ve Paneth hücreleri rafine fonksiyonel analiz sağlar. Bu yaklaşım daha önce bize ve diğerleri tarafından hafif değişiklikler6,10,11ile istihdam edilmiştir. Burada, ORA yordamı bir tekrarlanabilir ve standart laboratuvar iletişim kuralı olarak mevcut. Ayrıca, biz Lgr5+ kök hücre, Apc downregülasyon ...

Bağırsak epitel memeli vücuttaki en hızlı kendini yenileyerek doku ve, bu nedenle, nesne kimliği ve Türbenin alt kısmında bulunan yetişkin kök hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu yönelik çalışmalar bir bolluk olmuştur Lieberkühn, ifade Lgr5 gen tarafından ayrılmış ve kurallı Wnt sinyal1bağımlı. Özellikle Lgr5+ kök hücre çevrili ve özel niş hücreleri, Yani da kendi olgunlaşma2için Wnt sinyal üzerinde bağlıdır Paneth hücreleri tarafından desteklenen. Birlikte, bu iki hücre tipleri öz-yenileme bağırsak epitel astar altında yatan ve günlük homeostatik denge korumak: Lgr5+ kök hücre hızla Böl ve yaratıcı için ortaya çıkmasına ve daha fazla bağırsak İhtisas epitel hücreleri; Paneth hücreleri sağlamak temel niş faktörler (örneğin, Dll1, Wnt3, EGF) için Lgr5+ kök hücreleri2. Kapasite organize ve kendini yenileyerek yapıları oluşturmak için kaplama ex vivo organoids veya "mini-cesaret", çağrıldığında bağırsak kriptalarının kendini yenileme gibi süreçleri içgörü sağlamak için deneysel bir araç olarak kullanan ve farklılaşma kanser4de dahil olmak üzere normal ve patolojik koşullarda. Organoid kültürlerden gelen çeşitli dokular, bağırsak, pankreas, karaciğer ve böbrek, fare ve insan örnekleri4de dahil olmak üzere kurulmuştur. Çıkarma yöntemi ve bu organoid kültürler geliştirmek için istihdam büyüme faktörleri doku özgü ve çoklu soy farklılaşma sürücü ve mümkün olduğunca özgün kök hücre niş taklit etmek için tasarlanmış içinde vivo. Organoids genetik hastalıklar tedavi, kanser tedavi edici etkinliği, ilaç toksisitesi analizi veya organogenesis vitro5çalışmanın değerlendirilmesi de dahil olmak üzere potansiyel uygulamalar olabilir.
Genel olarak, doku örnekleri kuruldu organoid kültürlerin ana sınırlama hücre-özgüllük olmaması. Örneğin, tüm bağırsak kriptalarının kurulan bağırsak organoids içinde doku kaynağı kapsıyordu hücresel bileşenleri tek tek analiz izin verme (örneğin, tüm kriptalarının içeren Lgr5+, Paneth, ve progenitör hücre).
Burada, ORA anılacaktır ve bağırsak organoid kültürler avantajlarını en temel bileşenleri, yani kök (Lgr5+) ve niş (Paneth) hücrelerin fonksiyonel analiz ile birleştiren yeni bir yöntem, açıklayın. Bu Paneth benzersiz yeteneği elde edilir ve fiziksel olarak ortak inkübe ve organoids2,6,10' a ortaya çıkmasına birbirleri ile ilişkilendirmek için Lgr5+ hücreleri. Biz bu özelliğin avantajlarından aldı ve iki hücre türleri tek tek izin vermeden önce onları organoids reconstitute önceden tedavi. Bunu yaparken, her hücre bileşeni herhangi bir verilen ilaç, büyüme faktörü, biyokimyasal inhibitörü, genetik modifikasyon veya önce sulandırma ve organoid oluşumu kimyasal işleme maruz kalabilirler. Bu nedenle, ORA tahlil kullanarak bir özel uyuşturucu tedavi veya genetik değişiklik kök hücre veya onların niş karşılığı belirli bir etkiye sahip olup olmadığını belirler belirlenmesi sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Final concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Final concentration: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Final concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Final concentration: 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Final concentration: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Final concentration: 1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Recombinant murine R-spondin *</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Final concentration: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>Final concentration: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Low binding tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

Bağırsak epiteli tarafından son derece hızlı devir hızı ile karakterizedir. Memelilerde, 4-5 gün içinde tüm epitel astar yenilenir. Yetişkin bağırsak kök hücre Lieberkühn kriptalarının alt kısmında bulunan, Lgr5 gen ifade tarafından ayrılmış bulunmaktadır ve ile onların karakteristik yüksek proliferatif oranı1homeostazı korumak. İnce bağırsak boyunca Lgr5+ kök hücre Paneth hücreleri denilen özel salgı hücreleri ile iç içe. Paneth hücreleri antibakteriyel bileşikler (Yani, lizozim ve cryptdins/defensins) salgılar ve bağırsak florasının denetleme rolünü uygulamayın. Son zamanlarda, yeni bir işlev Paneth hücreleri, yani kendi kapasitesi Wnt3, EGF ve Dll12olarak birkaç anahtar ligandlar ile Lgr5+ kök hücreleri için niş destek sağlamak için keşfetti.
Ne zaman ex vivo izole ve belirli büyüme faktörleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin huzurunda kültürlü, tüm bağırsak kriptalarının için uzun ömürlü ortaya çıkmasına ve 3D yapılar kendini sürekli yenileyen denilen son derece crypt villus benzer organoids 3yetişkin ince bağırsak epitel mimarisi. Organoid kültürler, tüm kriptalarının kurulan zaman bireysel bileşenleri, yani Lgr5+ katkısı olsa adresleme olmadan kendini yenileme, çalışma ve bağırsak kök hücre niş farklılaşma izin ve Paneth hücreleri.
Burada, biz Paneth yeteneği yararlanır organoid tahlil için yeni bir yaklaşım tarif ve Lgr5+ hücreleri ilişkilendirmek ve organoids oluşturmak için zaman ortak kültürlü. Burada "organoid sulandırma tahlil" olarak adlandırılan bu yaklaşım (ORA), Paneth genetik ve biyokimyasal modifikasyonu sağlar veya Lgr5+ organoids sulandırma tarafından takip, kök hücre. Bu nedenle, iki ana bileşen bağırsak kök hücre niş fonksiyonel analiz sağlar.

Organoid sulandırma tahlil küçük müdahale RNA Apc gen tarafından (siRNA) aşağıda gösterildiği bağırsak epitel temel niş ve kök hücre bileşenlerinin ayrı fonksiyonel analiz sağlar.
Bu amaca ulaşmak için ilk floresan aktif hücre (FACS) 8000 Lgr5+ hücreleri ve 6000 Paneth hücreleri doğuştan C57BL6/J fareler ayırmak için sıralama kullanılmıştır. Şeki...

Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)

Bağırsak organoid kültürler tüm kriptalarının kurulur ve kendini yenileme ve farklılaşma analizi bir hücre özgü biçimde izin vermez. Bu iletişim kuralı sulandırma sıralanmış kök (Lgr5+) açıklar ve neden olmaktadır organoids için onların önceki biyokimyasal ve genetik modifikasyon ve fonksiyonel analiz etkinleştirilirken (Paneth) hücreleri niş.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

11.3K Görüntüleme.  Erasmus University Medical Center. Bağırsak organoid kültürler tüm kriptalarının kurulur ve kendini yenileme ve farklılaşma analizi bir hücre özgü biçimde izin vermez. Bu iletişim kuralı sulandırma sıralanmış kök (Lgr5+) açıklar ve neden olmaktadır organoids için onların önceki biyokimyasal ve genetik modifikasyon ve fonksiyonel analiz etkinleştirilirken (Paneth) hücreleri niş.

Video: The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Kanser Araştırmaları

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Tıp

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing gastrointestinal (GI) tract. Regional specification in the intestine is driven by multiple developmental pathways, including the bone morphogenetic protein (BMP) pathway. Based on normal regional specification, a method to generate human colonic organoids (HCOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs), which include human embryonic stem cells (hES) and induced pluripotent stem cells (iPSCs), was developed. A three-day induction of BMP signaling sufficiently patterns mid/hindgut tube cultures into special AT-rich sequence-binding protein 2 (SATB2)-expressing HCOs containing all of the main epithelial cell types present in human colon as well as co-developing mesenchymal cells. Omission of BMP (or addition of the BMP inhibitor NOGGIN) during this critical patterning period resulted in the formation of human intestinal organoids (HIOs). HIOs and HCOs morphologically and molecularly resemble human developing small intestine and colon, respectively. Despite the utility of HIOs and HCOs for studying human intestinal development, the generation of HIOs and HCOs is challenging. This paper presents methods for generating, maintaining, and characterizing HIOs and HCOs. In addition, the critical steps in the protocol and troubleshooting recommendations are provided.

<meta charset="utf8"></head><body>İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Here, detailed methods for generating, maintaining, and characterizing human pluripotent stem cell-derived small intestinal and colonic organoids are described. These methods are designed to improve reproducibility, expand scalability, and decrease the working time required for plating and passaging of organoids.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

Gelişim Biyolojisi

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, and metabolism of nutrients and xenobiotics while facilitating a symbiotic relationship with microbiota and restricting the invasion of microorganisms. Functional interaction between various cell types and their physical and biochemical environment is vital to establish and maintain intestinal tissue homeostasis. Modeling these complex interactions and integrated intestinal physiology in vitro is a formidable goal with the potential to transform the way new therapeutic targets and drug candidates are discovered and developed.
Organoids and Organ-on-a-Chip technologies have recently been combined to generate human-relevant intestine chips suitable for studying the functional aspects of intestinal physiology and pathophysiology in vitro. Organoids derived from the biopsies of the small (duodenum) and large intestine are seeded into the top compartment of an organ chip and then successfully expand&#160;as monolayers while preserving the distinct cellular, molecular, and functional features of each intestinal region. Human intestine tissue-specific microvascular endothelial cells are incorporated in the bottom compartment of the organ chip to recreate the epithelial-endothelial interface. This novel platform facilitates luminal exposure to nutrients, drugs, and microorganisms, enabling studies of intestinal transport, permeability, and host-microbe interactions.
Here, a detailed protocol is provided for the establishment of intestine chips representing the human duodenum (duodenum chip) and colon (colon chip), and their subsequent culture under continuous flow and peristalsis-like deformations. We demonstrate methods for assessing drug metabolism and CYP3A4 induction in duodenum chip using prototypical inducers and substrates. Lastly, we provide a step-by-step procedure&#160;for the in vitro modeling of interferon gamma (IFN&#947;)-mediated barrier disruption (leaky gut syndrome) in a colon chip, including methods for evaluating the alteration of paracellular permeability, changes in cytokine secretion, and transcriptomic profiling of the cells within the chip.

Biopsy-derived intestinal organoids and organ-on-a-chips technologies are combined into a microphysiological platform to recapitulate region-specific intestinal functionality.

Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Biyomühendislik

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Biyoloji

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Murin Bağırsak Kriptlerinden ve Tek Kök Hücreden Organoidlerin 3D Kültürü

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Yazar Spotlight: Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürü ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre