Эта работа была создана при финансовой поддержке от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) под Грант нет PO413/12-1 и Ла 1028/7-1.

<ol>
	<li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip+developments:+a+translational+cutting-edge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man?.">Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?.</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro.">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).</li><li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface.">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).</li><li>Cannon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+epidermal+model+for+dermal+irritancy+testing.">New epidermal model for dermal irritancy testing.</a> Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).</li><li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phenion+Full-Thickness+Skin+Model+for+Percutaneous+Absorption+Testing.">The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing.</a> Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).</li><li>Netzlaff, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+reconstructed+human+epidermis+model+Episkin+in+comparison+to+various+human+skin+preparations.">Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).</li><li>Bran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Discriminative+Criterion+for+the+Development+of+Franz+Diffusion+Tests+for+Transdermal+Pharmaceuticals.">A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals.</a> J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).</li><li>Pineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+percutaneous+absorption+of+aluminum+from+antiperspirants+through+human+skin+in+the+Franz+diffusion+cell.">In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell.</a> J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).</li><li>Filon, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+percutaneous+absorption+of+cobalt.">In vitro percutaneous absorption of cobalt.</a> Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).</li><li>Ng, S. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Static+Franz+Diffusion+Cell+System+for+In+Vitro+Permeation+Studies.">Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies.</a> AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).</li><li>Bonferoni, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Franz+Diffusion+Cell+for+Simultaneous+Assessment+of+Drug+Release+and+Washability+of+Mucoadhesive+Gels.">A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels.</a> Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).</li><li>Seiffer, S., Oppermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+FRAP+experiments+performed+in+a+confocal+laser+scanning+microscope.">Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope.</a> J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).</li><li>Pluen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Macromolecules+in+Agarose+Gels:+Comparison+of+Linear+and+Globular+Configurations.">Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations.</a> Biophys J. 77, 542-552 (1999).</li><li>Cornelissen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+measurements+in+epidermal+tissues+with+fluorescent+recovery+after+photobleaching.">Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching.</a> Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).</li><li>Pirot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+permeability+barrier+of+human+skin+in+vivo.">Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo.</a> PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).</li><li>Tetteh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+examination+of+skin+diffusion+using+FTIR+spectroscopic+imaging+and+multivariate+target+factor+analysis.">Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis.</a> Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).</li><li>Guldbrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+fluorescence+correlation+spectroscopy+as+a+tool+for+measuring+molecular+diffusion+within+human+skin.">Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin.</a> Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Veronike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Organization+and+Differentiation+of+HaCaT+Keratinocytes+in+Organotypic+Coculture+with+Human+Dermal+Fibroblasts.">Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).</li><li>Moraes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Three-Dimensional+Cell+Culture+to+Organs-on-Chips.">From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture.">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-organ+chip+co-culture+of+neurospheres+and+liver+equivalents+for+long-term+substance+testing.">A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing.</a> J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).</li><li>Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing+-+organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput.">Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).</li><li>Jayakrishna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+High+Molecular+Weight+Compounds+through+Sclera.">Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera.</a> IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).</li><li>Peck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+Diffusion+of+Polar+Molecules+Through+and+Effective+Pore+Radii+Estimate+of+Intact+and+Ethanol.">Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol.</a> Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).</li><li>Ogiso, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+Enhancement+Effect+of+n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside+on+the+Transdermal+Penetration+of+Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Dextrans+and+the+Molecular+Weight+Dependence+of+Water-Soluble+Penetrants+through+Stripped+Skin.">Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin.</a> J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).</li><li>Hadgraft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin,+the+final+frontier.">Skin, the final frontier.</a> Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).</li><li>Asselineau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Epidermis+Reconstructed+by+Culture:+Is+It+"Normal"?.">Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"?.</a> J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).</li><li>Casasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+differentiation+in+a+model+of+human+skin+equivalent.">Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent.</a> Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Laurent, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Dextran+in+Concentrated+Solutions.">Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions.</a> Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).</li><li>Metzler, R., Klafter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+random+walk's+guide+to+anomalous+diffusion:+A+fractional+dynamics+approach.">The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach.</a> Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).</li></ol>

Уве Маркс — Генеральный директор и акционер и Gerd Lindner является акционером компании TissUse GmbH, компании по производству и коммерциализации технологии МОЦ. Другие авторы заявляют никакого конфликта интересов относительно опубликования этого документа.

Это исследование документов метод, разработанный для количественного определения проникновение через конструкцию ткани, инженерии на мембрану. Проникновение веществ с различной молекулярной размеров через гель агарозы впервые была рассмотрена для тестирования и проверки метода и соответствующего моделирования. Хорошо известно, что небольшие молекулы быстрее проникать через сетку матрицы (за исключением эффекта в гель фильтрации хромотографией проницаемость). Аналогичные замечания были сделаны с размер исключение эксперименты веществ через склера26, человеческого эпидермиса мембраны27, кожи человека17и крыса кожи28. Обратная корреляция между коэффициенты проницаемости и соответствующего радиус Стокса (радиус сферы жесткий, что движется с той же скоростью диффузии молекул описано, обычно меньше, чем радиус молекулы) было показано, 26 , 28и подобные отношения было отмечено в экспериментах с веществами различных молекулярных размеров. Путем построения коэффициенты проницаемости над 1/Стокса радиус, был найден линейной корреляции над четырьмя группами с наименьшей молекулярного размера (R2 = 0,93) (рис. 6). Это означает, что коэффициенты проницаемости смоделированные с помощью метода предложил находятся в диапазоне, реалистичные.
Ошибка 46,15% в экспериментах немного больше, чем сообщалось на проницаемость экспериментов с Франц диффузии ячейки системы10. Одно из возможных объяснений может быть распределение по размерам флуоресцеин Изотиоцианаты декстрана, который рассматривается позже.
Метод, описанный имеет важные преимущества по сравнению с методами, с помощью системы клеток диффузии Франц. Во-первых установка является более компактным; эксперименты, выполняются непосредственно в систему вставки мембраны, которая имеет масштаб коммерческих хорошо пластины (∼ 13 x 8.5 см). Это позволяет несколько образцы выполнять одновременно, тогда как отдельную ячейку диффузии Франц необходима для каждого образца. Во-вторых проницаемость кожи модели может быть непосредственно измеряется в вставки мембраны, где происходит выращивание. С помощью Франц диффузии клетки, образцы должны быть вывезены и установлен на системе, которая является более громоздким для малых выборок и также является более трудоемким.
Пропитывание эксперименты с коллагена ячейки матрицы показали, что этот метод может применяться успешно к системам клеток семенами. Модель, представленная здесь было проверено для кожи модели; Однако этот метод может применяться для других типов органических клеточных культур, например, почек или печени.
В этом исследовании, коллаген ячеечная модель была использована, в котором HaCaT клетки полностью покрыты поверхности модели (см. Рисунок 5). Это привело к сокращению коэффициента проницаемости, демонстрируя, что метод является достаточно чувствительным, чтобы отличить коэффициент проницаемости между коллаген ячеечная модель с и без слоя HaCaT. В идеале модель кожи следует создать барьер, который приближается к эпидермис реальных кожи29, и поэтому важно проверить качество (например, строительство дермы, эпидермис) кожи модели до фактического использования. Разработка модели кожи можно изобразить с пятная методов и количественно от обнаружения кожи белков и коллагена30,,3132. Коэффициент проницаемости могут также быть важным фактором для оценки разработки модели кожи, но необходимы дальнейшие эксперименты подтверждают это. Как упоминалось ранее этот метод позволяет параллельно несколько образцов. Это также можно взять образцы во время выращивания для измерения проницаемости и таким образом наблюдать за развитием этого параметра в модели кожи.
Следует отметить, что проницаемость измеряется через гель/коллагена клеток модель и мембраны одновременно. Коэффициент обнаруженных проницаемости конкретной системы, согласно которой результаты моделей различных кожи можно сравнить, только при использовании же вставки мембраны. Кроме того модель кожи необходимо охватить весь посевные площади для того, чтобы обеспечить только через модель будет пронизывать испытываемого вещества и не рядом с ним, которая побуждала бы ошибки измерения проницаемости. Другой аспект, который следует рассматривать в будущем экспериментов является природной среды, окружающей кожи. Как правило температура поверхности кожи ниже по сравнению с внутренней региона, который может влиять на условия проникновения.
Для того чтобы выровнять лабораторных экспериментов с компьютерного моделирования, был представлен метод, который позволяет параметр оптимизации для прикладного моделирования. Моделирования были найдены совпадают также с экспериментальными данными для веществ с маленьких молекулярных размеров. Однако для веществ с больших молекулярных размеров наблюдались отклонения между моделирования и экспериментальных данных. Большие полисахаридные молекулы могут увеличивать трение и замедляют процесс диффузии в виде геля. Этот эффект заставляет аномальные диффузии, который является возможной причиной для отклонения между экспериментальной и моделирование значений33,34. Другое объяснение может быть наличие небольших или крупных частиц в флуоресцеин Изотиоцианаты декстрана. Производитель указывает молекулярная масса вещества, как средний размер с заданного диапазона, который позволяет меньшие и большие частицы присутствовать. Неясно также как дисперсной эти вещества являются, как мелкие частицы проникают быстрее через гель и жидкости канал. Это позволяет расширить моделирование рассмотреть эти диффузии и трения эффекты.
Проницаемость эксперимента и моделирования были разработаны для использования в 2 OC. С помощью моделирования этот экспериментальный метод могут быть непосредственно переданы более сложные экспериментальных установок. Например системы моделирования вставки мембраны легко могут быть переданы к геометрии 2-OC или других систем с аналогичных структурах. Этот параметр модуляции моделирование может использоваться для поддержки разработки дальнейших экспериментов. Кроме того побочные эффекты, такие как испарение, аномальной диффузии и мембраны эффекты могут быть интегрированы для расширения моделирования, тем самым улучшая точность. Программа моделирования дает возможность изменить или улучшить моделирование уравнения, а также о том, как интегрировать другие физические модули для изучения других аспектов кожи модели развития. Одним из примеров является моделирование глюкоза лактат и потребления производства в модели клеток коллагена.
Особенно интересным аспектом в испытаниях лекарственных веществ является, как вещества распределяются в систему органа на чипе. Моделирование и проницаемости параметр моя помощь ответить на вопросы, такие как быстро вещество проникает в систему а также которых концентрация будет доступна для других тканей в multi organ-чип. Этот метод может поддержать и расширить разработку и тестирование систем такого органа на чипе.

Органо типичный 3D культур стали мощные инструменты для разработки лекарственных средств и тестирование1вещество. В этой связи модели кожи человека представляют особый интерес из-за нормативных требований, таких, как те в косметической промышленности. Впоследствии они привели к разработке многочисленных моделей 3D кожи, для использования либо на их собственных как сингл орган культур в нескольких хорошо пластины или multi organ-чипов в сочетании с дополнительного органа модели, например, в печени2.
Что касается культивирования эквивалента кожи жидкость воздуха интерфейс (Али) является важным элементом для надлежащего эпидермальный дифференциация3. Клетки культуры вставки состоит из сосуд с жидкостью проницаемой мембраны в нижней части обычно используются для создания Али. ALIs широко используются в коммерчески доступных кожи модели например ростковой4,5Phenion и Episkin6, для культуры кожи модели с размерами от 96-луночных (4.26 мм в диаметре) до 12-хорошо (12,2 мм в диаметре) пластин. Метод, описанный здесь определяет проникновение веществ в системе вставки мембраны.
Коэффициент проницаемости является значительным параметром для оценки качества любого искусственного кожи модели по сравнению с родной кожи5и используется для оценки как быстро активные вещества мигрируют через кожу. Особенно если наркотики или косметика продукты должны быть применены к коже, этот параметр необходимо понять, когда точно активные агенты проходят через него. Моделирование далее может помочь предсказать поведение системы и впоследствии уменьшить необходимые времени экспериментальных усилий, особенно когда большой набор веществ участвует.
Франц диффузии ячейка является состояние искусства для проникновения эксперименты с кожи и кожи модели5,6,,78,9. Это устройство состоит из двух отсеков с фиксированной выборки (диффузионным барьером) между ними. Вещества для проверки применяется непосредственно к верхней части образца (доноров отсека) и концентрация блестящее соединения могут быть обнаружены на противоположный отсек (акцептор). На акцепторной стороне постоянная температура и концентрация однородных веществ обеспечивается через температуры камеры и магнитной мешалкой. Образцы могут быть взяты из выборки руку на акцепторной стороне ячейки, Франц. Высота составляет 19 см и 179 см эта система является относительно большой10,11. Другой метод для определения коэффициентов диффузии в гель подобных веществ и тканях это FRAP. Этот метод использует принцип отбеливания дневно помечены частиц в гель и затем определения времени восстановления области отбеленной для расчета диффузии коэффициент12,,1314.
Кроме того преобразование Фурье ИК (FTIR) спектроскопия может использоваться для обнаружения движения частиц с инфракрасного света поглощения для того, чтобы определить процесс проникновения веществ в кожу15,16. Однако эти или другие тепловизионные методы (например, спектроскопии корреляции двух Фотон флуоресценции17) нужно стоимость интенсивных инструментов.
В этой статье представлен метод для прямого измерения проницаемости барьер в системе вставки мембраны, где модель кожи может культивироваться. Этот метод позволяет проницаемость экспериментов, чтобы работать с большим количеством малых выборок (ну размер до 4,26 мм) в компактной системе. Это в отличие от Франц диффузии ячейки, где отдельное устройство необходима для каждого зонда, который должен быть установлен на устройстве и трудно реализовать для малых выборок (размер 4.26 мм). Кроме того так как метод не требует крупных инструментария (например, multiphoton или конфокального микроскопа), достигается сокращение времени и стоимости.
Все эксперименты проводились в микропористая мембрана вставить систем с образцом (барьер), состоящий из геля агарозы или коллагена ячеечная модель создана на мембране. Флуоресцентные вещества (донор) с различной молекулярной размеры были применены к верхней части образца, и концентрация пронизаны вещества было обнаружено на дне (акцептор) с помощью читатель флуоресценции пластины (см. Рисунок 1). Чтобы проверить метод и проверить точность этого моделирования, Гели агарозы были произведены и используется как барьер. Гидрогели обычно используются для исследования процессов диффузии и проникновение в пористой среде в биологических наук13. Этот метод затем был испытан в клетки посеян система, состоящая из коллагеновой матрицы первичных фибробластов и взрослых низкой кальция высокой температуры кератиноциты (HaCaT) клеток человека (ячейка матричная модель), которая является упрощенной кожи модель18,19 .
Кроме того процесс проникновения был смоделирован с помощью моделирования потока с вычислительной гидродинамики. Было установлено, что, путем оптимизации параметров, может быть рассчитан коэффициент диффузии из экспериментальных данных. В общем это моделирование предлагает различные приложения; Например можно предсказать пропитывание процесс, основанный на коротких экспериментов и моделирование может значительно уменьшить количество экспериментов.
Экспериментальный метод и моделирования были разработаны для применения в орган на чипе системы1,20,21, специально 2-орган чип (2-OC) разработали коммерчески1,22, 23,24,25. В принципе можно описать процесс проникновения любой орган модели на основе мембранных систем Вставка таким образом.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>High Resolution Powder</td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Collagen R solution 0.4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>High Glucose with L-Glutamine</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Fluorescein Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>no calcium, no magnesium , with phenol red</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>granulated</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>tablets</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>with EDTA</td></tr></tbody></table>

a method for determination and simulation of permeability and diffusion in a 3d tissue model in a membrane insert system for multi-well plates

В vitro культивируемых кожи модели становятся все более актуальной для фармацевтических и косметических приложений и также используются в разработке лекарств, а также вещество тестирования. Эти модели основном культивируется в мембраны Вставка систем, их проницаемости к различных веществ, будучи важным фактором. Как правило применяются методы для определения этих параметров обычно требуют большой выборки (например, Франц диффузии клеток) или трудоемкий оборудования (например, восстановление флуоресценции после Фотообесцвечивание (FRAP)). Это исследование представляет метод определения коэффициентов проницаемости непосредственно в системах мембраны вставка с размерами диаметра 4.26 и 12,2 мм (зона культивирования). Метод был проверен с коллагеновые Гели агарозы и коллагена клеток модели, представляющие модели кожи. Процесс проникновения веществ с различных молекулярных размеров и проникновение через модели различных клеток (состоящие из коллагена гель, фибробластов и HaCaT) были точно описано.
Кроме того для поддержки выше экспериментальный метод, моделирования была создана. До моделирования вписывается экспериментальных данных хорошо для веществ с малого молекулярного размера, чтобы радиус Стокса м 14 x 10-10 (4000 МВт), и поэтому является многообещающим инструментом для описания системы. Кроме того моделирование может значительно снизить количество экспериментальных работ и достаточно прочным, чтобы быть продлен или адаптированы к более сложных установок.

Проницаемость эксперименты в 96-луночных мембраны вставить системы с 2% агарозном геле как барьер были проведены с целью оценить точность моделирования. Флуоресцеин натриевой соли (НВСЛ) и флуоресцеин Изотиоцианаты декстранов (FD) были использованы для проверки воздействия молекулярного размера диффундирующего вещества из 5 x 10-10 m до 45 x 10-10 м радиус Стокса (376.27-40000 mol wt). Моделирование собственного параметра оптимизации была использована для моделирования для экспериментальных данных.
С этой целью склонах только линейной части имитируемых проницаемости были по сравнению с экспериментальных результатов. Для маленьких молекулярных размеров моделирование и экспериментальных данных были хорошо согласуется с 99,2% для НВСЛ и 80,2% для FD 4000 (см. рисунок 4a и 4b рисунок). Большего молекулярного размера генерируется выше отклонений показаны корреляции 50,5% за 10000 FD, 79,7% за 20000 FD и 53,6% за 40000 FD. Кривой прогрессии в расчеты показали задержку в начале и сильный рост на дальнейший ход графиков (см. рис. 4 c–4e).
Коэффициенты проницаемости и моделирования распространения Коэффициенты указаны в Таблица 4. Коэффициент проникновения уменьшается с увеличением молекулярного размера. Стандартное отклонение было между 0.08 x 10-8 м/с и 0,47 x 10-8 м/с (N = 7), который соответствует абсолютной ошибки между 4.18% и 46,15%. Эксперименты с больших молекул показали больше абсолютная ошибка. Моделирование распространения Коэффициенты очень подобно относились к коэффициенты экспериментальной проницаемости. Вещества с больших радиусов Стокса показал снижение коэффициентов диффузии и абсолютная погрешность колебалась между 9.09% и 18.46% (N = 3).
В дополнительных пропитывание экспериментов четыре разных коллагеновых клеток типы модели были использованы в качестве барьеров в 12-ну мембраны вставить системы. Эти модели включают ячейки бесплатно модель и модель клетки с различными комбинациями первичных фибробластов в гель коллагена и HaCaT на поверхности. Были использованы следующие комбинации: коллаген (полковник) как модель свободных клеток, коллаген + фибробластов (полковник + ф), HaCaT (полковник + H.) и коллаген + фибробластов, коллаген + HaCaT (полковник + ф + Ч.). Флуоресцеин натриевой соли с DMEM + 10% FCS использовался в качестве доноров вещество. Для изображения был использован анализ модели клеток коллагена, окрашивание с гематоксилином и эозином (он). Это окрашивание было сделано с использованием протокола производителя. На рисунке 5показано такое пятно с представителем полковник + ф + H. модель. Он слегка пятна структура ткани коллагеновой матрицы. Фибробласты расположены в матрице, и ядра HaCaT клеток и фибробластов окрашенные в темно-фиолетовый. На вершине коллагеновой матрицы есть слой, содержащий много ядер, которые должны быть ядра HaCaTs, строительство внешнего слоя на верхней части модели.
В таблице 5перечислены экспериментальной пропитывание коэффициенты и коэффициенты искусственной диффузии. Тенденция может рассматриваться для большинства моделей с HaCaT, которые имеют меньше проникновения/распространения коэффициенты по сравнению с моделями без HaCaT. Абсолютная погрешность коэффициентов проникновения — 10,9-24,4% и для распространения Коэффициенты 5,2% - 12,9%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> Рисунок 1: вид сбоку эксперимента проницаемости мембраны ‡акладные. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> Рисунок 2: Образцовый график проницаемости эксперимента. Концентрация акцепторной строится со временем. Две пунктирные линии кронштейн почти линейной части графа. Наклон линейной части используется для определения коэффициента проницаемости. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> Рисунок 3: геометрия и сетки мембраны вставить системы моделирования. () геометрии 96-луночных мембраны вставка системы. (b) геометрии 12-ну мембраны вставка системы. (c) сетка 96-луночных мембраны вставка системы. (d) сетка 12-ну мембраны вставка системы. (e) сечение и параметры мембраны вставить системы. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> Рисунок 4: сравнение экспериментальных данных от проникновения эксперимента для оптимизированного моделирования. () флуоресцеин натрия соли, массовая мол Изотиоцианаты декстран 4000 флюоресцеином (b), (c) 10000 mol массы, (d) 20000 mol массы и (e) 40000 mol массы <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> Рисунок 5: представитель он окрашивание коллаген ячеечная модель (HaCaT, коллаген + фибробластов). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> Рисунок 6: коэффициент проницаемости как функция радиуса 1/Стокса, используя флуоресцеин натриевой соли и флуоресцеин Изотиоцианаты декстрана в 96-луночных мембраны ‡акладные. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Имя</td>
			<td>Experession для 96 системы в мм</td>
			<td>Experssion для 12-ну системы в мм</td>
			<td>Описание</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [мм]</td>
			<td>14.7 [мм]</td>
			<td>Диаметр скважины</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [мм]</td>
			<td>12.1 [мм]</td>
			<td>Диаметр мембраны</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [мм]</td>
			<td>21,97 [мм]</td>
			<td>Диаметр акцептор</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [мм]</td>
			<td>2 [мм]</td>
			<td>Высота барьера</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [мм]</td>
			<td>1 [мм]</td>
			<td>Расстояние между хорошо и снизу</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [мм]</td>
			<td>5.24 [мм]</td>
			<td>Высокая акцептор</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>Глубина погружения</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>Радиус шара погружения+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z положение мяча погружения+
</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: параметры геометрии для моделирования «Химических видов транспорта». + Могут быть использованы для моделирования агарозы только гель в 96 хорошо мембраны вставить системы.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Имя</td>
			<td>Выражение</td>
			<td>Значение</td>
			<td>Описание</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0,1 [mg/ml]/376.28 [г/моль]</td>
			<td>0.26576 мол/m2
</td>
			<td>Концентрация Fl.So.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [мг/мл] / 4000 [г/моль]</td>
			<td>0,5 моль/м2</td>
			<td>Концентрация FD 4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [мг/мл] / 10000 [г/моль]</td>
			<td>0.2 моль/м2</td>
			<td>Концентрация FD 10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [мг/мл] / 20000 [г/моль]</td>
			<td>0,1 моль/м2</td>
			<td>Концентрация FD 20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [мг/мл] / 40000 [г/моль]</td>
			<td>0,05 моль/м2</td>
			<td>Концентрация FD 40.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1E-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>1E - 9m2/s</td>
			<td>Коэффициент диффузии воды затворения</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Физические параметры для моделирования «Химических видов транспорта».
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Имя</td>
			<td>Выражение</td>
			<td>Описание</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>Определение концентрации акцепторов</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>Коэффициент изменения для D</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 3: Параметры для моделирования «Оптимизация».
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Пронизывают</td>
			<td>Коэффициент проницаемости (m/s) x 10-8</td>
			<td>Коэффициент диффузии (2m/s) x 10-10</td>
			<td>Радиус Стокса растворенного вещества (m) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4.79 ± 0,20</td>
			<td>1.94 ± 0,34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4000</td>
			<td>2.37 ± 0.31</td>
			<td>0,65 ± 0,12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1,67 ± 0,47</td>
			<td>0.22 ± 0,02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20 000</td>
			<td>0,65 ± 0.30</td>
			<td>0,29 ± 0,04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40000</td>
			<td>0.27 ± 0,08</td>
			<td>0,14 ± 0,02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4: коэффициент проницаемости и диффузии веществ с различными радиус Стокса через мембрану в 96-луночных мембрана + 2% агарозном геле ‡акладные. (флуоресцеин натрия соль = Fl. так, fitc декстрана = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Модель</td>
			<td>Коэффициент проницаемости (m/s) x 10-8</td>
			<td>Коэффициент диффузии (2m/s) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Полковник</td>
			<td>2.18 ± 0.29</td>
			<td>1.22 ± 0,06</td>
		</tr>
<tr>
<td>Полковник + F.</td>
			<td>1.77 ± 0,38</td>
			<td>0.93 ± 0,12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Полковник + H.</td>
			<td>1.64 ± 0.40</td>
			<td>0.96 ± 0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Полковник + ф + H.</td>
			<td>1,65 ± 0,18</td>
			<td>0,88 ± 0,11</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 5: коэффициент проницаемости и диффузии флуоресцеин натриевой соли через модель клеток коллагена в 12-хорошо мембраны вставить системы (полковник = коллагена, ф = фибробластов, ч. = HaCaT).

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates at JoVE.com

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

Метод определения проницаемости мембраны вставить системы для нескольких хорошо пластин и представлены в silico оптимизации параметра для расчета коэффициентов диффузии с помощью моделирования.

Метод для определения и моделирования проницаемости и распространения в ткань 3D модели в мембрану вставить системы для нескольких хорошо пластин

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

a-method-for-determination-simulation-permeability-diffusion-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K Views.  Hamburg University of Technology. Метод определения проницаемости мембраны вставить системы для нескольких хорошо пластин и представлены в silico оптимизации параметра для расчета коэффициентов диффузии с помощью моделирования.

Video: A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Мимической опухолевого микроокружения: Простой метод для генерации обогащается мобильных групп населения и исследование межклеточной коммуникации

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Cancer Research

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Трехмерные модели культуры клеток для измерения действию тканевой жидкости потока на опухолевой инвазии сотовых

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Внедрение системы инфекционного проницаемой мембраны Вставка на основе для изучения влияния секретируемых бактериальными токсинами на млекопитающих клеток-хозяев

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Immunology and Infection

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

Анализ проницаемости барьера кровяных мозговых клеток микробным обходом через микрососудистые эндотелиальные клетки

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Анализ моделей гематоэнцефалического барьера с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

В центре внимания автора: Совершенствование использования технологии тканевых чипов для изучения тканей человека 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Использование барьерной тканевой платформы MicroSiM (μSiM) для моделирования гематоэнцефалического барьера

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Реконфигурируемая платформа барьерной ткани с режимами открытой скважины и микрофлюидной средой

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

В центре внимания автора: Разработка уникальной модульной микрофизиологической системы для имитации барьерной ткани человека

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.

Преобразование статических барьерных моделей тканей в динамические микрофизиологические системы

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

Метод для определения и моделирования проницаемости и распространения в ткань 3D модели в мембрану вставить системы для нескольких хорошо пластин

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST