Biz Penelope Garcia onun teknik yardım ve bu el yazması hazırlanması için teşekkür ederiz. Bu eser tıp bölümü, Loma Linda Üniversitesi (681205-2967) bir araştırma yenilik Grant (RIG) ve ulusal multipl skleroz Derneği (PP1685) bir pilot hibe XT için tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneylerin bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Protokolü hayvan bakım ve El Paso ve Loma Linda Üniversitesi'nde Texas Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış uygun olarak yapıldı.
1. nesil bir Protein tüm uzunluğu kapsayan bir OLP Kütüphane
<ol>
	<li>Bir OLP kitaplığı içindeki tüm peptidler 15-mer uzunluğu ve bitişik peptidler 11 amino asitler tarafından üst üste tasarlayın. Not: MOG OLP çalışmada, MOG habercisi [Mus musculus] dizisi NCBI protein bu bağlantıyı takip ederek veritabanından: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Bildirilen Qa-1 (HLA-E) epitopları çoğunu sinyal peptidler (örneğin Qdm1) yerleşmişti çünkü gerçekleştirdiği sinyal ve olgun peptidler, MOG habercisi (247 amino asitler), kullanıldı. Öyle ki iki bitişik peptidler 11 amino asitler (şekil 1) tarafından üst üste onun N-terminus adlı başlayarak, 15-mer peptidler dizisi tespit edilmiştir. Bu nedenle, tam 59 OLPs 247 amino asit MOG habercisi tespit edilmiştir. Ancak, son OLP 12'den 15-mer protein uzunluğuna bağlı olarak değişebilir. Buna ek olarak, biz ve diğerleri 15-mer peptidler, dendritik hücreler (DC) veya makrofajlar, eklendiğinde verimli olabilir göstermiştir çünkü biz 15-mer kitaplığı seçin epitopları tanıma içine CD8 tarafından işlenmiş14,15+ T hücreleri .</li>
	<li>Her bireysel peptid ticari olarak satın alabilirsiniz. 5 mg-peptid tarama için yeterli olmalıdır. OLPs ve kesilmiş peptidler (adım 6.1) desalted peptidler (yaklaşık 50-%70 saflık olduğunu) olabilir. Tetramer nesil için ve gelecekteki biyolojik analizleri için kullanılacak en iyi peptid (adım 6.2) saflığı olmalıdır &#62; % 90. Peptidler steril koşul altında yeniden oluşturma.</li>
	<li>50 mg/mL bireysel peptid hisse senetleri % 100 DMSO içinde olun. Her peptid, 5 mg eklemek için DMSO 100 μL her tüpün içine karıştırın ve peptidler-20 ° C'de depolayın Bu hisse senetleri CD8 üretimi için bir OLP_pool stok yapmak için kullanılan+ T hücre hatları OLP_pool için reaktif. Buna ek olarak, bu hisse senetleri de 10 mg/mL bireysel peptid hisse senetleri Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool reaktif CD8 uyarmak için her bireysel peptid yeteneklerini belirlemek için yapmak için kullanılmasını+ T hücre satırı.</li>
	<li>Taze bir tüpün içine her peptid eşit bir hacmi ekleyerek yapmak OLP_pool hisse senedi. Bu OLP_pool hisse senedi % 100 DMSO içerir. MOG OLP çalışmada, 59 OLPs12vardı. Bu nedenle, OLP_pool her peptid konsantrasyon 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59) oldu.</li>
	<li>10 mg/mL bireysel peptid stokları sulandrarak (5 x) yapmak steril H2O bir V-alt 96-şey plaka (Bu hisselerin % 20 DMSO içerir) 50 mg/mL stoklarımızda. Çünkü her bireysel peptid Qa-1-sınırlı tepki belirlenmesi 8 veya 12 kanal çok kanallı pipet kullanarak bir 96-şey tabak içinde gerçekleştirilecek bu stokları bir 96-şey tabak içinde olun. Not: OLPs ve kesilmiş peptidler, dahil olmak üzere tüm peptidler, ya bir V-alt 96-şey tabak içinde seyreltilmiş veya peptid Kütüphane tarama 96-şey levha bir çok kanallı pipet kullanarak gerçekleştirilen bu yana bir 96-iyi örnek raf 1 mL tüpler ile dolu. Bir peptid sulandırmak zor yoksa 1 N NaOH damla peptid dağıtılması yardımcı olmak akıllıca ekleyin.</li>
</ol>
2. Astar kb-/- Db-/- CD8+ OLP_pool Geniş puls K T hücrelerleb-/- Db-/- dendritik hücreler (DC).
Not: İki büyük Qa-1 gen vardır: biri Qa-1birve diğer Qa-1b. Akademik araştırmalar için yaygın olarak kullanılan hayvanlar beri örneğin C57BL/6 ve Balb/c fare, carry Qa-1b, bu iletişim kuralı için eşleme Qa-1b epitopları bir protein ile ilgili yordamı açıklamaktadır. CD8+ T bu protokol için kullanılan hücre K safb-/-Db-/- hangi CD8 (C57BL/6 arka plan) farelerde+ T hücreleri Qa-1 de dahil olmak üzere çoğunlukla klasik olmayan MHC-IB moleküller tarafından kısıtlanmış.
<ol>
	<li>Kemik iliği türevi DCs yukarıda açıklanan12olarak üretmek.
	<ol>
		<li>Kısaca, RPMI-10 Orta (% 10 fetal sığır serum, 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM sodyum pyruvate ve 0,1 mM gerekli olmayan amino asit ile takıma RPMI 1640) kemik iliği tek hücre süspansiyonlar (1 x 106 hücre/mL) kültür 10 U/mL Il-4 ve 100 U/mL GM-CSF 37 ° c, % 5 CO26-şey plaka (4 mL/de) içeren.</li>
		<li>İki gün sonra yapışık olmayan hücreleri dikkatli bir şekilde çıkarın ve taze medya ve sitokinler ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri başka bir iki gün sonra kültür, taze medya ve sitokinler yeni bir 6-şey plaka içeren yapışık olmayan hücreler aktarın.</li>
		<li>Hücreleri başka bir iki gün boyunca kültür ve taze medya ve LPS içeren sitokinler ile doldurulan (0.1 µg / DCs etkinleştirmek için mL).</li>
		<li>24 saat sonra deneyler için DCs toplamak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DCs 3000 rad ile ışınlatayım.
	<ol>
		<li>Alternatif olarak, mitomycin C ile DCs (5 x 107 hücre/mL) tedavi (50 μg/mL) PBS 20 dk. 37 ° C'de RPMI-0 (serum olmadan RPMI 1640) tüp (~ 12 mL) doldurun ve bir masa üstü santrifüj vasıl 300 x g. atma supernatants ve düşmanla 10 min için hücreleri spin eklemek t çamaşır yordamı iki kez daha. Bu üç yıkama kritik mitomycin C herhangi bir eser miktarda CD8 yanıt inhibe çünkü DC-T hücre ortak kültürü sırasında+ T hücreleri.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DC konsantrasyonu 5 x 106 hücre/ml serum serbest bir ortamda (5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM sodyum pyruvate ve 0,1 mM gerekli olmayan amino asit ile takıma AIM-V serum-Alerjik orta) ayarlayın.</li>
	<li>Öyle ki son DMSO konsantrasyonu % 0,5 (200 x) olacak % 100 DMSO, DC'ler için içeren OLP_pool hisse senedi çözüm ekleyin. MOG OLP çalışmada, OLP_pool her OLP konsantrasyonu 847.46 μg/mL vardı; Bu nedenle her OLP DC kültüründe son konsantrasyonu 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200) oldu.</li></ol>Ancak, hücre kültüründe DMSO konsantrasyonu % 1'den az olduğu sürece bu konsantrasyon 100 μg/mL kadar ölçeklendirilebilir.
	<li>3 h için oda sıcaklığında DCs kuluçkaya ve hücreleri nazikçe her 15 dakika çalkalanır.</li>
	<li>Bu kuluçka döneminde CD8 arındırmak+ T hücre hasat dalak veya lenf düğümleri kb-/-Db-/- ticari CD8 kullanarak fare+ T hücre arıtma kiti, hücre konsantrasyonu 10 x 106 hücre/ml ayarlayın 50 U/mL İnterlökin 2 (IL-2) ve 7 Il-100 U/mL içeren serum-Alerjik orta.</li>
	<li>Şimdi, CD8 ekleyin+ T hücreleri içine 48-şey plaka olarak 0.5 mL/iyi (ek 0,5 mL/de Adım 2.8, CD8 son konsantrasyonu OLP_pool Geniş puls DCs, sonra+ T hücre-ecek var olmak 5 x 106 hücre/mL). Not: CD8+ T hücreleri fare dalak ve lenf bezleri saf üreticisi tarafından sağlanan öğretim takip ederek CD8 pozitif izolasyon Kit kullanarak. CD8+ T hücreleri elde boncuk ücretsizdir.</li>
	<li>OLP_pool Geniş puls DC 2 x 106 hücre/mL serum-Alerjik orta için spin OLP_pool Geniş puls DCs (300 x g, 10 dk) RT. sulandırmak, aşağı ve 0,5 mL/iyi CD8 içerir 48-şey plaka eklemek+ T hücreleri (son konsantrasyonu OLP _pool Geniş puls DCs 1 x 106 hücre/mL, CD8 son konsantrasyonu olduğunu+ T hücreleri 5 x 106 hücre/mL, son IL-2 bölgedir 25 U/mL ise 7 Il-son konsantrasyonu 50 U/mL). 37 ° C ve % 5 CO2hücre kültür.</li>
	<li>Günde 4, kaldırın ve kültür ortamının yaklaşık 400 μL atmak ve 100 U/mL IL-2 ve 100U/mL 7 Il-her şey için içeren taze serum-Alerjik orta 500 μL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2hücreleri kuluçkaya.</li>
	<li>Günde 7 veya 8, OLP_pool astarlanmalıdır CD8 yeniden uyarmak+ T hücreleri ile OLP_pool.</li>

3. astarlanmalıdır CD8 restimulation+ T hücreleri makrofajlar ile geniş puls ile OLP_pool
<ol>
	<li>Dört gün önce yeniden OLP_pool astarlanmalıdır CD8 uyarılması+ T hücreleri, %2 (v/v) polyacrylamide boncuk çözüm hazırlamak: endotoksin ücretsiz iki kez 20 mL 2 g polyacrylamide boncuk yıkama H2O veya PBS. Santrifüjü (400 x g) 5 min için tarafından polyacrylamide boncuk cips ve PBS 100 mL resuspend. Otoklav 15 lb/m 20 dk. mağaza oda sıcaklığında.</li>
	<li>Fareler intraperitoneally ile 1 mL/fare çözümün monosit/makrofajlar geçiş Periton boşluğuna16içine çekmek için steril % 2 polyacrylamide boncuk enjekte.</li>
	<li>Dört gün sonra CO2 doz tarafından hayvanlar kurban.
	<ol>
		<li>Steril koşullarda, açılış yeterli olacak bir küçük karın merkezinde açılış kesilmiş 5 mL transfer pipet geçmek için. Transfer pipet RPMI-0 ile doldurun ve pipet delikten karın boşluğuna takabilirsiniz.</li>
		<li>Karın boşluğuna pipetting tarafından durulayın. Kadar sıvı karın boşluğuna üzerinden mümkün olduğunca (Periton makrofajlar bunlar) steril tüpe pipet. Durulama adım 4 - 5 kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3000 rad ile Periton makrofajlar ışınlatayım.
	<ol>
		<li>Alternatif olarak, Periton makrofajlar (takip adım 2.2 içinde açıklanan yordamı) mitomycin C ile tedavi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Periton makrofajlar 5 x 106 hücre/ml serum-Alerjik orta yoğunlukta ayarlayın. OLP_pool hisse senedi (son DMSO konsantrasyonu ise % 1'den az) ekleyip M-CSF (son toplama 100 U/mL =). Not: Bu MOG OLP çalışmada, biz % 0.5 DMSO kullanılır. Böylece, MOG OLP_pool hisse senedi seyreltilmiş 200 x (örneğin 1 MOG hisse senedi Periton makrofajlar 199 μL eklendi OLP_Pool μL) idi. Bu nedenle, her OLP son konsantrasyonu 4.2 μg/mL) idi.</li>
	<li>48-iyi doku kültürü tabak içinde 200 μL/iyi (1 x 106 hücreler/de) ekleyin ve 4 h için 37 ° C'de plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Yapışık olmayan hücreleri ve polyacrylamide boncuk nazik yıkama 200 μL/iyi Önceden ısıtılmış RPMI-0 ile çıkarın.</li>
	<li>Toplamak ve havuzu OLP_pool astarlanmalıdır CD8+ T hücreleri adım 2.10. Ayarlamak OLP_pool CD8 astarlanmalıdır+ T hücre konsantrasyonu 1 x 106 hücre/ml 25 U/mL IL-2 ve 7 Il-50 U/mL içeren serum-Alerjik orta. 1 mL/iyi OLP_pool Geniş puls Periton makrofajlar içerir 48-şey plaka ekleyin.</li>
	<li>Dört gün sonra 48-şey plaka ortamda doldurmak. Kaldırmak ve 48-şey kültür tabak içinde kültür ortamının yaklaşık 400 μL atın. Taze serum-Alerjik orta içeren 100 U/ml IL-2 500 μL ve 7 Il-100 U/mL her kuyunun içine ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2hücre kültür.</li>
	<li>Üç ya da dört gün sonra incelemek OLP_pool restimulated CD8+ T hücreleri OLP_pool özgü, Qa-1-sınırlı yanıt için enzim bağlı immunospot tahlil (ELISPOT) tarafından. Bu noktadan sonra CD8 yeniden uyarmak+ T hücreleri her 7-10 gün. Not: Makrofajlar OLP_pool astarlanmalıdır CD8 yeniden uyarılması için tercih edilen+ T hücreleri. Biz fark CD8+ T hücreleri yeniden makrofaj tarafından uyarılan büyüdü DCs içinde vitroiyi.</li>
</ol>
4. OLP_pool özgü tespiti, Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool restimulated CD8 T hücre+ hattı
Not: OLP_pool özgü, Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool restimulated CD8+ T hücre IFNγ salgılanması stimülasyon C1R veya C1R huzurunda OLP_pool tarafından takip tarafından belirlenir. Qa-1b hücreleri bir IFNγ ELISPOT tahlil kullanarak. C1R hücreleri ticari olarak elde edilebilir. C1R. Qa-1b hücreleri Qa-1 lentiviral vektör C1R hücrelerle transducing tarafından oluşturulur.
<ol>
	<li>100 μL/iyi bir yakalama anti-IFN-γ antikor (PBS) kaplama arabellekte bir ELISPOT plaka kuyu seyreltilmiş ekleyin.</li></ol>Mühür ve bir gecede 4 ° c plaka kuluçkaya.
	<li>İkinci gününde yakalama anti-IFN-γ antikor içeren kaplama arabellek atın ve 200 μL/iyi-blocking çözüm (serum-Alerjik orta) ekleyin ve oda sıcaklığında 2 h plaka kuluçkaya.</li>
	<li>C1R ve C1R ışınlatayım. Qa-1b hücreleri 9.600 rad ile.
	<ol>
		<li>Alternatif olarak, C1R ve C1R tedavi. Qa-1b hücreleri mitomycin dışında o tesir süresi 30 dk olacak adım 2.2 içinde açıklandığı gibi C ile.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C1R ve C1R ayarlayın. 4 x 106 hücre/ml serum serbest ortamda qa-1b hücreleri.</li>
	<li>Plaka engelleme çözümde atmak ve C1R ve C1R ekleyin. Qa-1b hücreleri 50 μL/iyi (200.000 hücreler/de) ve karışımı.</li>
	<li>100 x 50 μL/iyi OLP_pool hisse senedi (serum-Alerjik orta) seyreltilmiş ve düzgün karıştırın. Plaka, oda sıcaklığında 2-3 h için kuluçkaya.</li>
	<li>OLP_pool restimulated CD8 ayarlamak+ T hücreleri 1-2 x 106 hücre/mL 7 Il-150 U/mL içeren serum-Alerjik orta ve 50 μL/iyi (50.000-100.000 hücreler/de) plaka ekleyin. Plaka (58 x g) 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>37 ° C ve % 5 CO2 plaka gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Hücre süspansiyon Aspire edin. Wells deiyonize (DI) su (250 μL/de) ile 2 kere yıkayın. Her yıkama adımında 5 min için emmek kuyu izin.</li>
	<li>Yıkama wells 3 kez ile yıkayın tampon (%0,05 Tween20 içeren PBS). Her yıkama adımında 1 dk. için emmek kuyu izin. Yıkama arabellek atmak.</li>
	<li>Seyreltme arabellekte (% 10 fetal sığır serum (FBS) içeren PBS) seyreltilmiş algılama antikor 100 μL ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 2s için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Algılama antikor çözüm atın. Wells her yıkama adımında 1 dk. için emmek için 3 kez 250 µL/iyi yıkamak arabellek ı. izin wells ile yıkayın.</li>
	<li>100 μL/kuyu, 1: 100 seyreltme seyreltme arabellekte seyreltilmiş enzim eşlenik (Streptavidin-HRP) ekleyin.</li>
	<li>Plakalar, oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Enzim eşlenik çözüm atın. Wells her yıkama adımında 1 dk. için emmek için 4 kez 250 µL/iyi yıkamak arabellek ı. izin wells ile yıkayın.</li>
	<li>Wells 2 kez 250 µL/iyi yıkamak arabellek II (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>100 µL substrat çözeltisi (mix 1 damla = 20 µL AEC Kromojen, AEC substrat 1 mL ile), her şey için ekleyin. Monitör spot geliştirme 5 ile 60 dk için.</li>
	<li>İstenen sonuçları görünmeye başlar, substrat reaksiyon wells distile su ile yıkayarak durdurur.</li>
	<li>Plakayı 2s için oda sıcaklığında kuruması veya kadar tamamen kuru bir gecede. Tabakaların altında plastik tepsi kaldırılması kurutma kolaylaştıracaktır. Analiz edilir kadar tabak mühürlü bir plastik torba karanlık içinde saklayın.</li>
	<li>Noktalar el ile diseksiyon mikroskop altında incelemek veya bir ELISPOT plaka okuyucu kullanarak numaralandırır. Şekil 2' deki temsilcisi sonucunu görmek.</li>

5. bireysel peptidler OLP_pool içinde bir OLP_pool özgü CD8 Qa-1 kısıtlı IFN γ salgılanması için teşvik tespiti+ T hücre satırı
<ol>
	<li>OLP_pool özel bir OLP_pool özgü CD8 Qa-1-restrictred IFN γ salgı teşvik bireysel peptidler belirlemek+ T hücre hattı ile yukarıda açıklanan IFN γ ELISPOT tahlil (son konsantrasyon kullanılan her bireysel peptid ELISOPT için tahlil 10 μg/mL'dir). Şekil 3' te temsilcisi sonuçları görürsünüz. Not: OLP özel, Qa-1-restircted yanıt en az üç kez C1R huzurunda yanıtının bir yanıt olarak tanımlanır. Qa-1b hücreleri ama OLP olmadan. MOG OLP çalışma, OLP68, OLP96 ve OLP105 bütün bu ölçüt araya geldi. Bu nedenle, üç OLPs potansiyel Qa-1 epitopları12 (şekil 3) içerir. Ancak, OLP105 sürekli olarak en güçlü yanıt verdi; Bu nedenle OLP105 ayrıntılı bir analiz yapılır (şekil 4 ve şekil 5)12.</li>
</ol>
6. bir OLP_pool özgü CD8 Epitope özgü, Qa 1 kısıtlı yanıtta uyaran bir 15-mer OLP en iyi Qa-1 Epitope tanımlaması+ T hücre satırı
<ol>
	<li>C - ve N-kesilmiş ölümcül peptidler, şekil 4' te gösterildiği gibi 15-mer OLP sentez.</li>
	<li>Bir OLP özgü CD8 IFN γ salgı incelemek+ uyarıcı CD8 T hücre satır+ T hücreleri ile her kesilmiş peptidler hem de ebeveyn 15-mer OLP C1R veya C1R huzurunda. Yukarıdaki kullanarak Qa-1b hücreleri IFN γ ELISPOT tahlil nitelendirdi. ELISPOT tayini için kullanılan her bireysel peptid son konsantrasyonu 10 μg/mL'dir. Bir peptid durumunda en iyi Qa-1 epitope tanımlanır peptid: 1) sürekli olarak özgün 15-mer peptid, C1R huzurunda karşılaştırıldığında benzer ya da daha sert IFN γ cevap verir. Qa-1b hücreleri; 2) 8 - 10-mer (tercih edilen 9-mer peptid) arasında olduğu için MHC ilişkili peptid uzunlukları olan-ben molekülleri15,17. Şekil 5 Temsilcisi sonuçları görmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldrich, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Tap-dependent+leader+peptide+recognized+by+alloreactive+T+cells+specific+for+a+class+Ib+antigen.">Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen.</a> Cell. 79 (4), 649-658 (1994).</li><li>Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD94/NKG2A+is+a+natural+killer+cell+receptor+for+the+nonclassical+major+histocompatibility+complex+(MHC)+class+I+molecule+Qa-1(b).">Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b).</a> J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).</li><li>Oliveira, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonpolymorphic+MHC+Qa-1+mediates+CD8++T+cell+surveillance+of+antigen-processing+defects.">The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects.</a> J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).</li><li>Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+MHC+class+Ib-restricted+cytotoxic+T+cells+monitor+antigen+processing+in+the+endoplasmic+reticulum.">Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum.</a> Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).</li><li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+regulatory+CD8+T+cells+in+Qa-1-deficient+mice.">Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice.</a> Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immunity+by+a+novel+population+of+Qa-1-restricted+CD8alphaalpha+TCRalphabeta++T+cells.">Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells.</a> J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).</li><li>Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+arthritis+through+mobilization+of+peptide-specific+CD8++regulatory+T+cells.">Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells.</a> J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).</li><li>Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+T+cell+regulation+that+enables+self-nonself+discrimination+in+the+periphery.">The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).</li><li>Panoutsakopoulou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+autoimmune+disease+after+vaccination+with+autoreactive+T+cells+that+express+Qa-1+peptide+complexes.">Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes.</a> J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).</li><li>Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-TCR+antibody+treatment+activates+a+novel+population+of+nonintestinal+CD8+alpha+alpha++TCR+alpha+beta++regulatory+T+cells+and+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).</li><li>Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+CD8++Treg+activity+enhances+the+immune+response+to+viral+infection.">Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Non-classical+Myelin+Epitopes+to+Treat+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Sci Rep. 6, 36064 (2016).</li><li>Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+host+factors+involved+in+the+major+histocompatibility+complex+class+Ib-restricted+presentation+of+Salmonella+Hsp+60:+novel+pathway.">Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway.</a> Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleocapsid+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+is+a+potent+human+CD8++T+cell+antigen+and+elicits+memory+responses.">The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses.</a> PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).</li><li>Schumacher, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+selection+by+MHC+class+I+molecules.">Peptide selection by MHC class I molecules.</a> Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Guo, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+length+peptides+bind+to+HLA-Aw68+similarly+at+their+ends+but+bulge+out+in+the+middle.">Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle.</a> Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).</li><li>Soloski, M. J., Metcalf, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+class+Ib+molecules+in+the+host+response+to+infection+with+Salmonella+and+its+relevance+to+autoimmunity.">The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity.</a> Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).</li><li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+endocytic+pathway+for+cross-priming+class+Ib+MHC-restricted+CD8alphaalpha+TCRalphabeta++T+cells+with+regulatory+properties.">Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties.</a> J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).</li><li>Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fine+specificity+of+the+immune+response+to+a+Plasmodium+falciparum+rhoptry+neck+protein,+PfAARP.">Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP.</a> Malar J. 15, 457 (2016).</li><li>Kambayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonclassical+MHC+class+I+molecule+Qa-1+forms+unstable+peptide+complexes.">The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes.</a> J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Burada, Qa-1 epitopları bir protein analizi için bir protokol anlatmıştık. Bu iletişim kuralı ile ilgili olarak çeşitli stratejiler de daha önce bildirildi. İlk, allojeneik CD8+ T hücre satırları ve klonlar Qdm1tanımlanması için kullanılmıştır. İkinci olarak, bir sözde Qa-1-bağlama motif Qdm analiz HSP60p216-224 ve TCRBV8.1 epitope9,18tanımlanması için kullanıldı. Üçüncüsü, bireysel örtüşen p...

Qa-1 (MHC-IB) molekülleri farelerde klasik olmayan MHC kompleksi 1b grubuna aittir. Onun insan homolog olan HLA-E. Önceki kanıt Qa-1 molekülleri önemli biyolojik fonksiyonları var göstermiştir. İlk olarak, Qa-1 molekülleri hücreler yapısal ve işlevsel bütünlüğü için Etüt önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, Qa-1 moleküllerin hücrenin normal işlevi izlemek için çeşitli stratejiler gelişmiştir. Bu tür bir strateji Qa-1 moleküllerine formu kompleksleri ile işlenmiş lideri peptid (epitope), endoplazmik retikulum1klasik MHC-IA molekülleri üzerinden işlenir Yani Qa-1 determinant değiştirici (Qdm) sağlar. Daha sonra bu Qa-1/Qdm komplekslerin bir hücre yüzeyinde görüntülemek ve NK hücreleri üzerinde inhibitör NKG2A reseptörleri etkinlik2öldürme NK etkisizleştirmek için bağlayın. MHC-IA molekülleri ifade kaybolursa, bir hücre (örneğin bir malign hücre) NK2öldürmek için duyarlı hale gelir. Diğer strateji yeni Qa-1/epitope kompleksleri eksik DOKUNUN (taşıyıcı antijen işleme ile ilişkili) bir hücre yüzeyinde oluşturmak Qa-1 molekülleri sağlar3 ve/veya ERAAP (ile ilişkili endoplazmik retikulum aminopeptidaz antijen işleme)4 (her iki eksiklikleri Malign hücrelerde genellikle oluşur). Bu yeni Qa-1/epitope komplekslerin ifade hücre daha sonra tanınan ve epitope özel Qa 1 kısıtlı CD8 tarafından ortadan+ T hücreleri. İkinci olarak, Qa-1 molekül immün yönetmelik5ikna etmek. Bu bağlamda, Qa-1/epitope kompleksleri CD8 uyarmak gösterilmiştir+ immün aracılı hasara öz-doku6,7,8 önlenmesi için önemlidir düzenleyici T (Treg) hücreleri ,9,10. Üçüncü olarak, Qa 1 kısıtlı CD8+ Treg hücreler viral enfeksiyon11karşı bağışıklık yanıtı sınırlamak için gösterilmiştir.
Bu nedenle, belirli büyütme epitope özgü Qa-1-restrictred CD8+ T hücreleri anormal hücreler ortadan kaldırılması, bağışıklık düzenleme geliştirme ve büyüklüğü kontrolünü potansiyel olarak umut verici bir strateji olduğunu immün yanıt-e doğru virüs kaynaklı. Süre o olup olmadığını tespit değil büyütme epitope özgü CD8 Qa 1 kısıtlı,+ T hücreleri bağışıklık gözetim geliştirmek ve virüs kaynaklı bağışıklık yanıtı sınırlamak, laboratuarlarımızda ve diğerleri bu açıkça göstermiştir Qa-1 epitopları ile bağışıklama Qa 1 kısıtlı CD8 fonksiyonu çoğaltmak+ Treg hücreler belirli patojenik otoimmün CD4 için+ T hücreleri CD4 verimli denetimine lider,+ T Hücre-aracılı otoimmün hastalıklarda bir hayvan çeşitli modeller deneysel Alerjik ensefalomiyelit (insan multipl skleroz bir hayvan modeli)6,10gibi kollajen kaynaklı artrit (bir hayvan modeli insan romatoid artrit)7, ve obez olmayan diyabet (bir hayvan modeli insan tip 1 diyabet)8. Buna ek olarak, biz bir doku özgü Qa-1 epitope ile bağışıklama immün aracılı iltihap o doku CD8 büyütme ile ayrıntılı denetim yol açar keşfettim+ Treg hücreler12. Preklinik çalışmalar yukarıdaki başarıları Qa-1 epitope bağışıklama immün aracılı doku özgü hastalıkların tedavisi için ve potansiyel DOKUNUN eksiklikleri ile ilişkili diğer hastalıkların tedavisi için tam bir değerlendirme için bir ihtiyaç gösterir ve ERAAP.
Buna göre güvenilir ve hızlı bir şekilde Qa-1 epitopları bir protein çözümleyebilirsiniz bir teknoloji için bir talep vardır. Bu bağlamda, biyolojik olarak önemli Qa-1 epitopları sınırlı sayıda tarif edilmiştir. Bu Qa-1 epitopları çoğunu serendipitously CD8 çalışma sırasında tespit edildi+ T hücre yanıt bakteri13, hücre DOKUNUN3' te eksik, hücreleri ERAAP4' te eksik ve EAE6, neden olan hücreleri 9. Bu nedenle, bir yüksek üretilen iş teknik biyolojik olarak önemli Qa-1 epitopları tanımlanmış bir protein tanımlanması için arzu edilir. Aşağıda, biz fonksiyonel Qa-1 epitopları Qa-1-resrticted CD8 kullanarak bir protein haritalar örtüşen bir peptid (OLP) Kütüphane strateji tanımlarlar+ T hücre hatları belirli bir protein OLP Havuzu (OLP_pool) için.

<table><tbody><tr><td>The protein to be analyzed</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sequence of the protein can be obtained from NCBI</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: D2650 SIGMA</td><td>DMSO should be sterile and cell culture tested.</td></tr><tr><td>K&lt;sup&gt;b-/-&lt;/sup&gt;D&lt;sup&gt;b-/-&lt;/sup&gt; mice</td><td>The Lackson Laboratory</td><td>Stock#: 019995</td><td>We used Taconic H2-K&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;H2-D&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt; doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.</td></tr><tr><td>AIM V Serum Free Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 12055091</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential Amino Acids</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11333D</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P-100</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat#: 150-4171</td><td></td></tr><tr><td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>Trasfer pipette</td><td>Globe Scientific</td><td>Mfg#: 137238</td><td></td></tr><tr><td>Murine M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 315-02</td><td></td></tr><tr><td>48-well tissue culture plates</td><td>USA Scientific</td><td>Cat#: CC7682-7548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: Z372129 Sigma</td><td></td></tr><tr><td>1ml deep 06-well PP plate, sterile</td><td>USA Scientific</td><td>Item#: 1896-1110</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine IL-2</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine IL-7</td><td>PeproTech</td><td>Cat#L: 217-17</td><td></td></tr><tr><td>Capture anti-IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>ELISPOT plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: S2EM004M99</td><td></td></tr><tr><td>C1R</td><td>ATCC</td><td>Cat#: ATCC CRL-1993</td><td></td></tr><tr><td>C1R.Qa-1&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)</td></tr><tr><td>Qa-1 lentiviral vector</td><td>GeneCopoeia</td><td>Product#: Mm02955</td><td></td></tr><tr><td>Detection anti-IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: P9416</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: BD557630</td><td></td></tr><tr><td>AEC substrate</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551951</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoSpot Analyzer</td><td>ImmunoSpot</td><td></td><td>Any immunoSpot analyer should work for this purpose.</td></tr></tbody></table>

overlapping peptide library to map qa-1 epitopes in a protein

Qa-1 (HLA-E insan) (MHC-IB) molekülleri klasik olmayan MHC kompleksi 1b grubuna aittir. Son veriler ortaya koymaktadır Qa-1 moleküller hücreleri yapısal ve işlevsel bütünlüğü için ölçme, bağışıklık yönetmelik inducing ve viral enfeksiyonlara karşı bağışıklık yanıtı sınırlayan önemli rol oynarlar. Ayrıca, Qa 1 kısıtlı CD8 fonksiyonel büyütme+ T hücreleri epitope bağışıklama birkaç otoimmün hastalığı hayvan modellerinde, örneğin deneysel Alerjik ensefalomiyelit, tedavi edici etkileri göstermiştir kollajen kaynaklı artrit ve obez olmayan diyabet. Bu nedenle, çok verimli ve hızlı bir şekilde işlevsel Qa-1 epitopları bir protein belirlemek için bir yöntem için acil bir ihtiyaç. Burada, Qa 1 kısıtlı CD8 kullanan bir iletişim kuralı tarif+ T hücre hatları belirli bir protein Qa-1 epitopları belirlenmesi için çakışan peptid (OLP) kitaplık. Bir protein tüm uzunluğu kapak 15-mer örtüşen peptidler bu OLP kitaplığı içerir ve bitişik peptidler 11 amino asitler tarafından örtüşmesi. Bu iletişim kuralını kullanan, biz son zamanlarda bir 9-mer Qa-1 epitope miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) olarak tespit edilmiştir. Bu yeni eşlenen MOG Qa-1 epitope epitope özgü, Qa 1 kısıtlı CD8 ikna etmek için gösterildi+ T hücreleri bu gelişmiş miyelin özgü bağışıklık yönetmelik. Bu nedenle, bu iletişim kuralını roman hedeflerinden gelecekteki inceleme ve CD8 Qa 1 kısıtlı işlevler için yararlıdır+ T hücreleri.

Tasarım bir protein tüm uzunluğu kapsayan bir OLP Kütüphanesi
N-terminus adlı bir protein başlamak, her peptid 15 amino asitler (15-mer) olur. Bu nedenle, ilk peptid pozisyonu 1 pozisyona 15 açıklıklı. N-terminus ikinci peptid, 11 amino asit tarafından ilk peptid C-terminus ile çakışıyor. Bu nedenle, ikinci peptid pozisyon 19 konuma 5 açıklıklı. Peptidler C-terminus protein (şekil 1</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein at JoVE.com

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 epitopları bir protein eşlemek için çakışan Peptide Kütüphane

Qa-1 (HLA-E insan) klasik olmayan MHC kompleksi 1b molekülleri bir gruba ait. Bağışıklama Qa-1-bağlama epitopları ile doku özgü bağışıklık yönetmelik çoğaltmak ve birkaç otoimmün hastalıkları iyileştirmek için gösterilmiştir. Burada biz bir protein Qa-1 epitopları tanımlanması için çakışan bir peptid Kütüphane strateji tanımlarlar.

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

overlapping-peptide-library-to-map-qa-1-epitopes-in-a-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.8K Görüntüleme.  Loma Linda University. Qa-1 (HLA-E insan) klasik olmayan MHC kompleksi 1b molekülleri bir gruba ait. Bağışıklama Qa-1-bağlama epitopları ile doku özgü bağışıklık yönetmelik çoğaltmak ve birkaç otoimmün hastalıkları iyileştirmek için gösterilmiştir. Burada biz bir protein Qa-1 epitopları tanımlanması için çakışan bir peptid Kütüphane strateji tanımlarlar.

Video: Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Biyokimya

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

Peptid diziler HLA Alloantibodies Organ nakli olarak algılanması için kişiselleştirilmiş

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly being extended to integrative studies to enhance the understanding of molecular dynamics within cells. Current tools for the visualization and integration of proteomics with other omics datasets are inadequate for large-scale studies. Furthermore, they only capture basic sequence identify, discarding post-translational modifications and quantitation. To address these issues, we developed PoGo to map peptides with associated post-translational modifications and quantification to reference genome annotation. In addition, the tool was developed to enable the mapping of peptides identified from customized sequence databases incorporating single amino acid variants. While PoGo is a command line tool, the graphical interface PoGoGUI enables non-bioinformatics researchers to easily map peptides to 25 species supported by Ensembl genome annotation. The generated output borrows file formats from the genomics field and, therefore, visualization is supported in most genome browsers. For large-scale studies, PoGo is supported by TrackHubGenerator to create web-accessible repositories of data mapped to genomes that also enable an easy sharing of proteogenomics data. With little effort, this tool can map millions of peptides to reference genomes within only a few minutes, outperforming other available sequence-identity based tools. This protocol demonstrates the best approaches for proteogenomics mapping through PoGo with publicly available datasets of quantitative and phosphoproteomics, as well as large-scale studies.

Here we present the proteogenomic tool PoGo and protocols for fast, quantitative, post-translational modification and variant enabled mapping of peptides identified through mass spectrometry onto reference genomes. This tool is of use to integrate and visualize proteogenomic and personal proteomic studies interfacing with orthogonal genomics data.

Translasyon modifikasyon ve varyant için hızlı ve nicel Yöntem peptidler genleri için eşleme etkin

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Genetik

Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science of investigating the composition of peptides presented by major histocompatibility complex (MHC) class I and class II molecules using mass spectrometry (MS) technology platforms. Among all the steps in an MS-based immunopeptidomics workflow, sample preparation is critically important for capturing high-quality data of therapeutic relevance. Here, step-by-step instructions are described to isolate MHC class I and II-associated peptides by immunoaffinity purification from quality control samples, from mouse (EL4 and A20), and human (JY) cell lines more specifically. The various reagents and specific antibodies are thoroughly described to isolate MHC-associated peptides from these cell lines, including the steps to verify the beads-binding efficiency of the antibody and the elution efficiency of the MHC-peptide complexes from the beads. The protocol can be used to establish and standardize an immunopeptidomics workflow, as well as to benchmark new protocols. Moreover, the protocol represents a great starting point for any non-experts in addition to foster the intra- and inter-laboratory reproducibility of the sample preparation procedure in immunopeptidomics.

Here, we present a protocol for the purification of MHC class I and class II peptide complexes from mouse and human cell lines providing high-quality immunopeptidomics data. The protocol focuses on sample preparation using commercially available antibodies.

İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that may facilitate the development of vaccines and peptide drugs. Peptide scanning is a simple and efficient method that straightforwardly maps the linear epitope recognized by a monoclonal antibody (mAb). Here, the authors present an epitope determination methodology involving serially truncated recombinant proteins, synthetic peptide design, and dot-blot hybridization for the antigenic recognition of nervous necrosis virus coat protein using a neutralizing mAb. This technique relies on the dot-blot hybridization of synthetic peptides and mAbs on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The minimum antigenic region of a viral coat protein recognized by the RG-M56 mAb can be narrowed down by step-by-step trimmed peptide mapping onto a 6-mer peptide epitope. In addition, alanine scanning mutagenesis and residue substitution can be performed to characterize the binding significance of each amino acid residue making up the epitope. The residues flanking the epitope site were found to play critical roles in peptide conformation regulation. The identified epitope peptide may be used to form crystals of epitope peptide-antibody complexes for an x-ray diffraction study and functional competition, or for therapeutics.

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Biyoloji

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Biyomühendislik

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Source: Cornett, E. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55912">Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody&#39;s specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

Antikorların Özgüllük Profili için Bir Peptit Mikroarray Teknolojisi

1. Designing the Array Slide and Source Plate Layout

	Under the &#39;Plan a slide layout&#39; heading on the ArrayNinja interface, click on the link that ...