Este trabalho foi criado com o apoio financeiro da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sob concessão não. PO413/12-1 e LA 1028/7-1.

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Uwe Marx é o CEO e acionista e Gerd Lindner é uma acionista da TissUse GmbH, uma empresa de fabricação e comercialização da tecnologia MOC. Outros autores não declaram nenhum conflito de interesses sobre a publicação deste artigo.

Este estudo documenta um método desenvolvido para quantificar a permeação através de uma construção de tecido projetada numa membrana. Permeação de substâncias com diferentes tamanhos de moleculares através do gel do agarose analisou-se primeiro para testar e validar o método e a simulação correspondente. É sabido que moléculas menores permeiam mais rápido através de uma malha de matriz (com exceção do efeito em gel filtração por cromatografia de permeabilidade). Observações semelhantes foram feitas com experimentos de tamanho-exclusão de substâncias através da esclera26, membrana epidérmica humano27, pele humana17e de pele de rato28. Uma correlação inversa entre coeficientes de permeabilidade e o correspondente raio de Stokes (o raio de uma esfera dura que se move com a mesma taxa de difusão, como as moléculas descritas, geralmente menores do que o raio eficaz da molécula) tem sido demonstrado 26 , 28e uma relação semelhante foi observada em experimentos com substâncias de diferentes tamanhos moleculares. Plotando-se os coeficientes de permeabilidade ao longo do raio 1/Stokes, verificou-se uma correlação linear sobre os quatro grupos, com o menor tamanho molecular (R2 = 0,93) (Figura 6). Isso indica que coeficientes de permeabilidade simulado com o método sugerido estão em uma escala realista.
O erro de 46.15% nos experimentos é ligeiramente maior do que o relatado por experimentos de permeabilidade com o Franz difusão celular sistema10. Uma explicação possível seria a distribuição de tamanho de fluoresceína-isotiocianato-dextrano, que é discutido mais tarde.
O método descrito tem importantes vantagens em comparação com métodos usando o sistema de célula de difusão de Franz. Em primeiro lugar, a instalação é mais compacta; os experimentos são executados diretamente em um sistema de inserção de membrana, que tem a escala de uma placa bem comercial (∼ 13 x 8,5 cm). Isso permite que várias amostras para serem executados simultaneamente, Considerando que uma célula de difusão de Franz separada é necessária para cada amostra. Em segundo lugar, a permeabilidade de um modelo de pele pode ser medida diretamente na inserção da membrana, onde se realiza o cultivo. Usando células de difusão de Franz, as amostras têm de ser retirado e montado sobre o sistema, que é mais complicado para pequenas amostras e também é mais demorado.
Experimentos de permeação com matrizes de células de colágeno mostraram que esse método pode ser aplicado com sucesso em sistemas celulares-semeado. O modelo apresentado aqui foi verificado para os modelos de pele; no entanto, o método pode ser aplicado a outros tipos de culturas de células orgânicas, por exemplo, renal ou hepática.
Neste estudo, um modelo de colágeno-celular foi usado no qual as células HaCaT coberto completamente a superfície do modelo (ver Figura 5). Isto levou a uma redução do coeficiente de permeabilidade, demonstrando que o método é sensível o suficiente para distinguir o coeficiente de permeabilidade entre um modelo de colágeno-célula com e sem uma camada de HaCaT. Idealmente, um modelo de pele deveria construir uma barreira, que se aproxima da epiderme de uma verdadeira pele de29, e, portanto, é importante verificar a qualidade (e.g., edifício da derme, epiderme) do modelo da pele antes da utilização real. O desenvolvimento de um modelo de pele pode ser visualizado com técnicas de coloração e quantificado de detecção de pele proteína e colágeno30,31,32. O coeficiente de permeabilidade também pode ser um fator importante para avaliar o desenvolvimento do modelo de pele, mas ainda mais experimentos são necessários para confirmar isto. Como mencionado anteriormente, este método permite que várias amostras em execução em paralelo. Também é possível tirar amostras durante o cultivo para medir a permeabilidade e, assim, acompanhar o desenvolvimento deste parâmetro do modelo de pele.
Note-se que a permeabilidade é medida através de um gel/colágeno-celular-modelo e uma membrana simultaneamente. O coeficiente de permeabilidade detectado é específicas do sistema, no qual os resultados de modelos diferentes de pele só podem ser comparados ao usar a mesma inserção de membrana. Além disso, o modelo de pele precisa de cobrir a área de cultivo inteiro para garantir que a substância permeate somente através do modelo e não adjacente a ele, que iria induzir a erros de permeabilidade medida. Outro aspecto que deve ser considerado no futuro experimentos é o ambiente natural em torno da pele. Normalmente, a temperatura da superfície da pele é mais baixa em comparação com a região interna, que pode influenciar as condições de permeação.
A fim de alinhar as experiências de laboratório com simulações de computador, foi apresentado um método que permite a otimização de parâmetro para simulação aplicada. Simulações foram encontradas para coincidir com dados experimentais para substâncias com pequeno tamanho molecular. No entanto, observaram-se desvios entre dados experimentais e de simulação para substâncias com maior tamanho molecular. Polissacarídeo grandes moléculas podem aumentar a fricção e retardar o processo de difusão em um gel. Este efeito provoca difusão anormal, que é uma razão possível para o desvio entre o experimental e simulação os valores de33,34. Outra explicação pode ser a presença de partículas de menores ou maiores em fluoresceína-isotiocianato-dextrano. O fabricante especifica o peso molecular da substância, como o tamanho médio, com um intervalo determinado, que permite que as partículas maiores e menores estar presente. É também incerto dispersos como essas substâncias são, como as partículas menores permeiam mais rápido através do gel e o canal de fluido. É possível estender a simulação para considerar estes difusão e efeitos de atrito.
O experimento de permeabilidade e simulação foram desenvolvidos para uso em um 2-oC. Com a ajuda da simulação, este método experimental pode ser transferido diretamente para as configurações mais sofisticadas de experimentais. Por exemplo, a simulação de sistema de inserção de membrana facilmente pode ser transferida para a geometria de um 2-OC ou outros sistemas com instalações semelhantes. Esta opção de modulação a simulação pode ser usada para apoiar o projeto de experimentos futuros. Além disso, efeitos colaterais, como evaporação, difusão anormal e efeitos de membrana podem ser integrados para reforçar a simulação, melhorando assim a precisão. O programa de simulação dá a oportunidade de alterar ou melhorar a equação de simulação, bem como a integrar outros módulos físicos a fim de investigar outros aspectos do desenvolvimento do modelo de pele. Um exemplo é a simulação da produção de lactato e consumo de glicose em um modelo de células de colágeno.
Um aspecto particularmente interessante no teste de substâncias médicas é como as substâncias são distribuídas em um sistema de órgãos-em-um-microplaqueta. O parâmetro de simulação e permeabilidade minha ajuda para responder a perguntas tais como o quão rápido uma substância permeia o sistema bem como a concentração que estará disponível para outros tecidos em um chip multi-organ. Esse método pode apoiar e reforçar o desenvolvimento e teste de tais sistemas de órgão-em-microplaqueta.

Organo-típico 3D culturas tornaram-se ferramentas poderosas para o desenvolvimento de drogas e substância teste1. Neste aspecto, modelos de pele humana são de especial interesse devido a requisitos regulatórios, tais como aqueles na indústria de cosméticos. Posteriormente, eles levaram ao desenvolvimento de inúmeros modelos 3D da pele, para utilização em suas próprias como culturas de single-órgão em placas multi bem, ou multi-organ-fichas em combinação com modelos de órgão adicional, por exemplo, o fígado2.
Em relação ao cultivo de um equivalente de pele, a interface ar-líquido (ALI) é um elemento essencial para a adequada diferenciação epidérmica3. Inserções de cultura de célula compostas de um navio com uma membrana permeável ao líquido na parte inferior são normalmente usadas para estabelecer um ALI. ALIs são amplamente utilizados em modelos de pele disponível comercialmente como EpiDerm4, Phenion5e Episkin6, para a cultura de modelos de pele com tamanhos de 96 poços (4,26 mm de diâmetro) até placas boas 12 (12,2 milímetros de diâmetro). O método descrito aqui determina a permeação de substâncias em um sistema de inserção de membrana.
O coeficiente de permeabilidade é um parâmetro importante para avaliar a qualidade de qualquer modelo de pele cultivada em comparação com pele nativa5e é usado para avaliar quão rapidamente as substâncias activas migram através da pele. Especialmente se medicamentos ou cosméticos produtos precisam ser aplicado sobre a pele, este parâmetro é essencial para compreender quando precisamente os agentes passam através dela. Uma simulação pode ajudar ainda mais para predizer o comportamento do sistema e posteriormente reduzir o necessário esforço experimental demorado, especialmente quando um grande conjunto de substâncias está envolvido.
A célula de difusão de Franz é o estado-da-arte para permeação experimentos com pele e pele modelos5,6,7,8,9. Este dispositivo consiste de dois compartimentos com uma amostra fixa (barreira de difusão) no meio. A substância a ser testado é aplicada diretamente ao topo da amostra (compartimento doador) e a concentração do composto penetrante pode ser detectada no compartimento do oposto (aceitador). No lado acceptor, temperatura constante e a concentração da substância homogênea são asseguradas através de uma câmara de temperatura e de um agitador magnético. Amostras podem ser recolhidas de um braço de amostragem no lado aceitador da célula de Franz. Com uma faixa de altura entre 19 cm e 179 cm, este sistema é relativamente grande de10,11. Outro método para a determinação dos coeficientes de difusão em substâncias gelatinosa e tecidos é FRAP. Esta técnica usa o princípio de branqueamento fluorescente etiquetado partículas em gel e em seguida determinar o tempo de recuperação da área branqueada para calcular a difusão coeficiente12,13,14.
Além disso, espectroscopia de infravermelho de transformação de Fourier (FTIR) pode ser usada para detectar o movimento de partículas com absorbância de luz infravermelha para determinar o processo de permeação de substâncias na pele15,16. No entanto, estes ou outros métodos de imagem (por exemplo, de espectroscopia de correlação de dois fotões fluorescência17) precisam custar instrumentos intensivos.
Neste artigo, um método é apresentado para medir diretamente a permeabilidade de uma barreira dentro de um sistema de inserção de membrana, onde um modelo de pele pode ser cultivado. Esse método permite experimentos de permeabilidade seja executado com um grande número de pequenas amostras (bem tamanho acima para 4,26 mm) em um sistema compacto. Isto está em contraste com a célula de difusão de Franz, onde um dispositivo separado é necessária para cada teste, o que tem de ser montado no dispositivo e é difícil perceber para amostras pequenas (tamanho de 4,26 mm). Além disso, uma vez que o método não requer grande instrumentação (por exemplo, um microscópio confocal ou do multiphoton), é obter uma redução no tempo e no custo.
Todos os experimentos foram realizados em membrana microporosa inserir sistemas com uma amostra (barreira) consiste em gel de agarose ou um modelo de célula de colágeno estabelecido na membrana. Substâncias fluorescentes (doador) com diferentes tamanhos moleculares foram aplicadas para o topo da amostra e a concentração da substância permeated foi detectada na parte inferior (aceitador) usando um leitor de placa de fluorescência (ver Figura 1). Para validar o método e testar a precisão desta simulação, géis de agarose foram produzidos e utilizados como uma barreira. Hidrogel é geralmente utilizados para a investigação dos processos de difusão e permeação em meio poroso em ciências biológicas13. Então, o método foi testado em um sistema de célula-semeado consiste em uma matriz de colágeno dos fibroblastos primários e adulto baixo cálcio alta temperatura queratinócitos (HaCaT) células humanas (modelo de célula-matriz), que é uma pele simplificado modelo18,19 .
Além disso, o processo de permeação foi simulado através de simulações de fluxo com dinâmica de fluidos computacional. Verificou-se que, por meio da otimização de parâmetro, o coeficiente de difusão poderia ser calculado a partir dos dados experimentais. Em geral, esta simulação oferece diferentes aplicações; por exemplo, é possível prever um processo de permeação com base em experiências curtas e a simulação pode reduzir significativamente o número de experimentos.
Simulação e método experimental foram projetadas para aplicação de um sistema de órgãos-em-um-microplaqueta1,20,21, especificamente o 2-órgão-chip (2-OC) desenvolvido comercialmente1,22, 23,24,25. Em princípio, o processo de permeação de qualquer modelo de órgão com base em sistemas de inserção de membrana pode ser descrito desta forma.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>High Resolution Powder</td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Collagen R solution 0.4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>High Glucose with L-Glutamine</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Fluorescein Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>no calcium, no magnesium , with phenol red</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>granulated</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>tablets</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>with EDTA</td></tr></tbody></table>

a method for determination and simulation of permeability and diffusion in a 3d tissue model in a membrane insert system for multi-well plates

Em vitro cultivada pele modelos tornaram-se cada vez mais relevantes para aplicações farmacêuticas e cosméticas e também são usados no desenvolvimento de drogas, bem como a substância de teste. Estes modelos são cultivados principalmente em sistemas de membrana-inserção, sua permeabilidade em direção a diferentes substâncias, sendo um factor essencial. Normalmente, os métodos aplicados para a determinação desses parâmetros geralmente exigem tamanhos de amostra grande (por exemplo, célula de difusão de Franz) ou laborioso equipamento (por exemplo, recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP)). Este estudo apresenta um método para a determinação de coeficientes de permeabilidade diretamente nos sistemas de membrana-inserção com tamanhos de diâmetro de 4,26 e 12,2 mm (área de cultivo). O método foi validado com agarose e gel de colágeno, bem como um modelo de célula de colágeno que representa modelos de pele. Os processos de permeação de substâncias com diferentes tamanhos moleculares e permeação através de modelos de célula diferente (composto de gel de colágeno, fibroblastos e HaCaT) foram descritos com precisão.
Além disso, para apoiar o método experimental acima, estabeleceu-se uma simulação. A simulação se encaixa os dados experimentais bem para substâncias com pequeno tamanho molecular, até 14 x 10-10 m de raio de Stokes (4.000 MW), e, portanto, uma ferramenta promissora para descrever o sistema. Além disso, a simulação pode reduzir consideravelmente os esforços experimentais e é robusta o suficiente para ser estendido ou adaptado para instalações mais complexas.

Experimentos de permeabilidade de uma membrana de 96 poços inserir sistema com gel de agarose 2% como uma barreira foram realizados para avaliar a precisão de uma simulação. Sal de sódio de fluoresceína (pregarias) e isotiocianato de fluoresceína-dextranos (FD) foram usados para verificar o impacto do tamanho molecular da substância difusor de 5 x 10-10 m acima de 45 x 10-10 m de raio Stokes (376.27-40.000 mol wt). Otimização de parâmetro nativo da simulação utilizou-se para caber a simulação de dados experimentais.
Para esse fim, encostas das partes apenas lineares da permeabilidade simulada foram comparadas com os resultados experimentais. Para pequenos tamanhos moleculares, simulação e dados experimentais foram em bom acordo com 99,2% para pregarias e 80,2% para FD 4.000 (ver figura 4a e figura 4b). Tamanho molecular maior gerado desvios superiores mostrando correlações de 50,5% para 10.000 FD, 79,7% para 20.000 FD e 53,6% para 40.000 FD. Curva de progressão nas simulações mostrou um atraso no início e um aumento mais forte no curso mais dos gráficos (ver Figura 4 c–4e).
Coeficientes de permeabilidade e coeficientes de difusão simulado são mostrados em tabela 4. O coeficiente de permeação diminui com o aumento de tamanho molecular. Desvio padrão foi entre 0,08 x 10-8 m/s e 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), que correspondeu a um erro absoluto de entre 4,18% e 46.15%. Experimentos com moléculas maiores mostraram um maior erro absoluto. Os coeficientes de difusão simulado comportou-se muito similarmente aos coeficientes de permeabilidade experimental. Substâncias com raios maiores de Stokes mostraram diminuição coeficientes de difusão e o erro absoluto variou entre 9,09% e 18.46% (N = 3).
Em experimentos adicionais de permeação, quatro tipos de modelo de células de colágeno diferentes foram usados como barreiras em uma membrana de 12-bem inserir sistema. Estes modelos incluem um modelo de célula livre e um modelo de celular com diferentes combinações de fibroblastos primários no gel de colágeno e HaCaT na superfície. Foram utilizadas as seguintes combinações: colágeno (col) como um modelo sem célula, colágeno + fibroblastos (Col. + F.), colágeno + HaCaT (Col. + H.) e colágeno, fibroblastos + HaCaT (Col. + f + H.). Sal de sódio de fluoresceína com DMEM + 10% FCS foi utilizado como substância de doador. Para imagem utilizou-se a análise do modelo de células de colágeno, coloração com hematoxilina e eosina (HE). Esta coloração foi feito usando o protocolo do fabricante. Na Figura 5, é mostrada uma mancha com um modelo Col + f + h... O HE manchas ligeiramente a estrutura da matriz de colágeno do tecido. Os fibroblastos estão localizados na matriz, e os núcleos dos fibroblastos e células HaCaT são corados em violeta escura. Sobre a matriz de colagénio, há uma camada que contém muitos núcleos, que devem ser os núcleos de HaCaTs, construindo uma delimitador camada na parte superior do modelo.
Na tabela 5, coeficientes de permeação experimental e coeficientes de difusão simulado são listados. Uma tendência pode ser vista para a maioria dos modelos com HaCaT, que têm coeficientes de permeação/difusão inferiores em comparação com os modelos sem HaCaT. O erro absoluto dos coeficientes de permeação é 10,9-24,4% e para a difusão coeficientes 5.2-12,9%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> Figura 1: vista lateral do experimento em uma membrana de permeabilidade inserir sistema. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> Figura 2: gráfico exemplar de um experimento de permeabilidade. A concentração do aceitador é plotada ao longo do tempo. Duas linhas tracejadas suporte a parte quase linear do gráfico. A inclinação da parte linear é usada para determinar o coeficiente de permeabilidade. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> Figura 3: geometria e malha da membrana inserir sistema na simulação. (a) geometria da membrana 96 poços sistema de inserção. (b), geometria da membrana 12-poços sistema de inserção. sistema de inserção (c), malha da membrana de 96 poços. (d) malha da membrana 12-poços sistema de inserção. (e) seção transversal e parâmetros da membrana inserem sistema. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> Figura 4: comparação dos dados experimentais de uma experiência de permeação para a simulação otimizada. (um) fluoresceína sal de sódio, (b) de fluoresceína isotiocianato-dextrano 4.000 mol peso, peso de mol (c) 10.000, (d) 20.000 mol de peso e peso de mol (e) 40.000 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> Figura 5: representante HE coloração de um modelo de célula de colágeno (fibroblastos, colágeno + HaCaT). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> Figura 6: coeficiente de permeabilidade em função do raio 1/Stokes, usando o sal de sódio de fluoresceína e isotiocianato de fluoresceína-dextran em uma membrana de 96 poços inserir sistema. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Experession para 96 sistema bem em mm</td>
			<td>Experssion para o sistema de 12-poços em mm</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [mm]</td>
			<td>14,7 [mm]</td>
			<td>Diâmetro do poço</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>Diâmetro da membrana</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [mm]</td>
			<td>21.97 [mm]</td>
			<td>Diâmetro do aceitador</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>Heigh da barreira</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>Distância entre o bem e de fundo</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>Alta do aceitador</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>Profundidade de imersão</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>Raio de bola de imersão+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-posição da bola de imersão+
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: parâmetros de geometria para simulação de "Transporte de espécies químicas". + Apenas para ser usado para a simulação de agarose gel em 96 membrana bem inserir sistema.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Expressão</td>
			<td>Valor</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Concentração de Fl.So.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [mg/ml] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>0,5 mol/m2</td>
			<td>Concentração de FD 4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>0,2 mol/m2</td>
			<td>Concentração de FD 10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0,1 mol/m2</td>
			<td>Concentração de FD 20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>0,05 mol/m2</td>
			<td>Concentração de FD 40.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>1e - 9m2/s</td>
			<td>Coeficiente de difusão da água de amassadura</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Parâmetros físicos para simulação de "Transporte de espécies químicas".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Expressão</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>Definição da concentração aceitador</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>Mudança de fator para D</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Parâmetros para simulação de "Otimização".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Permeiam</td>
			<td>Coeficiente de permeabilidade (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coeficiente de difusão (m/s2) x 10-10</td>
			<td>Raio de Stokes de permeado (m) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4,79 ± 0,20</td>
			<td>1,94 ± 0,34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4.000</td>
			<td>2.37 ± 0,31</td>
			<td>0,65 ± 0,12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1,67 ± 0,47</td>
			<td>0,22 ± 0,02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20.000</td>
			<td>0,65 ± 0,30</td>
			<td>0,29 ± 0,04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40.000</td>
			<td>0,27 ± 0,08</td>
			<td>0,14 ± 0,02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: coeficiente de permeabilidade e a difusão de substâncias com raio de Stokes diferente através do gel de Agarose 2% + membrana em uma membrana de 96 poços inserir sistema. (sal de sódio de fluoresceína = FL. So., fitc dextrano = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modelo</td>
			<td>Coeficiente de permeabilidade (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coeficiente de difusão (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col.</td>
			<td>2.18 ± 0,29</td>
			<td>1.22 ± 0,06</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col. + F.</td>
			<td>1,77 ± 0,38</td>
			<td>0,93 ± 0,12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col. + H.</td>
			<td>1,64 ± 0,40</td>
			<td>0,96 ± 0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col. + f + H.</td>
			<td>1,65 ± 0,18</td>
			<td>0,88 ± 0,11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 5: coeficiente de permeabilidade e a difusão do sal de sódio de fluoresceína através de um modelo de célula de colágeno em um 12-membrana bem inserir sistema (Col. = colágeno, F. = fibroblasto, H. = HaCaT).

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A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

Um método para determinação da permeabilidade de uma membrana inserir sistema para placas multi bem e em silico otimização de parâmetro para o cálculo dos coeficientes de difusão usando simulação são apresentados.

Um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3D do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.2K visualizações.  Hamburg University of Technology. Um método para determinação da permeabilidade de uma membrana inserir sistema para placas multi bem e em silico otimização de parâmetro para o cálculo dos coeficientes de difusão usando simulação são apresentados.

Vídeo: A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Pesquisa do câncer

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Bioengenharia

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Implementação de um Sistema de Infecção baseado em Inserir Permeável Membrana para estudar os efeitos de secretada bacterianas toxinas em células hospedeiras de mamíferos

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Imunologia e Infecção

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

Analisando a Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica por Travessia Microbiana através de Células Endoteliais Microvasculares

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Análise de modelos de barreira hematoencefálica via coloração por imunofluorescência

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Autor em destaque: Avançando o uso da tecnologia de chip de tecido para estudar tecidos humanos 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Uma plataforma de tecido de barreira reconfigurável com modos de poço aberto e microfluídico

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

Autor em destaque: Desenvolvendo um sistema microfisiológico modular exclusivo para imitar o tecido de barreira humana

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.

Transformando Modelos de Tecidos de Barreira Estática em Sistemas Microfisiológicos Dinâmicos

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

Um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3D do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem

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