Diese Studie wurde ermöglicht durch die Finanzierung von der niederländischen Krebsgesellschaft (KWF; EMCR 2012-5473) und World Cancer Research Fonds International (WCRF, Projekt Nr. 2014-1181)

Alle Verfahren wurden nach lokalen Tierschutz Gesetze und Richtlinien durchgeführt.
1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte
<ol><li>Autoklav 1 Satz Darm Schere, normalen Scheren und Pinzetten in einen sterilen Behälter.</li>
	<li>Statt einer 96-Well (Flachboden) Gericht in einem Inkubator bei 37 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 mL komplette Kulturmedium mit den Reagenzien in Tabelle Materialien aufgeführt.</li>
	<li>Inkubieren Sie das komplette Medium bei 37 ° C im Wasserbad.</li>
	<li>Tauen Sie rekonstituierte Basalmembran, indem man sie in einen Eiskübel. Die rekonstituierte Basalmembran wird bei 4 ° C flüssig werden.</li>
	<li>Füllen Sie 4 Petrischalen mit kalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder abgekürzt PBS (4 ° C).</li>
</ol>2. Isolierung der kleinen Darm Krypten
<ol><li>Opfern von CO2 Inhalation Lgr5- eGFP-IRES-CreERt2 Maus auf einem C57BL6/J-Hintergrund. Zerlegen Sie das Peritoneum längs mit einer Schere.</li>
	<li>Halten Sie den Magen mit der Zange und quer in zwei Hälften geschnitten.</li>
	<li>Mit der intestinalen Schere von nun an, ziehen Sie den Darm und legen Sie sie in eine Petrischale mit PBS. Hinweis: Darm Scheren haben eine scharfe und eine stumpfe Spitze. Die stumpfe Spitze diese Schere soll nicht die Krypta-Villus Architektur beschädigt beim Öffnen des Darms.</li>
	<li>Beginnen Sie damit die stumpfe Spitze in den Magen, und schieben Sie es durch den Pylorus. Fahren Sie fort, indem Sie mit der Schere schneiden und mit der Zange.</li>
	<li>Sobald der gesamte Dünndarm längs geöffnet wird, indem Sie es mit der Zange halten in kaltem PBS waschen Sie und spülen Sie ihn sanft in die PBS-Lösung mit u-förmigen Bewegungen.</li>
	<li>Sobald die Hocker Reste gerodet werden, fahren Sie mit den Darm auf ein Schneidebrett, luminalen Seite nach oben zu glätten. Die luminalen Seite ist leicht erkennbar durch das Fehlen der Blutgefäße und durch sein blasses Aussehen im Vergleich zu den äußeren Teil.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Glas-Folie vorsichtig die Zotten durch Abkratzen der abgeflachten Darms. Führen Sie diesen Schritt zweimal über die gesamte Länge des Gewebes.</li>
	<li>Schneiden Sie der Dünndarm mit einer sterilen chirurgischen Klinge in 2-5 mm Stücke.</li>
	<li>Legen Sie die kleinen Darm Fragmente in ein 50 mL-Tube mit 10 mL Eis kaltem PBS.</li>
	<li>Reinigen Sie die Gewebefragmente, entfernen alle restlichen Verunreinigungen durch pipettieren sie rauf und runter in die PBS. Verwerfen Sie überstand und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die PBS völlig klar ist.</li>
	<li>Fügen Sie 15 mL kaltem PBS, um das endgültige Gesamtvolumen der PBS zu 25 mL. Fügen Sie 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und 45 min auf einer Walze bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Entsorgen Sie die PBS/EDTA.</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL PBS und lösen Sie die Krypten, indem die Gewebefragmente Pipettieren hart nach oben und unten (mindestens dreimal). Den Überstand zu sammeln.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.13 viermal. Fügen Sie zu einem Endvolumen von 50 mL Kulturmedium.</li>
	<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugation (300 X g für 5 min).</li>
	<li>Das Pellet in 10 mL Kulturmedium Aufschwemmen und pellet die Krypten durch Zentrifugieren (80 X g für 3 min).</li>
</ol>3. einzelne Zelle Vorbereitung
<ol><li>Verwerfen den überstand die gebeizte Krypten und ihnen in 1 mL Trypsin Like-Enzyme zusammen mit 50 µL Aufschwemmen DNAse (50 µg/mL).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in einem Wasserbad bei 32 ° C für 2 min.</li>
	<li>10 mL Kulturmedium hinzugeben. Die Krypten in Einzelzellen zu distanzieren, hart Pipettieren oben und unten mindestens 5 Mal.</li>
	<li>Filtern Sie die Lösung durch ein 40 µm-Sieb (um Klumpen und andere Verunreinigungen zu beseitigen) und pellet-Einzelzellen 300 X g für 5 min.</li>
</ol>(4) flow Cytometry und Beschichtung
<ol><li>50 mL 1 X Hank gepufferte Salzlösung oder HBSS/2% fetalen Kuh Serum (FCS) Lösung vorbereiten und das Pellet in 1 mL für jeden 106 Zellen Aufschwemmen</li>
	<li>Hinzu kommt die Zellsuspension BV421 Lin– (CD31, CD45, TER119) in einer Konzentration von 1: 100, und CD24-APC und CD117-PE sowohl bei einer Konzentration von 1: 250 Antikörper für 30 Minuten.</li>
	<li>Art Lgr5+ Stammzellen und Paneth Zellen in separaten Low binden Röhren. Einzelheiten zur Sortierung Protokolle für Lgr5+ und Paneth Zellen, siehe Roth Et Al. 7 und Schewe Et al. 6<ol>
<li>Zentrifuge der sortierten Zellen bei 300 X g für 5 min. der Zellen in 100 µL Medium mit den Komponenten wie 1.3 beschrieben Aufschwemmen (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Behandeln (z.B.durch chemische oder genetische Modifikation) Paneth-Zellen (n = 2000) oder die Lgr5+ -Stammzellen (n = 2000).<ol>
<li>Um Zellen zu behandeln, verwenden 5 µL der Liposomen-vermittelte Transfektion Reagenz in einem Gesamtvolumen von 100 µL Nährmedium und kleine interferierende RNA (SiRNA) in einer Konzentration von 100 nM. 30 min bei 37 ° C für SiRNA oder für die notwendige Zeit für die gewählten Modifikation inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal in 500 µL Kulturmedium.</li>
	<li>300 X g für 5 min Zentrifugieren und die Zellen in 10 µL Kulturmedium Aufschwemmen.</li>
	<li>Bündeln die beiden zellulären Komponenten (Paneth oder Lgr5+ Zellen) in einer 20 µl Gesamtvolumen und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei RT</li>
	<li>Gemeinsam brüten die Paneth und Lgr5+ Zellen für 10 min bei RT</li>
	<li>10 µL des Überstands und lassen ein Meniskus Flüssigkeit um sicher zu sein, nicht die Zelle Pellet Aspirieren.</li>
	<li>Die Zellen für ein Gesamtvolumen von 40 µL 30 µL rekonstituierte Basalmembran hinzu, Aufschwemmen der Zellen und in eine vorgewärmte 96-well-Platte-Platte. Nach 10 min, 200 µL kompletten Medium hinzufügen (siehe die Tabelle der Materialien). Wechsel-Medium alle 48 h.</li>
	<li>Graf organoide Multiplizität am 5. Tag.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte

Die ORA ermöglicht die raffinierte funktionelle Analyse von zwei wesentlichen Komponenten der intestinalen Stammzellnische, nämlich Lgr5+ und Paneth Zellen. Dieser Ansatz wurde bisher von uns und anderen mit leichten Modifikationen6,10,11eingesetzt. Hier präsentieren wir Ihnen das ORA-Verfahren als eine reproduzierbare und standardisierte Laborprotokoll. Außerdem berichten wir über die Auswirkungen der <...

Das Darmepithel ist das am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im Säugetier-Körper und als solche wurde das Objekt von einer Vielzahl von Studien, die darauf abzielen, die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von adulten Stammzellen, die ihren Wohnsitz am unteren Rand der Krypta der Lieberkühn, zweckgebundene durch Expression des Lgr5 -Gens und kanonischer Wnt Signale1abhängig. Insbesondere sind Lgr5+ Stammzellen flankiert und unterstützt durch spezielle Nische Zellen, d.h. Paneth-Zellen, die auch abhängig von Wnt signalisieren für ihre Reifung2. Zusammen, diese beiden Zelltypen zugrunde liegen Selbsterneuerung der intestinalen epithelialen Auskleidung und die täglichen homöostatische Gleichgewicht zu bewahren: Lgr5+ Stammzellen schnell teilen und geben Anlass zu Vorläuferzellen und mehr spezialisierte intestinale epitheliale Zellen; Paneth-Zellen liefern wesentliche Nische Faktoren (z. B.Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ Stammzellen-2. Die Kapazität der intestinalen Krypten wenn vergoldet ex Vivo , organisierte und selbst erneuernde Strukturen bilden Organellen oder "Mini-Mut", genannt wurde als ein experimentelles Werkzeug, um Einblick in Prozesse wie Selbsterneuerung ausgeschöpft und Differenzierung in normalen und pathologischen Bedingungen einschließlich Krebs4. Organoide Kulturen wurden aus mehreren Geweben, einschließlich der Darm, Bauchspeicheldrüse, Leber und Nieren, Maus-und Humanproben4eingerichtet. Der Extraktionsmethode und die Wachstumsfaktoren eingesetzt, um diese organoide Kulturen entwickeln sind gewebespezifisch und Multi-Linie Differenzierung und imitieren so nah wie möglich der ursprünglichen Stammzellnische in-vivo. Organellen können potenzielle Anwendungen, einschließlich der Behandlung von Erbkrankheiten, die Beurteilung der therapeutische Wirksamkeit bei Krebs, die Analyse der Medikamententoxizität oder das Studium der Organogenese in-vitro-5haben.
Insgesamt ist die wichtigste Einschränkung der organoide Kulturen als aus Gewebeproben einen Mangel der Zelle-Spezifität. Zum Beispiel Darm Organellen hergestellt aus ganzen Darm Krypten erlauben nicht die Analyse der einzelnen Zellbestandteile umfasste innerhalb der Gewebe-Quelle (z.B.ganze Krypten enthalten Lgr5+, Paneth, und Vorläuferzellen).
Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, genannt ORA, die die Vorzüge der intestinalen organoide Kulturen mit der Funktionsanalyse der grundlegendsten Komponenten, nämlich Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen verbindet. Dies geschieht durch die einzigartige Fähigkeit der Paneth und Lgr5+ -Zellen um körperlich zu verknüpfen mit einander wenn Co inkubiert und Anlass zu Organellen2,6,10 geben. Wir nutzten diese Funktion und vorbehandelt zwei Zelltypen einzeln vor, so dass sie Organellen zu rekonstruieren. Wenn Sie dies tun, kann jede Zelle-Komponente bestimmten Droge, Wachstumsfaktor, biochemische Inhibitor, Gentechnik oder chemische Behandlung vor der Rekonstitution und organoide Bildung ausgesetzt werden. Deshalb wird mit der ORA-Assay erlauben die Bestimmung, ob eine spezifische medikamentöse Behandlung oder gentechnische Veränderung hat eine spezifische Wirkung auf die Stammzellen oder ihre Nische Pendant.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Final concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Final concentration: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Final concentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Final concentration: 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Final concentration: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Final concentration: 1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Recombinant murine R-spondin *</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Final concentration: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>Final concentration: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Low binding tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

Das Darmepithel zeichnet sich durch eine extrem hohe Fluktuationsrate. Bei Säugetieren ist die gesamte epitheliale Auskleidung innerhalb von 4-5 Tagen erneuert. Intestinaler Stammzellen befinden sich am unteren Rand der Krypten Lieberkühn, sind bestimmt durch die Expression des Lgr5 -Gens und Homöostase durch ihre charakteristische hohe proliferative Rate1erhalten. In den Dünndarm Lgr5+ Stammzellen sind vermischt mit spezialisierten sekretorischen Zellen Paneth-Zellen genannt. Paneth-Zellen sezernieren antibakterielle Verbindungen (d. h., Lysozym und Cryptdins/Defensine) und eine Kontrollfunktion auf die Darmflora ausüben. Vor kurzem wurde eine neue Funktion für Paneth Zellen, nämlich ihre Fähigkeit zur Nische unterstützen Lgr5+ Stammzellen durch mehrere wichtige Liganden Wnt3, EGF und Dll12entdeckt.
Als Ex-Vivo isoliert und in Anwesenheit von bestimmten Wachstumsfaktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix kultiviert, ganze Darm Krypten führen zu langlebigen und selbst erneuern 3D-Strukturen genannt Organellen, die Krypta-Villus sehr ähneln epitheliale Architektur des Erwachsenen Dünndarm3. Organoide Kulturen, wenn hergestellt aus ganzen Krypten, ermöglichen die Untersuchung der Selbsterneuerung und Differenzierung von der intestinalen Stammzellnische allerdings ohne Adressierung des Beitrags der einzelnen Komponenten, nämlich der Lgr5+ und Paneth-Zellen.
Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur organoide Assays, die die Fähigkeit der Paneth nutzt und Lgr5+ Zellen verbinden und Organellen bilden wenn Co kultiviert. Dieser Ansatz, hier als "organoide Rekonstitution Assay" bezeichnet (ORA), ermöglicht die genetische und biochemische Änderung Paneth oder Lgr5+ Stammzellen, gefolgt von der Rekonstitution in Organellen. So ermöglicht es die Funktionsanalyse der zwei Hauptkomponenten der intestinalen Stammzellnische.

Die organoide Rekonstitution Assay ermöglicht die separate funktionelle Analyse der wesentlichen Nische und Stammzellforschung Komponenten des Darmepithels, hier durch kleine interferierende RNA (SiRNA) des Apc -Gens nachgewiesen.
Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir zuerst verwendet Fluoreszenz aktivierte Zelle sortieren (FACS) um 8000 Lgr5+ und 6000 Paneth Zellen von Inzucht C57BL6/J Mäusen zu ...

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The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen

Intestinale organoide Kulturen werden aus ganzen Krypten und erlauben nicht die Analyse der Selbsterneuerung und Differenzierung in eine Zelle-spezifische Art und Weise. Dieses Protokoll beschreibt Rekonstitution der sortierten Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen, die Organellen hervorrufen und ermöglicht ihre vorherige biochemische und genetische Modifikation und Funktionsanalyse.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

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The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

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11.3K Aufrufe.  Erasmus University Medical Center. Intestinale organoide Kulturen werden aus ganzen Krypten und erlauben nicht die Analyse der Selbsterneuerung und Differenzierung in eine Zelle-spezifische Art und Weise. Dieses Protokoll beschreibt Rekonstitution der sortierten Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen, die Organellen hervorrufen und ermöglicht ihre vorherige biochemische und genetische Modifikation und Funktionsanalyse.

Serie: The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Forschung

Krebsforschung

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Immunologie und Infektion

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Medizin

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing gastrointestinal (GI) tract. Regional specification in the intestine is driven by multiple developmental pathways, including the bone morphogenetic protein (BMP) pathway. Based on normal regional specification, a method to generate human colonic organoids (HCOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs), which include human embryonic stem cells (hES) and induced pluripotent stem cells (iPSCs), was developed. A three-day induction of BMP signaling sufficiently patterns mid/hindgut tube cultures into special AT-rich sequence-binding protein 2 (SATB2)-expressing HCOs containing all of the main epithelial cell types present in human colon as well as co-developing mesenchymal cells. Omission of BMP (or addition of the BMP inhibitor NOGGIN) during this critical patterning period resulted in the formation of human intestinal organoids (HIOs). HIOs and HCOs morphologically and molecularly resemble human developing small intestine and colon, respectively. Despite the utility of HIOs and HCOs for studying human intestinal development, the generation of HIOs and HCOs is challenging. This paper presents methods for generating, maintaining, and characterizing HIOs and HCOs. In addition, the critical steps in the protocol and troubleshooting recommendations are provided.

<meta charset="utf8"></head><body>Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden

Here, detailed methods for generating, maintaining, and characterizing human pluripotent stem cell-derived small intestinal and colonic organoids are described. These methods are designed to improve reproducibility, expand scalability, and decrease the working time required for plating and passaging of organoids.

Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

Entwicklungsbiologie

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, and metabolism of nutrients and xenobiotics while facilitating a symbiotic relationship with microbiota and restricting the invasion of microorganisms. Functional interaction between various cell types and their physical and biochemical environment is vital to establish and maintain intestinal tissue homeostasis. Modeling these complex interactions and integrated intestinal physiology in vitro is a formidable goal with the potential to transform the way new therapeutic targets and drug candidates are discovered and developed.
Organoids and Organ-on-a-Chip technologies have recently been combined to generate human-relevant intestine chips suitable for studying the functional aspects of intestinal physiology and pathophysiology in vitro. Organoids derived from the biopsies of the small (duodenum) and large intestine are seeded into the top compartment of an organ chip and then successfully expand&#160;as monolayers while preserving the distinct cellular, molecular, and functional features of each intestinal region. Human intestine tissue-specific microvascular endothelial cells are incorporated in the bottom compartment of the organ chip to recreate the epithelial-endothelial interface. This novel platform facilitates luminal exposure to nutrients, drugs, and microorganisms, enabling studies of intestinal transport, permeability, and host-microbe interactions.
Here, a detailed protocol is provided for the establishment of intestine chips representing the human duodenum (duodenum chip) and colon (colon chip), and their subsequent culture under continuous flow and peristalsis-like deformations. We demonstrate methods for assessing drug metabolism and CYP3A4 induction in duodenum chip using prototypical inducers and substrates. Lastly, we provide a step-by-step procedure&#160;for the in vitro modeling of interferon gamma (IFN&#947;)-mediated barrier disruption (leaky gut syndrome) in a colon chip, including methods for evaluating the alteration of paracellular permeability, changes in cytokine secretion, and transcriptomic profiling of the cells within the chip.

Biopsy-derived intestinal organoids and organ-on-a-chips technologies are combined into a microphysiological platform to recapitulate region-specific intestinal functionality.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Biotechnik

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Biologie

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

3D-Kultur von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einzelnen Stammzellen

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Autor im Rampenlicht: Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen

Zusammenfassung

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Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung