Ce travail a été créé avec le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Grant No. PO413/12-1 et LA 1028/7-1.

<ol>
	<li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip+developments:+a+translational+cutting-edge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man?.">Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?.</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro.">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).</li><li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface.">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).</li><li>Cannon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+epidermal+model+for+dermal+irritancy+testing.">New epidermal model for dermal irritancy testing.</a> Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).</li><li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phenion+Full-Thickness+Skin+Model+for+Percutaneous+Absorption+Testing.">The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing.</a> Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).</li><li>Netzlaff, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+reconstructed+human+epidermis+model+Episkin+in+comparison+to+various+human+skin+preparations.">Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).</li><li>Bran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Discriminative+Criterion+for+the+Development+of+Franz+Diffusion+Tests+for+Transdermal+Pharmaceuticals.">A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals.</a> J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).</li><li>Pineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+percutaneous+absorption+of+aluminum+from+antiperspirants+through+human+skin+in+the+Franz+diffusion+cell.">In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell.</a> J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).</li><li>Filon, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+percutaneous+absorption+of+cobalt.">In vitro percutaneous absorption of cobalt.</a> Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).</li><li>Ng, S. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Static+Franz+Diffusion+Cell+System+for+In+Vitro+Permeation+Studies.">Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies.</a> AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).</li><li>Bonferoni, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Franz+Diffusion+Cell+for+Simultaneous+Assessment+of+Drug+Release+and+Washability+of+Mucoadhesive+Gels.">A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels.</a> Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).</li><li>Seiffer, S., Oppermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+FRAP+experiments+performed+in+a+confocal+laser+scanning+microscope.">Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope.</a> J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).</li><li>Pluen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Macromolecules+in+Agarose+Gels:+Comparison+of+Linear+and+Globular+Configurations.">Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations.</a> Biophys J. 77, 542-552 (1999).</li><li>Cornelissen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+measurements+in+epidermal+tissues+with+fluorescent+recovery+after+photobleaching.">Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching.</a> Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).</li><li>Pirot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+permeability+barrier+of+human+skin+in+vivo.">Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo.</a> PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).</li><li>Tetteh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+examination+of+skin+diffusion+using+FTIR+spectroscopic+imaging+and+multivariate+target+factor+analysis.">Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis.</a> Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).</li><li>Guldbrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+fluorescence+correlation+spectroscopy+as+a+tool+for+measuring+molecular+diffusion+within+human+skin.">Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin.</a> Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Veronike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Organization+and+Differentiation+of+HaCaT+Keratinocytes+in+Organotypic+Coculture+with+Human+Dermal+Fibroblasts.">Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).</li><li>Moraes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Three-Dimensional+Cell+Culture+to+Organs-on-Chips.">From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture.">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-organ+chip+co-culture+of+neurospheres+and+liver+equivalents+for+long-term+substance+testing.">A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing.</a> J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).</li><li>Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing+-+organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput.">Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).</li><li>Jayakrishna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+High+Molecular+Weight+Compounds+through+Sclera.">Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera.</a> IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).</li><li>Peck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+Diffusion+of+Polar+Molecules+Through+and+Effective+Pore+Radii+Estimate+of+Intact+and+Ethanol.">Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol.</a> Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).</li><li>Ogiso, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+Enhancement+Effect+of+n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside+on+the+Transdermal+Penetration+of+Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Dextrans+and+the+Molecular+Weight+Dependence+of+Water-Soluble+Penetrants+through+Stripped+Skin.">Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin.</a> J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).</li><li>Hadgraft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin,+the+final+frontier.">Skin, the final frontier.</a> Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).</li><li>Asselineau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Epidermis+Reconstructed+by+Culture:+Is+It+"Normal"?.">Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"?.</a> J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).</li><li>Casasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+differentiation+in+a+model+of+human+skin+equivalent.">Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent.</a> Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Laurent, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Dextran+in+Concentrated+Solutions.">Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions.</a> Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).</li><li>Metzler, R., Klafter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+random+walk's+guide+to+anomalous+diffusion:+A+fractional+dynamics+approach.">The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach.</a> Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).</li></ol>

