Bu protokol, insan hematopoetik ataları elde etmek ve farklılaşmalarını megakaryositlere teşvik etmek için basit bir yöntem önermektedir. Megakaryopoez'in daha iyi anlaşılması için bir temel görevi görebilirsiniz Bu teknik bir kaynak kullanır, ancak hematopoezde laboratuvar araştırmaları için uygun fiyatlı ve bol olmanın avantajını sunar. Bu yöntem, tedavide kullanılacak hücre için megakaryopoezisi daha iyi anlamak için kullanılır, şu anda durum böyle olmayan GMP koşullarında hazırlanmaları gerekecektir.
PBMC koleksiyonu da dahil olmak üzere adımları anlamak yalnızca görsel bir gösterimle tamamlanabilir. Bir deneye başlamadan önce, bir lökoredüksiyon filtresini boş bir 600 mililitre transfer çantasına ve bir boru setine bağlayın. Bir biyo güvenlik kabininde, lökoredüksiyon filtresi başına 25 mililitre filtrelenmiş elüsyon tamponu boş torbaya enjekte edin ve torba içeriğini filtreden hafifçe emmek için 30 mililitrelik bir şırınna kullanın.
Toplanan kırmızı kan hücrelerini yeni bir 50 mililitre tüpe aktarın ve hücre süspansiyonu% 2 dektran ile yarı yarıya seyreltin. Kan hücrelerini toplamak için iyice karıştırın ve hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tortulanmasına izin verin. Kırmızı kan hücreleri yerleştiğinde, süpernatantı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü iki milimolar PBS EDTA çözeltisi ile doldurun.
Gradyan yüzeyini bozmadan iki 50 mililitre tüpün her birinde süpernatantın yarısını 25 mililitre yoğunluk gradyanı ortamına hafifçe bindirin ve hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ile ayırın. Hücreleri her arayüzden yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Hücreleri yıkama başına iki milimoler PBS EDTA'nın 50 mililitresinde iki kez yıkayın.
İkinci yıkamadan sonra, peletleri saymak için tek bir 50 mililitrelik taze PBS EDTA hacminde yeniden koyun. Burada, toplanan hücreleri gece boyunca dört santigrat derecede ajitasyon altında tutarak prosedürü durdurmak mümkündür. CD34+hücre seçimi için, hücre numarasını belirleyin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücre peletini 10'da iki milimoler PBS EDTA'nın 300 mikrolitresinde sekizinci hücrelere yeniden biriktirin.
Sekizinci hücrelere uygun miktarda FC reseptör blokaj reaktifi ve 10 başına 50 mikro-boncuk mikro-boncuk ekleyin. Dört santigrat derecede 30 dakika sonra, hücreleri iki milimolar PBS EDTA ile yıkayın ve peleti 10 hücreye 10'a 500 mikrolitre taze iki milimolar PBS EDTA'da yeniden biriktirin. Manyetik sütunu PBS EDTA ile nemlendirip uygun şekilde boyutlandırın ve ardından örneği sütuna ekleyin.
Kolonu yıkama başına üç mililitre iki milimolar PBS EDTA ile iki kez yıkayın. CD34+hücreleri atlatmadan önce, her bir işlemde iki milimoler PBS EDTA'nın iki beş mililitre hacmi ile. Manyetik boncuk seçilen hücrelerin saflığını değerlendirmek için, izole edilmiş hücrelerin 100 mikrolitrelik aliquot'una uygun bir insan anti CD34 antikorunun iki mikrolitresini ekleyin ve dört santigrat derecede 15 dakika kuluçkadan önce iyice karıştırın.
Kuluçkadan sonra, hücreleri PBS'de yıkayın ve hücre örneğinin akış sitometrisi ile saflığını analiz etmek için peleti 200 mikrolitre PBS'de yeniden biriktirin. Saydıktan sonra, CD34 + hücrelerini santrifüjleme ile toplayın ve hücre süspansiyonunu hızlı bir şekilde soğuk çözelti ikiye eklemeden önce peletin soğuk çözeltide mililitre başına altı hücreye 10'luk bir yoğunluğa bir kez yeniden depolayın. Ardından kriyo tüpünü sıvı azot depolamaya aktarmadan önce 24 saat boyunca hemen eksi 80 santigrat derecelik bir dondurucuya yerleştirin.
Bu temsili çalışmada hücreler yaklaşık %95 canlılık ile gösterildiği gibi lökoredüksiyon filtrasyonu ile geri kazanıldı. Manyetik boncuk seçiminden sonra %90'dan fazla saf CD34+hücre popülasyonu elde edildi. Hücre çoğalması tipik olarak bir haftalık kültürden sonra azalır, ancak hücre canlılığında önemli bir değişiklik olmaz.
Yedinci güne kadar, CD34+hücreleri cd41, belirli ve erken bir işaretleyici veya megakaryosit ve trombosit gelişimi için ifade etmeye başlamalıdır. 10. güne gelindiğinde, kültürdeki hücrelerin çoğu tipik olarak megakaryositleri ifade eden olgun CD41'e dönüşür. 13. güne gelindiğinde hafif mikroskopi ile megakaryosit pro trombosit uzantısı ve trombosit salınımı gözlenebilir.
Kültüre salınan toplam CD41, CD42, 8 pozitif trombosit sayısı daha sonra kalibre edilmiş sayıda floresan boncuk kullanılarak ölçülebilir. Bu yöntem, megakaryopoezin temel mekanizmalarını geliştirmenin ve görselde trombosit verimini artırmanın yolunu açmaktadır. Bu yöntem sıkıcı görünse bile, sabırlı olmanız ve tüm bölgeleri önceden hazırlamanız çok basittir.
Kritik kaygılarımız megakaryopoez olsa da CD42 hücreleri hematopoetik yollarda kullanılabilir.
