Bu eser grant altında finansal destekle Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) No oluşturuldu PO413/12-1 ve LA 1028/7-1.

<ol>
	<li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip+developments:+a+translational+cutting-edge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man?.">Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?.</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro.">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).</li><li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface.">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).</li><li>Cannon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+epidermal+model+for+dermal+irritancy+testing.">New epidermal model for dermal irritancy testing.</a> Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).</li><li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phenion+Full-Thickness+Skin+Model+for+Percutaneous+Absorption+Testing.">The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing.</a> Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).</li><li>Netzlaff, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+reconstructed+human+epidermis+model+Episkin+in+comparison+to+various+human+skin+preparations.">Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).</li><li>Bran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Discriminative+Criterion+for+the+Development+of+Franz+Diffusion+Tests+for+Transdermal+Pharmaceuticals.">A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals.</a> J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).</li><li>Pineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+percutaneous+absorption+of+aluminum+from+antiperspirants+through+human+skin+in+the+Franz+diffusion+cell.">In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell.</a> J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).</li><li>Filon, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+percutaneous+absorption+of+cobalt.">In vitro percutaneous absorption of cobalt.</a> Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).</li><li>Ng, S. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Static+Franz+Diffusion+Cell+System+for+In+Vitro+Permeation+Studies.">Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies.</a> AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).</li><li>Bonferoni, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Franz+Diffusion+Cell+for+Simultaneous+Assessment+of+Drug+Release+and+Washability+of+Mucoadhesive+Gels.">A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels.</a> Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).</li><li>Seiffer, S., Oppermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+FRAP+experiments+performed+in+a+confocal+laser+scanning+microscope.">Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope.</a> J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).</li><li>Pluen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Macromolecules+in+Agarose+Gels:+Comparison+of+Linear+and+Globular+Configurations.">Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations.</a> Biophys J. 77, 542-552 (1999).</li><li>Cornelissen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+measurements+in+epidermal+tissues+with+fluorescent+recovery+after+photobleaching.">Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching.</a> Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).</li><li>Pirot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+permeability+barrier+of+human+skin+in+vivo.">Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo.</a> PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).</li><li>Tetteh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+examination+of+skin+diffusion+using+FTIR+spectroscopic+imaging+and+multivariate+target+factor+analysis.">Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis.</a> Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).</li><li>Guldbrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+fluorescence+correlation+spectroscopy+as+a+tool+for+measuring+molecular+diffusion+within+human+skin.">Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin.</a> Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Veronike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Organization+and+Differentiation+of+HaCaT+Keratinocytes+in+Organotypic+Coculture+with+Human+Dermal+Fibroblasts.">Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).</li><li>Moraes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Three-Dimensional+Cell+Culture+to+Organs-on-Chips.">From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture.">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-organ+chip+co-culture+of+neurospheres+and+liver+equivalents+for+long-term+substance+testing.">A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing.</a> J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).</li><li>Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing+-+organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput.">Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).</li><li>Jayakrishna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+High+Molecular+Weight+Compounds+through+Sclera.">Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera.</a> IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).</li><li>Peck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+Diffusion+of+Polar+Molecules+Through+and+Effective+Pore+Radii+Estimate+of+Intact+and+Ethanol.">Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol.</a> Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).</li><li>Ogiso, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+Enhancement+Effect+of+n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside+on+the+Transdermal+Penetration+of+Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Dextrans+and+the+Molecular+Weight+Dependence+of+Water-Soluble+Penetrants+through+Stripped+Skin.">Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin.</a> J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).</li><li>Hadgraft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin,+the+final+frontier.">Skin, the final frontier.</a> Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).</li><li>Asselineau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Epidermis+Reconstructed+by+Culture:+Is+It+"Normal"?.">Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"?.</a> J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).</li><li>Casasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+differentiation+in+a+model+of+human+skin+equivalent.">Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent.</a> Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Laurent, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Dextran+in+Concentrated+Solutions.">Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions.</a> Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).</li><li>Metzler, R., Klafter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+random+walk's+guide+to+anomalous+diffusion:+A+fractional+dynamics+approach.">The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach.</a> Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).</li></ol>

Uwe Marx'ın yönetim kurulu başkanı ve bir hissedar ve Gerd Lindner hissedarlarından biri TissUse GmbH, imalat ve MOC teknoloji Ticarileştirme şirketi. Diğer yazarlar bu kağıt yayınlanması ile ilgili hiçbir çatışması beyan ederim.

Bu çalışmada bir membran üzerinde mühendislik bir doku yapısı sayesinde nüfuz ölçmek için geliştirilmiş bir yöntem belgeleri. Moleküler boyutları özel jel arasında değişen maddelerin nüfuz önce sınamak ve doğrulamak belgili tanımlık yöntem ve ilgili simülasyon için incelenmiştir. İyi küçük moleküller daha hızlı bir matris mesh (dışında jel filtrasyon geçirgenlik Kromatografi tarafından yürürlükte) üzerinden nüfuz bilinmektedir. Benzer gözlemler sklera26, insan epidermal membran27, insan derisi17ve sıçan cilt28aracılığıyla maddelerin boyutu-dışlama deneyler yapılmıştır. Geçirgenlik katsayıları ve karşılık gelen Stokes RADIUS (aynı Difüzyon oranı olarak açıklanan, genellikle etkili RADIUS molekülün daha küçük moleküller ile hareket eden sert kürenin yarıçapı) arasında ters bir ilişki gösterilmiştir 26 , 28ve benzer bir ilişki deneylerde farklı moleküler boyutta maddeler ile gözlenen. Geçirgenlik katsayıları 1/Stokes RADIUS komplo tarafından en küçük moleküler boyutta dört gruba üzerinden doğrusal bir ilişki bulundu (R2 0.93 =) (şekil 6). Bu önerilen yöntemi ile simüle geçirgenlik katsayıları gerçekçi bir aralıkta olduğunu gösterir.
Deneylerde %46.15 Franz Difüzyon hücre sistem10ile permeabilite deneyleri için rapor daha biraz daha büyük bir hatadır. Tek mantıklı açıklama floresein-isothiocyanate-hangi daha sonra ele dextran, boyut dağılımı olabilir.
Açıklanan yöntemi önemli avantajları Franz Difüzyon hücre sistemini kullanarak yöntemlere göre vardır. İlk olarak, kurulum daha küçüktür; deneyler ticari iyi plaka (∼ 13 cm x 8,5 cm) ölçeğe sahip doğrudan bir membran Ekle sistemi içinde yürütülür. Ayrı bir Franz Difüzyon hücresine her örnek için gereklidir, ancak bu aynı zamanda, çalıştırılacak birden çok örnekleri sağlar. İkinci olarak, bir deri model geçirgenliği nerede ekimi gerçekleşir membran INSERT doğrudan ölçülebilir. Franz Difüzyon hücreleri kullanarak, örnekleri çıkarıldı ve küçük örnekler için daha ağır olduğunu ve aynı zamanda daha uzun sürmesine sisteminde, monte gerekir.
Kollajen hücre matrisler ile nüfuz deneyler bu yöntem başarıyla cep numaralı seribaşı sistemlere uygulanması gösterdi. Burada sunulan model deri modelleri için doğrulandı; Ancak, yöntem organik hücre kültürleri, örneğin, böbrek veya karaciğer, diğer türleri için uygulanabilir.
Bu çalışmada, HaCaT hücreleri tamamen modeli yüzeyi kaplı bir kollajen-hücre modeli kullanılmıştır (bkz şekil 5). Permeabilite katsayısı, permeabilite katsayısı bir kollajen-hücre modeli olan ve olmayan HaCaT tabakası arasında ayırt etmek için hassas yöntemdir gösteren bir azalma olmuştur. İdeal olarak, bir deri model bir gerçek deri29epidermis yaklaşımları, bir bariyer kadar inşa etmeli ve bu nedenle gerçek kullanmadan önce cilt modeli kalitesini (örneğin, DermIS, epidermis bina) doğrulamak önemlidir. Bir deri model geliştirme teknikleri boyama ile görüntülenir ve cilt protein ve kollajen30,31,32algılama sayılabilir. Permeabilite katsayısı cilt modeli geliştirilmesi değerlendirmek için önemli bir faktör de kullanabilirsiniz, ancak daha fazla deneyler bundan emin olmak için gerekli. Daha önce belirtildiği gibi bu yöntem, paralel olarak birden çok örnekleri çalışan sağlar. Örnekleri geçirgenliği ölçmek ve böylece bu parametre cilt modelinin geliştirilmesi gözlemlemek için işleme sırasında almak mümkündür.