Uwe Marx est le PDG et actionnaire et Gerd Lindner est un actionnaire de TissUse GmbH, une société de fabrication et la commercialisation de la technologie de la MOC. D’autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Cette étude documente une méthode mise au point afin de quantifier la perméation à travers un tissu-construct conçu sur une membrane. Perméation de substances avec diverses tailles moléculaires par gel d’agarose a d’abord examinée pour tester et valider la méthode et la simulation correspondante. Il est bien connu que les molécules plus petites imprègnent plus vite au travers d’une maille de matrice (à l’exception de l’effet de filtration sur gel par chromatographie de perméabilité). Des observations similaires ont été faites avec des expériences d’exclusion stérique des substances à travers la sclère26, membrane épidermique humain27,17de la peau humaine et rat peau28. Une corrélation inverse entre les coefficients de perméabilité et le rayon de Stokes correspondant (le rayon d’une sphère dure qui se déplace avec le même taux de diffusion que les molécules décrites, généralement plus petits que le rayon effectif de la molécule) a été établi 26 , 28et une relation similaire a été observé dans des expériences avec des matières de différentes tailles moléculaires. En traçant les coefficients de perméabilité sur rayon 1/Stokes, a trouvé une corrélation linéaire sur les quatre groupes avec la plus petite taille moléculaire (R2 = 0,93) (Figure 6). Cela montre que les coefficients de perméabilité simulé avec la méthode proposée sont dans une gamme réaliste.
L’erreur de 46,15 % dans les expériences est légèrement plus grand que celles rapportées pour des expériences de perméabilité avec le Franz diffusion cellulaire système10. Une explication possible pourrait être la distribution granulométrique de fluorescéine-isothiocyanate-dextran, dont nous parlerons plus tard.
La méthode décrite a importants avantages comparativement aux méthodes utilisant le système de cellule de diffusion Franz. Tout d’abord, la configuration est plus compacte ; les expériences sont exécutés directement dans un système d’insertion de membrane, qui a l’échelle d’une plaquette commerciale bien (∼ 13 cm x 8,5 cm). Cela permet à plusieurs échantillons à exécuter simultanément, alors qu’une cellule de diffusion Franz distincte est nécessaire pour chaque échantillon. Deuxièmement, la perméabilité d’un modèle de peau peut être mesurée directement à l’insertion de la membrane, où la culture se déroule. À l’aide de cellules de diffusion Franz, les échantillons doivent être sortis et monté sur le système, qui est plus lourde pour les petits échantillons et aussi plus de temps.
Expériences de perméation avec matrices de cellules de collagène ont montré que cette méthode peut être appliquée avec succès aux systèmes cellulaires graines. Le modèle présenté ici a été vérifié pour les modèles de peau ; Toutefois, la méthode peut être appliquée à d’autres types de cultures de cellules organiques, par exemple, des reins ou du foie.
Dans cette étude, a utilisé un modèle de collagène-cellule dans laquelle les cellules HaCaT entièrement recouvert la surface du modèle (voir Figure 5). Cela a conduit à une réduction du coefficient de perméabilité, ce qui démontre que la méthode est suffisamment sensible pour distinguer le coefficient de perméabilité entre un modèle de collagène-cellule avec et sans une couche de HaCaT. Dans l’idéal, un modèle de peau devrait constituer une barrière, qui s’approche de l’épiderme d’une peau réelle29, et il est donc important de vérifier la qualité (p. ex., bâtiment du derme, épiderme) du modèle de peau avant l’utilisation effective. L’élaboration d’un modèle de peau peut être visualisée à l’aide des techniques de coloration et quantifiée de la détection de la peau collagène et les protéines30,31,32. Le coefficient de perméabilité peut aussi être un facteur important pour évaluer l’évolution du modèle de peau, mais les autres expériences sont nécessaires pour confirmer cela. Tel que mentionné précédemment, cette méthode permet de multiples échantillons en cours d’exécution en parallèle. Il est également possible de prélever des échantillons au cours de la culture pour mesurer la perméabilité et ainsi observer le développement de ce paramètre du modèle de peau.
Il est à noter que la perméabilité est mesurée grâce à un gel/collagène-cellule-modèle et d’une membrane en même temps. Le coefficient de perméabilité détecté est spécifique au système, auquel cas les résultats des modèles de peau différente ne peuvent être comparés que lorsque vous utilisez le même foyer de membrane. En outre, le modèle de peau a besoin couvrir la zone de culture ensemble afin de s’assurer que la substance d’essai imprégnera uniquement via le modèle et pas adjacents à celui-ci, qui induirait erreurs dans la perméabilité mesurée. Un autre aspect qui devrait être considéré à l’avenir des expériences est l’environnement naturel qui entoure la peau. Normalement, la température de la surface de la peau est plus faible en comparaison de la région, qui peut influencer les conditions de perméation.
Afin d’aligner les expériences en laboratoire avec des simulations informatiques, une méthode qui permet l’optimisation des paramètres pour la simulation appliquée a été présentée. Des simulations ont été trouvées à coïncident bien avec les données expérimentales pour les substances dont la petite taille moléculaire. Les écarts entre la simulation et les données expérimentales ont cependant étaient observées pour les substances dont la taille moléculaire. Molécules de polysaccharides grand peuvent augmenter la friction et ralentir le processus de diffusion dans un gel. Cet effet provoque la diffusion anormale, qui est une raison possible de l’écart entre expérimentale et simulation des valeurs33,34. Une autre explication serait la présence de particules plus petites ou plus grandes en fluorescéine-isothiocyanate-dextran. Le fabricant spécifie le poids moléculaire de la substance comme la taille moyenne avec une plage donnée, ce qui permet à des particules plus petites et plus grandes d’être présent. On ignore également comment dispersées ces substances sont, comme les particules plus petites imprègnent plus rapidement à travers le gel et le canal de fluide. Il est possible d’étendre la simulation afin d’étudier ces diffusion et les effets de la friction.
L’expérience de la perméabilité et la simulation ont été développés pour une utilisation dans un 2-oC. Avec l’aide de la simulation, cette méthode expérimentale peut être transférée directement aux configurations expérimentales plus sophistiquées. Par exemple, la simulation de système insert membrane peut être facilement transférée à la géométrie d’un 2-OC ou à d’autres systèmes avec des configurations similaires. Cette option de modulation de la simulation peut servir à appuyer la conception de futures expériences. En outre, les effets secondaires tels que l’évaporation, diffusion anormale et effets membranaires peut être intégrés pour améliorer la simulation, augmentant ainsi la précision. Le programme de simulation donne la possibilité de changer ou améliorer l’équation de simulation, ainsi que d’intégrer d’autres modules physiques afin d’enquêter sur d’autres aspects du développement de modèle de peau. Un exemple est la simulation de la production de la consommation et de lactate de glucose dans un modèle de cellules de collagène.
Un aspect particulièrement intéressant dans les essais de substances médicales est la façon dont les substances sont distribués dans un système d’orgue-on-a-chip. Le paramètre de simulation et de perméabilité mon aide pour répondre à des questions telles que comment rapidement une substance pénètre dans le système et dont la concentration sera disponible pour les autres tissus dans une puce multi-organes. Cette méthode peut appuyer et d’améliorer le développement et le test de tels systèmes d’organe-on-chip.

Organo-typiques cultures 3D sont devenus des outils puissants pour le développement de médicaments et de la substance test1. À cet égard, les modèles de peau humaine sont d’un intérêt particulier en raison des exigences réglementaires, telles que celles de la cosmétique. Ils ont ensuite conduit à l’élaboration de nombreux modèles de peau 3D, pour une utilisation soit sur leur propre comme culture unique-orgue en plaques multipuits, ou en multi-organes-copeaux en combinaison avec les modèles d’organes supplémentaires, par exemple, le foie2.
En ce qui concerne la culture d’un équivalent de la peau, l’interface air-liquide (ALI) est un élément essentiel pour la bonne différenciation épidermique3. Inserts de culture cellulaire, composés d’un récipient contenant une membrane perméable au liquide en bas sont généralement utilisés pour mettre en place un ALI. ALIs sont largement utilisés dans des modèles de peau disponible dans le commerce comme EpiDerm4, Phenion5et Episkin6, pour la culture des modèles de peau avec des tailles de 96 puits (4,26 mm de diamètre) jusqu'à plaques de 12 puits (12,2 mm de diamètre). La méthode décrite ici détermine la pénétration de substances dans un système d’insertion de membrane.
Le coefficient de perméabilité est un paramètre important pour évaluer la qualité de n’importe quel cultivée-modèle de peau contre peau native5et est utilisé pour évaluer la vitesse à laquelle les substances actives migrent à travers la peau. Surtout si les médicaments ou cosmétiques produits doivent être appliqués sur la peau, ce paramètre est essentiel de comprendre quand précisément les principes actifs passent par elle. Une simulation plus peut aider à prédire le comportement du système et de réduire par la suite l’effort expérimental de temps nécessaire, surtout lorsqu’un grand nombre de substances est impliqué.
La cellule de diffusion Franz est state-of-the-art pour perméation expérimente la peau et peau modèles5,6,7,8,9. Ce dispositif se compose de deux compartiments avec un échantillon fixe (barrière de diffusion) entre les deux. La substance d’essai est appliquée directement sur la partie supérieure de l’échantillon (compartiment donneur) et la concentration du composé PERMÉANTES peut être détectée dans le compartiment opposé à (accepteur). Du côté de l’accepteur, température constante et la concentration de la substance homogène sont assurées grâce à une chambre froide et un agitateur magnétique. Échantillons peuvent être prélevés à un échantillonnage du bras sur le côté de l’accepteur de la cellule de Franz. Avec une gamme de hauteur de 19 cm 179, ce système est relativement important de10,11. Une autre méthode pour la détermination des coefficients de diffusion des substances gélatineuse et de tissus est FRAP. Cette technique utilise le principe de blanchiment fluorescent étiqueté des particules dans le gel et puis en déterminant le temps de récupération de la zone blanchie pour calculer la diffusion coefficient12,13,14.
En outre, la spectroscopie Fourier transform-infrarouge (FTIR) peut servir à détecter le mouvement de la particule avec absorption de lumière infrarouge afin de déterminer le processus de percolation des substances dans la peau15,16. Cependant, ceux-ci ou autres méthodes d’imagerie (par exemple, de la spectroscopie par fluorescence biphotonique corrélation17) doivent coûter instruments intensives.
Dans cet article, on présente une méthode pour mesurer directement la perméabilité d’une barrière au sein d’un système d’insertion de membrane, où un modèle de peau peut être cultivé. Cette méthode permet aux expériences de perméabilité être exécuté avec un grand nombre de petits échantillons (bien taille vers le haut à 4,26 mm) dans un système compact. C’est contrairement à la cellule de diffusion Franz, où un dispositif distinct est nécessaire pour chaque sonde, ce qui doit être monté sur l’appareil et est difficile à réaliser pour les petits échantillons (taille de 4,26 mm). En outre, étant donné que la méthode ne nécessite pas de grands instruments (p. ex., un microscope confocal ou multiphoton), une réduction dans le temps et le coût est atteint.
Toutes les expériences ont été réalisées en membrane microporeuse insérer systèmes auprès d’un échantillon (barrière) consistant en gel d’agarose ou d’un modèle de cellules de collagène mis en place sur la membrane. Les substances fluorescentes (donneur) avec diverses tailles moléculaires ont été appliquées à la partie supérieure de l’échantillon et la concentration de substance perméabilisée a été détectée sur le fond (accepteur) à l’aide d’un lecteur de fluorescence (voir Figure 1). Afin de valider la méthode et de vérifier l’exactitude de cette simulation, les gels d’agarose ont été produits et utilisés comme une barrière. Les hydrogels sont généralement utilisés pour l’étude des processus de diffusion et de perméabilité dans un milieu poreux dans les sciences biologiques13. La méthode a été testée puis dans un système cellulaire graines consistant en une matrice de collagène de fibroblastes primaires et adultes faible Calcium haute température kératinocytes (HaCaT) des cellules humaines (modèle de cellule-matrice), qui est une peau simplifiée modèle18,19 .
En outre, le processus de percolation a été simulé au moyen de simulations de flux avec la dynamique des fluides computationnelle. Il a été constaté que, au moyen de l’optimisation des paramètres, le coefficient de diffusion pourrait être calculé à partir des données expérimentales. En général, cette simulation vous propose différentes applications ; par exemple, il est possible de prévoir un processus de perméation basé sur des expériences courtes et la simulation peut réduire considérablement le nombre d’expériences.
Simulation et méthode expérimentale ont été conçus pour l’application sur un système d’orgue-on-a-chip1,20,21, plus précisément le 2-orgue-puce (2-OC) développé commercialement1,22, 23,24,25. En principe, le processus de perméation de n’importe quel modèle d’orgue basé sur des systèmes de membrane insert peut être décrit de cette façon.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>High Resolution Powder</td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Collagen R solution 0.4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>High Glucose with L-Glutamine</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Fluorescein Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>no calcium, no magnesium , with phenol red</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>granulated</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>tablets</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>with EDTA</td></tr></tbody></table>

a method for determination and simulation of permeability and diffusion in a 3d tissue model in a membrane insert system for multi-well plates

Modèles de peau in vitro cultivées sont devenus de plus en plus pertinentes pour les applications pharmaceutiques et cosmétiques et sont également utilisés dans le développement de médicaments ainsi qu’aux essais de la substance. Ces modèles sont principalement cultivés dans les systèmes de membrane-insertion, leur perméabilité vers différentes substances étant un facteur essentiel. En général, les méthodes appliquées pour la détermination de ces paramètres exigent habituellement de grands échantillons (par exemple, la cellule de diffusion Franz) ou équipement laborieux (p. ex., récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)). Cette étude présente une méthode de détermination des coefficients de perméabilité directement dans les systèmes de membrane-insert avec diamètre de corps de 4,26 et 12,2 mm (zone de production). La méthode a été validée avec agarose et gels collagène ainsi qu’un modèle de cellule de collagène représentant des modèles de peau. Les processus de perméation des substances avec différentes tailles moléculaires et perméation à travers des modèles de cellules différentes (composé de gel de collagène, fibroblaste et HaCaT) ont été décrites avec précision.
En outre, pour prendre en charge la méthode expérimentale qui précède, une simulation a été créée. La simulation s’insère les données expérimentales bien pour les substances dont la petite taille moléculaire, jusqu'à à 14 x 10-10 m rayon de Stokes (4 000 MW), et est donc un outil prometteur pour décrire le système. En outre, la simulation peut réduire considérablement les efforts expérimentaux et est assez robuste pour être reconduites ou adaptés à des configurations plus complexes.

Expériences de perméabilité de la membrane de 96 puits insérer système avec du gel d’agarose à 2 % comme une barrière ont été menées afin d’évaluer l’exactitude d’une simulation. Sel de sodium de fluorescéine (NaFl) et fluorescéine isothiocyanate-dextranes (FD) ont servi à vérifier l’impact de la taille moléculaire de la substance de diffusion de 5 x 10-10 m vers le haut à 45 x 10-10 m rayon de Stokes (376.27-40 000 mol wt). Optimisation de paramètres native de la simulation a été utilisée pour ajuster la simulation aux données expérimentales.
À cette fin, pentes d’uniquement les éléments linéaires de la perméabilité simulée ont été comparés aux résultats expérimentaux. De petite taille moléculaire, simulation et les données expérimentales sont en bon accord avec 99,2 % pour NaFl et 80,2 % pour FD 4 000 (voir Figure 4 a et 4 b de la Figure). Plus grande taille moléculaire générée déviations supérieures montrant les corrélations de 50,5 % pour 10 000 FD, 79,7 % pour 20 000 FD et 53,6 % pour 40.000 FD. Courbe de progression dans les simulations ont montré un retard au début et à une hausse plus forte dans le cours des graphes (voir Figure 4 c–4e).
Coefficients de perméabilité et de coefficients de diffusion simulées sont indiquées en tableau 4. Le coefficient de perméabilité diminue avec l’augmentation de la taille moléculaire. Écart-type est entre 0,08 x 10-8 m/s et 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), qui correspond à une erreur absolue d’entre 4,18 % et 46,15 %. Expériences avec des molécules plus grosses ont montré une plus grande erreur absolue. Les coefficients de diffusion simulées se sont comportés très similaire aux coefficients de perméabilité expérimentale. Substances à plus grand rayon de Stokes a montré baisse des coefficients de diffusion et l’erreur absolue variait de 9,09 % à 18.46 % (N = 3).
Dans les expériences de perméation supplémentaires, quatre types de modèles de cellule de collagène différents furent utilisés comme barrières dans une membrane de 12 puits insérer système. Ces modèles comprennent un modèle acellulaire et un modèle de cellule avec différentes combinaisons de fibroblastes primaires dans le gel de collagène et HaCaT sur la surface. Les combinaisons suivantes ont été utilisés : collagène (colonel) comme un modèle acellulaire, collagène + fibroblastes (col. + F.), HaCaT (col. + H.) et collagène + fibroblastes, collagène + HaCaT (col. + F. + H.). Sel de sodium de fluorescéine avec DMEM + FCS de 10 % a été utilisé comme substance de donateurs. Image pour l’analyse du modèle de cellule de collagène, coloration à l’hématoxyline et éosine (HE) a été utilisée. Cette coloration a été faite à l’aide du protocole par le fabricant. Dans la Figure 5, montre une telle tache avec un modèle représentatif du colonel + F. + H.. Le HE taches légèrement la structure tissulaire de la matrice de collagène. Les fibroblastes sont situés dans la matrice, et les noyaux des fibroblastes et les cellules HaCaT sont colorés en violet foncé. Sur le dessus de la matrice de collagène, il y a une couche contenant plusieurs noyaux, qui devraient être le noyau de la HaCaTs, création d’une couche englobante sur le dessus du modèle.
Dans le tableau 5, coefficients de perméation expérimentale et des coefficients de diffusion simulées sont répertoriés. Une tendance est visible pour la plupart des modèles avec HaCaT, qui ont des coefficients de percolation/diffusion plus faibles en comparaison avec les modèles sans HaCaT. L’erreur absolue des coefficients de perméation est 10,9-24,4 % et pour la diffusion coefficients de 5.2 à 12,9 %.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> Figure 1 : vue latérale de l’expérience de la perméabilité de la membrane insérer système. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> Figure 2 : graphique exemplaire d’une expérience de perméabilité. La concentration de l’accepteur est tracée au fil du temps. Support de deux lignes en pointillés la partie quasi linéaire de la courbe. La pente de la partie linéaire est utilisée pour déterminer le coefficient de perméabilité. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> Figure 3 : géométrie et mesh de la membrane insérer système dans la simulation. (a) la géométrie de la membrane de 96 puits système d’insert. (b), à la géométrie de la membrane de 12 puits insert système. système d’insertion (c), à la maille de la membrane de 96 puits. (d), à la maille de la membrane de 12 puits insert système. (e) paramètres de la membrane et la section insèrent système. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> Figure 4 : comparaison des données expérimentales d’une expérience de perméation à la simulation optimisée. (un) sel de sodium de fluorescéine, (b) fluorescéine isothiocyanate-dextran 4 000 mol en poids, poids mol (c), 10 000, (d) 20 000 mol en poids et en poids mol de (e), 40 000 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> Figure 5 : représentant HE coloration d’un modèle de cellules de collagène (fibroblastes, collagène + HaCaT). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> Figure 6 : coefficient de perméabilité en fonction du rayon 1/Stokes à l’aide de sel de sodium de fluorescéine et fluorescéine isothiocyanate-dextran dans une membrane de 96 puits insérer système. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom</td>
			<td>Expression pour 96 système bien en mm</td>
			<td>Experssion pour système de 12 puits en mm</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [mm]</td>
			<td>14,7 [mm]</td>
			<td>Diamètre du puits</td>
		</tr>
<tr>
<td>D_A</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>Diamètre de la Membrane</td>
		</tr>
<tr>
<td>D_W</td>
			<td>8,79 [mm]</td>
			<td>21.97 [mm]</td>
			<td>Diamètre de l’accepteur</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>Hauteur de la barrière</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>Distance entre les deux bien et en bas</td>
		</tr>
<tr>
<td>dejlal</td>
			<td>4,73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>Forte de l’accepteur</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>Profondeur d’immersion</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>Rayon de la boule d’Immersion+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-Position de la balle d’Immersion+
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : paramètres de géométrie de simulation « Transport d’espèces chimiques ». + Uniquement pour être utilisé pour la simulation d’agarose gel dans 96 membrane bien insérer système.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom</td>
			<td>Expression</td>
			<td>Valeur</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0,1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Concentration de Fl.So.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 mg/ml [] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>0,5 mol/m2</td>
			<td>Concentration de FD 4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 mg/ml [] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>0,2 mol/m2</td>
			<td>Concentration de FD 10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 mg/ml [] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0.1 mol/m2</td>
			<td>Concentration de FD 20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 mg/ml [] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>0,05 mol/m2</td>
			<td>Concentration de FD 40.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>1e - 9m2/s</td>
			<td>Coefficient de diffusion de l’eau de gâchage</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Paramètres physiques pour la simulation de « Transport des espèces chimiques ».
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom</td>
			<td>Expression</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>Définition de la concentration de l’accepteur</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>Changement de facteur pour D</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Paramètres pour la simulation de le « Optimisation ».
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Perméat</td>
			<td>Coefficient de perméabilité (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coefficient de diffusion (m/s2) x 10-10</td>
			<td>Rayon de Stokes de perméat (m) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4.79 ± 0,20</td>
			<td>1.94 ± 0,34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4 000</td>
			<td>2,37 ± 0,31</td>
			<td>0,65 ± 0,12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1,67 ± 0,47</td>
			<td>0.22 ± 0,02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20 000</td>
			<td>0,65 ± 0,30</td>
			<td>0,29 ± 0,04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40 000</td>
			<td>0,27 ± 0,08</td>
			<td>0,14 ± 0,02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : coefficient de perméabilité et de la diffusion de substances avec rayon de Stokes différent par le biais de gel d’Agarose à 2 % + membrane dans une membrane de 96 puits insérer système. (sel de sodium de fluorescéine = Fl. So., fitc dextran = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modèle</td>
			<td>Coefficient de perméabilité (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coefficient de diffusion (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col.</td>
			<td>2.18 ± 0,29</td>
			<td>1.22 ± 0,06</td>
		</tr>
<tr>
<td>Le colonel + F.</td>
			<td>1,77 ± 0,38</td>
			<td>0,93 ± 0,12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Le colonel + H.</td>
			<td>1,64 ± 0,40</td>
			<td>0,96 ± 0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Le colonel + F. + H.</td>
			<td>1,65 ± 0,18</td>
			<td>0,88 ± 0,11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 5 : coefficient de perméabilité et de la diffusion du sel de sodium de fluorescéine à travers un modèle de cellules de collagène dans un 12-membrane bien insérer système (col = collagène, F. = fibroblastes, H. = HaCaT).

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A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

Une méthode de détermination de la perméabilité de la membrane insérer système pour plaques multipuits et in silico optimisation de paramètres pour le calcul des coefficients de diffusion à l’aide de la simulation sont présentés.

Une méthode de détermination et de Simulation de perméabilité et de la Diffusion dans un modèle de tissu 3D dans une Membrane insérer système pour plaques multipuits

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K vues.  Hamburg University of Technology. Une méthode de détermination de la perméabilité de la membrane insérer système pour plaques multipuits et in silico optimisation de paramètres pour le calcul des coefficients de diffusion à l’aide de la simulation sont présentés.

Vidéo: A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tridimensionnelle modèle de culture cellulaire pour mesurer les effets de l&#39;écoulement des fluides interstitiels sur l&#39;invasion tumorale

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Bio-ingénierie

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

La mise en œuvre d&#39;un système d&#39;infection à base Insertion Perméable Membrane pour étudier les effets de sécrétées bactériennes Toxines sur des cellules hôtes mammaliennes

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Immunologie et infection

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

Analyse de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par traversale microbienne à travers les cellules endothéliales microvasculaires

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Analyse de modèles de barrière hémato-encéphalique par coloration par immunofluorescence

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser l’utilisation de la technologie des puces tissulaires pour l’étude des tissus humains 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Utilisation de la plateforme tissulaire barrière MicroSiM (μSiM) pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Une plate-forme de tissu barrière reconfigurable avec des modes à puits ouvert et microfluidique

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

Pleins feux sur l’auteur : Développement d’un système microphysiologique modulaire unique pour imiter le tissu de la barrière humaine

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.

Transformer des modèles de tissus de barrière statique en systèmes microphysiologiques dynamiques

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

Une méthode de détermination et de Simulation de perméabilité et de la Diffusion dans un modèle de tissu 3D dans une Membrane insérer système pour plaques multipuits

Résumé

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