Geçirgenliği bir jel/kollajen-cep-model ve bir membran ile aynı anda ölçülen belirtmek gerekir. Algılanan permeabilite katsayısı sistem sayede farklı cilt modelleri sonuçlarını yalnızca aynı membran Ekle kullanırken karşılaştırılabilir, özeldir. Ayrıca, test madde yalnızca modeli aracılığıyla nüfuz ve değil yanındaki, hangi hataları ölçülen geçirgenliği ikna etmek sağlamak için tüm yetiştirme alanı kapsayacak şekilde cilt modeline ihtiyacı var. Gelecekte deneyler düşünülmesi gereken başka bir cilt çevreleyen doğal çevrenin yönüdür. Normalde, deri yüzey sıcaklığını Permeasyon koşulları etkileyebilecek iç bölge ile karşılaştırıldığında düşüktür.
Laboratuvar deneyleri bilgisayar simülasyonları ile hizalamak üzere uygulanan simülasyon için parametre optimizasyon sağlayan bir yöntem sunuldu. Simülasyonlar küçük moleküler boyutu olan maddeler için deneysel verilerle de aynı tarihte bulundu. Ancak, simülasyon ve deneysel veriler arasındaki sapmalar daha büyük moleküler boyutu olan maddeler için tespit edildi. Büyük polisakkarit moleküller sürtünme artırmak ve ağır bir jel Difüzyon sürecinde ol. Bu etkisi deneysel arasındaki olası bir neden olan anormal difüzyon, neden olur ve simülasyon değerlere33,34. Başka bir açıklama daha küçük veya daha büyük partiküller floresein-isothiocyanate-dextran varlığı olabilir. Üretici maddenin molekül ağırlığı ortalama boyutu ile bulunması daha küçük ve daha büyük partiküller sağlar belirli bir Aralık olarak belirtir. Daha küçük partiküller daha hızlı jel ve sıvı kanal nüfuz olarak da ne kadar dağınık bu maddelerin çoğu, belli değil. Bu Difüzyon ve sürtünme etkileri göz önünde bulundurulacak simülasyon uzatmak mümkündür.
Geçirgenlik deneyi ve simülasyon 2 kille olarak kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Simülasyon yardımıyla, bu deneysel yöntem doğrudan daha sofistike deneysel kurulumları için transfer edilebilir. Örneğin, membran ekleme sistemi simülasyon geometri 2 OC veya benzer set-up diğer sistemlerle kolayca aktarılabilir. Simülasyon oransal bu seçeneği gelecekteki deneyler tasarımını desteklemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, yan etkileri buharlaşma, anormal Difüzyon ve membran efektler gibi böylece doğruluğu artırma simülasyon, geliştirmek için entegre edilebilir. Simülasyon programı değiştirmek veya simülasyon denklem cilt modeli geliştirme diğer yönleri araştırmak için fiziksel diğer modüller entegre olarak geliştirmek için fırsat verir. Bir örnek glikoz tüketimi ve laktat üretimi bir kollajen hücre modeli simülasyonudur.
Tıbbi maddeler test özellikle ilginç bir yönü maddeler bir organ-on-a-chip sisteminde nasıl dağıtıldığını var. Cevap için yardımıma sorular ne kadar hızlı gibi bir madde içine belgili tanımlık sistem nüfuz simülasyon ve geçirgenliği parametre yanı sıra hangi konsantrasyon diğer dokularda bir multi-organ-çip için geçerli olacak. Bu yöntem destek ve geliştirme ve sınama gibi organ-on-chip sistemleri geliştirmek.

Organo-tipik 3D kültürler için güçlü araçlar ilaç geliştirme ve1test madde haline gelmiştir. Bu bağlamda, insan derisi modellerdir bu kozmetik sektöründe gibi düzenleyici şartları nedeniyle özel ilgi. Onlar daha sonra kullanılmak üzere ya olarak kendi tek organ kültürleri çok iyi plakaları veya multi-organ-cips ek organ modelleri, örneğin, karaciğer2ile birlikte çok sayıda 3B cilt modelleri geliştirilmesi açmıştır.
Cilt eşdeğer tarımı ile ilgili olarak, hava-sıvı arayüzey (ALI) uygun epidermal farklılaşma3için gerekli bir öğedir. Hücre kültür ekler altındaki sıvı geçirgen bir zar ile bir gemi oluşan genellikle bir ALI kurmak için kullanılır. Alış 12-iyi (12.2 mm çapında) tabak kadar piyasada bulunan deri modelleri EpiDerm4, Phenion5ve Episkin6, Cilt modelleri 96-iyi (çapı 4,26 mm) arası bedenleri ile kültür gibi yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada açıklanan yöntemi maddelerin nüfuz bir membran Ekle sisteminde belirler.
Permeabilite katsayısı doğal cilt5' e göre kültürlü herhangi bir cilt model kalitesini değerlendirmek için önemli bir parametredir ve nasıl hızlı bir şekilde değerlendirmek için kullanılan aktif maddeler deri yoluyla geçiş. Bu parametre özellikle cilde uygulanan ilaçlar ya da kozmetik ürünler ihtiyacınız varsa, tam olarak etkin aracılar üzerinden geçirdiğinizde anlamak önemlidir. Bir simülasyon daha fazla sistem davranışını tahmin etmek ve daha sonra gerekli zaman alıcı deneysel çaba azaltmak için yardımcı olabilir, özellikle büyük bir set ne zaman maddeler yer almaktadır.
Franz Difüzyon hücre Permeasyon cilt ile deneyler ve cilt5,6,7,8,9modelleri state-of--art belirtilir. Bu aygıt sabit örnek (Difüzyon bariyer) ile iki bölmeleri arasında oluşur. Test edilecek madde örnek (donör bölme) tepesine doğrudan uygulanır ve ilk bileşik toplama ters (alıcısı) yuvası üzerinde tespit edilebilir. Alıcısı tarafında sabit sıcaklık ve homojen madde konsantrasyonu sıcaklık odası ve bir manyetik karıştırıcı sağlanır. Örnekler bir örnekleme kol Franz hücre alıcısı tarafında alınabilir. 19 cm ve 179 cm arasında bir yükseklik aralığı ile bu nispeten büyük10,11sistemidir. Difüzyon katsayıları jel benzeri maddeler ve dokuların tespiti için başka bir yöntem sıkı BAĞLAMAK 's. Bu teknik ağartma prensibi fluorescently jel ve ağartılmış çevrenin kurtarma süresini belirleme parçacıklar etiketli Difüzyon katsayısı12,13,14hesaplamak için kullanır.
Ayrıca, Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi ile kızılötesi ışık Absorbans parçacık hareketi algılamak için cilt15,16maddelerin nüfuz işlemi belirlemek için kullanılabilir. Her nasıl, bunlar veya diğer görüntüleme yöntemleri (örneğin, İki fotonlu Floresans korelasyon spektroskopi17) yoğun aletleri fiyat.
Bu makalede, bir yöntem bir membran ekleme sistemi içinde bir bariyer geçirgenliği nerede deri manken ekili olabilir doğrudan ölçmek için sunulur. Bu yöntem, çok sayıda küçük örnekleri (4,26 mm de boyutu kadar) ile kompakt bir sistemde çalışmasına permeabilite deneyleri sağlar. Burada ayrı bir aygıt üstünde belgili tanımlık aygıt takılacak olan her sonda için gereklidir ve küçük örnekleri (4,26 mm boyut) için fark etmek zordur Franz Difüzyon hücre aksine bu. Yöntem büyük araçları (örneğin, confocal veya multiphoton mikroskop) gerektirmez, Ayrıca, zaman ve maliyet bir azalma elde edilir.
Tüm deneyler gözenekli membran içinde gerçekleştirilen özel jel veya membran üzerinde kurulan bir kollajen hücre modeli içeren sistemleri ile bir örnek (bariyer) yerleştirin. Moleküler boyutları değişen floresan maddeler (donör) örnek tepesine uygulandı ve nüfuz madde konsantrasyonu Floresans plaka okuyucu kullanarak altta (alıcısı) tespit edildi (bkz. şekil 1). Yöntem doğrulamak ve bu simülasyon doğruluğunu sınamak için özel jelleri üretilen ve bir engel olarak kullanılır. Hydrogels Genel Biyoloji Bilimleri13gözenekli ortamda Difüzyon ve Permeasyon işlemlerinde incelenmesi için kullanılır. Yöntem sonra bir basitleştirilmiş cilt modeli18,19 olan kollajen matrisi birincil fibroblastlar ve insan yetişkin düşük kalsiyum yüksek sıcaklık keratinositler (HaCaT) hücreleri (hücre-matris model), oluşan hücre numaralı seribaşı bir sistem test edildi .
Ayrıca, nüfuz işlemi aracılığıyla akış simülasyonlar Hesaplamalı akışkanlar dinamiği ile simüle. Bu parametre optimizasyon yoluyla, deneysel verilerden Difüzyon katsayısı hesaplanması, bulundu. Genel olarak, bu simülasyon farklı uygulamalar sunar; Örneğin, üzerinde kısa deney temelinde bir nüfuz işlem tahmin etmek mümkündür ve simülasyon deneyler sayısını önemli ölçüde azaltabilirsiniz.
Deneysel yöntem ve simülasyon bir organ-on-a-chip sistem1,20,21uygulama için tasarlanmış, özellikle 2-organ-çip (2-OC) ticari olarak1,22geliştirilen, 23,24,25. Prensip olarak, membran Ekle sistemlere dayalı herhangi bir organ modeli Permeasyon süreci bu şekilde tanımlanabilir.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>High Resolution Powder</td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Collagen R solution 0.4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>High Glucose with L-Glutamine</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Fluorescein Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>no calcium, no magnesium , with phenol red</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>granulated</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>tablets</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>with EDTA</td></tr></tbody></table>

a method for determination and simulation of permeability and diffusion in a 3d tissue model in a membrane insert system for multi-well plates

Vitro ekili cilt modelleri eczacılık ve kozmetik uygulamaları için giderek ilgili olmuştur ve aynı zamanda ilaç geliştirme yanı sıra madde test kullanılır. Bu modeller çoğunlukla membran ekleme sistemleri, onların geçirgenliği farklı maddelerin önemli bir faktör olan doğru ekili. Genellikle, bu parametrelerin belirlenmesi için uygulanan yöntemler genellikle büyük örneklerin boyutu (örneğin, Franz Difüzyon hücre) veya zahmetli donanımları (örneğin, photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) sonra Floresans kurtarma) gerektirir. Bu çalışmada geçirgenlik katsayıları doğrudan membran-INSERT sistemlerinde 4,26 mm ve 12.2 mm (yetiştirme alanı) çapı boyutları ile belirlemek için bir yöntem sunar. Yöntem özel ve kollajen jelleri gibi cilt modelleri temsil eden bir kollajen hücre modeli ile doğrulandı. Farklı moleküler boyutta ve Permeasyon (kollajen jel, fibroblast ve HaCaT oluşan) farklı hücre modelleri aracılığıyla maddelerin nüfuz işlemler doğru bir şekilde açıklanmıştır.
Ayrıca, yukarıda deneysel yöntem desteklemek için bir simülasyon kurulmuştur. Simülasyon küçük moleküler boyutta maddeler için iyi deneysel veriler kadar 14 x 10-10 m Stokes RADIUS ile uyar (4.000 MW), ve bu nedenle sistem açıklamak için bir gelecek vaat eden bir araçtır. Ayrıca, simülasyon deneysel çalışmaları önemli ölçüde azaltabilir ve genişletilemez veya daha karmaşık kurulumları için uyarlanmış için sağlamdır.

Bir simülasyon doğruluğunu değerlendirmek için bir engel yürütülen gibi bir 96-şey zar geçirgenliği deneyler % 2 özel jel sistemiyle yerleştirin. Fluoresein sodyum tuzu (binek) ve floresein isothiocyanate-dextranes (FD) 45 x 10-10 m Stokes RADIUS (376.27-40,000 mol wt) ile 5 x 10-10 m akışkanın maddenin moleküler boyutu etkisini doğrulamak için kullanılmıştır. Simülasyon'ın yerel parametre optimizasyonu simülasyon deneysel verilere uyacak şekilde kullanıldı.
Bu amaçla, sadece doğrusal parçaları simüle geçirgenliği yamaçları deneysel sonuçlar karşılaştırıldı. Küçük moleküler boyutları için simülasyon ve deneysel veriler (bkz. şekil 4a ve 4b rakam) iyi sözleşmede %99,2 için binek ve %80.2 FD 4.000 için... Daha büyük moleküler boyutu yüksek sapmalar korelasyon %50,5 FD 10.000, %79.7 FD 20.000 için ve %53.6 FD 40.000 için gösterilen oluşturulan. Simülasyonlar ilerlemesinde eğri bir gecikme başlangıç ve grafikler (bkz. şekil 4 c-4e) daha fazla seyri daha güçlü bir artış gösterdi.
Geçirgenlik katsayıları ve simüle Difüzyon katsayıları are göstermek içinde Tablo 4. Permeasyon katsayısı ile artan moleküler boyutu azalır. Standart sapma olduğunu 0,47 x 10-8 m/s arasındaki 0.08 x 10-8 m/s (N = 7), hangi denk %4,18 % 46.15 arası mutlak bir hata için. Büyük moleküllerin ile deneyler büyük mutlak hata gösterdi. Simüle Difüzyon katsayıları çok benzer şekilde deneysel geçirgenlik katsayıları için davrandım. Daha büyük Stokes yarıçapı maddelerle gösterdi azalan Difüzyon katsayıları ve mutlak hata %9,09 ve %18.46 arasında değişmektedir (N = 3).
Engelleri bir 12-şey zar içinde sistem eklerken ek Permeasyon deneylerde, dört farklı kollajen hücre modeli türleri kullanılmıştır. Bu modeller bir boş hücre modeli ve kollajen jel ve HaCaT birincil fibroblastlar yüzeyi farklı kombinasyonları ile bir hücre modeli oluştururlar. Aşağıdaki kombinasyonları kullanılmıştır: kollajen (Albay) olarak bir boş hücre modeli, kollajen + fibroblastlar (Albay + F.), kollajen HaCaT (Albay + H.) ve kollajen fibroblastlar +++ HaCaT (Albay + F. + H.). Fluoresein sodyum tuzu DMEM + % 10 FCS ile verici madde olarak kullanılmıştır. Görüntü için analiz Hematoksilen ve Eozin (o) ile boyama kollajen hücre modeli kullanılmıştır. Bu boyama yapıldı üreticinin iletişim kuralını kullanarak. Şekil 5' te, leke temsilcisi Albay + F. + H. modeli ile gösterilir. O biraz kollajen matris doku yapısını leke bırakır. Fibroblastlar matris içinde bulunan ve fibroblast ve HaCaT hücrelerinin çekirdekleri içinde koyu mor lekeli. Kollajen matris üstüne kapsayan bir katman modelinin üst kısmında bina HaCaTs, çekirdekleri olmalıdır birçok çekirdek içeren bir katman vardır.
Tablo 5' te, deneysel Permeasyon katsayıları ve simüle Difüzyon katsayıları listelenmektedir. Bir eğilim HaCaT olmayan modeller ile karşılaştırıldığında daha düşük Permeasyon/Difüzyon katsayıları var HaCaT, modelleriyle çoğu için görülebilir. 10,9 %24,4, nüfuz katsayıları mutlak hatadır ve için Difüzyon katsayıları %5.2-% 12.9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> Resim 1: bir membran geçirgenliği deneyde yan görünüm ekleme sistemi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> Resim 2: bir geçirgenlik deneyi örnek grafiğin. Alıcısı konsantrasyon zaman içinde çizilir. İki kesik çizgiler grafik yaklaşık doğrusal parçası braketi. Doğrusal bölümü eğimi permeabilite katsayısı belirlemek için kullanılır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> Şekil 3: geometri ve membran mesh simülasyon sistemi takın. (bir) 96-şey zar geometrisini ekle sistem. (b) 12-şey zar geometrisini ekle sistem. (c) 96-şey zar Mesh ekle sistem. (d) 12-şey zar Mesh ekle sistem. (e) kesit ve membran parametreleri ekleme sistemi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> Şekil 4: Permeasyon deneme deneysel veriler için en iyi duruma getirilmiş simülasyon karşılaştırılması. (bir) fluoresein sodyum tuzu, (b) floresein isothiocyanate-dextran 4.000 mol WT, (c) 10.000 mol WT, (d) 20.000 mol WT ve (e) 40.000 mol WT <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> Şekil 5: temsilcisi HE kollajen hücre modeli (kollajen + fibroblastlar + HaCaT) boyama. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> Şekil 6: permeabilite katsayısı 1/Stokes RADIUS fluoresein sodyum tuzu ve floresein isothiocyanate-dextran bir 96-şey zar kullanma bir fonksiyonu olarak ekleme sistemi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td>Experession için iyi sisteminde 96 mm</td>
			<td>12-şey sistemi mm için Experssion</td>
			<td>Açıklama</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [mm]</td>
			<td>14,7 [mm]</td>
			<td>Kuyu çapı</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12,1 [mm]</td>
			<td>Membran çapı</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [mm]</td>
			<td>21,97 [mm]</td>
			<td>Alıcısı çapı</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>Yükseklik bariyer</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>Mesafe arasında iyi ve alt</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4,73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>Alıcısı, yüksek</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>Daldırma derinlik</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>RADIUS daldırma Ball+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-pozisyon daldırma topun+
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: geometri parametreleri "Kimyasal türler taşıma" simülasyon için. + 96 şey zar jel sadece özel simülasyon için kullanılmak üzere sistem yerleştirin.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td>İfade</td>
			<td>Değer</td>
			<td>Açıklama</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0,1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Fl.So konsantrasyon.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [mg/ml] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>0,5 mol/m2</td>
			<td>FD 4.000 konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>0.2 mol/m2</td>
			<td>FD 10.000 konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0,1 mol/m2</td>
			<td>FD 20.000 konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>0.05 mol/m2</td>
			<td>FD 40.000 konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>1e - 9m2/s</td>
			<td>Su karıştırma Difüzyon katsayısı</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: "Kimyasal türler taşıma" simülasyon fiziksel parametreleri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td>İfade</td>
			<td>Açıklama</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>Alıcısı konsantrasyon tanımı</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>D faktör değişikliği</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Parametreler için "En iyi duruma getirme" simülasyon.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nüfuz</td>
			<td>Permeabilite katsayısı (m/s) x 10-8</td>
			<td>Difüzyon katsayısı (m/s2) x 10-10</td>
			<td>Stokes yarıçap permeate (m) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4.79 ± 0,20</td>
			<td>1,94 ± 0.34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4.000</td>
			<td>2.37 ± 0.31</td>
			<td>0.65 ± 0,12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1,67 ± 0,47</td>
			<td>0.22 ± 0,02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20.000</td>
			<td>0.65 ± 0,30</td>
			<td>0.29 ± 0,04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40.000</td>
			<td>0,27 ± 0,08</td>
			<td>0.14 ± 0,02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: geçirgenliği ve Difüzyon katsayısı % 2 özel jel + bir 96-şey zar membran aracılığıyla farklı Stokes RADIUS içeren maddelerin ekleme sistemi. (fluoresein sodyum tuzu Fl. yani, FITC dextran = FD =).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modeli</td>
			<td>Permeabilite katsayısı (m/s) x 10-8</td>
			<td>Difüzyon katsayısı (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albay</td>
			<td>2,18 ± 0,29</td>
			<td>1.22 ± 0,06</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albay + F.</td>
			<td>1.77 ± 0,38</td>
			<td>0,93 ± 0,12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albay + H.</td>
			<td>1,64 ± 0,40</td>
			<td>0,96 ± 0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albay + F. + H.</td>
			<td>1.65 ± 0.18</td>
			<td>0,88 ± 0,11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 5: fluoresein sodyum tuzu kollajen hücre modeli bir 12 üzerinden geçirgenliği ve Difüzyon katsayısı-şey zar sistemi Ekle (Albay = kollajen, Fibroblast, H. F. = HaCaT =).

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates at JoVE.com

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

Bir membran geçirgenliği belirlenmesi için bir yöntem eklemek çok iyi plakaları için sistem ve silico parametre optimizasyonu simülasyon kullanarak Difüzyon katsayıları hesaplanması için sunulmaktadır.

Bir yöntem belirleme geçirgenliği ve Difüzyon bir zarda bir 3D doku modelindeki simülasyonu için ekleme sistemi çok iyi kaplamalar için

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

a-method-for-determination-simulation-permeability-diffusion-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K Görüntüleme.  Hamburg University of Technology. Bir membran geçirgenliği belirlenmesi için bir yöntem eklemek çok iyi plakaları için sistem ve silico parametre optimizasyonu simülasyon kullanarak Difüzyon katsayıları hesaplanması için sunulmaktadır.

Video: A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Kanser Araştırmaları

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Biyomühendislik

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

Mikrovasküler Endotel Hücreleri Ile Mikrobiyal Traversal ile Kan-Beyin Bariyerinin Geçirgenliğinin Analizi

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

İmmünofloresan Boyama ile Kan-Beyin Bariyer Modellerinin Analizi

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Yazar Spotlight: İnsan Dokularını İncelemek için Doku Çipi Teknolojisinin Kullanımını Geliştirme 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Açık Kuyu ve Mikroakışkan Modlarına Sahip Yeniden Yapılandırılabilir Bir Bariyer Doku Platformu

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

Yazar Spotlight: İnsan Bariyer Dokusunu Taklit Etmek İçin Benzersiz Bir Modüler Mikrofizyolojik Sistem Geliştirme

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.

Statik Bariyer Doku Modellerinin Dinamik Mikrofizyolojik Sistemlere Dönüştürülmesi

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

Bir yöntem belirleme geçirgenliği ve Difüzyon bir zarda bir 3D doku modelindeki simülasyonu için ekleme sistemi çok iyi kaplamalar için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST