Biz Suwei Gao şekil hazırlık yardım için teşekkür ederim. Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81530004, 31425016) ve Bilim Bakanlığı ve Çin teknoloji (2016YFA0100500) tarafından desteklenmiştir. JL deneyler gerçekleştirilen ve el yazması hazırlanan; Tayback el yazması düzenlenmiş. Her iki yazar okuyun ve son el yazması onayladı.

hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları zooloji Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi, Pekin, Çin için etik Değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış olan.
 1. malzeme hazırlık <ol><li>Sterilize 0.65 µm filtreleriyle ultraviyole ışınları ultraviyole altında üretilen ışın 4 h için temiz bankta lamba ve 2 h işaretinden sonra filtreleri teslim. 
	Not: UV ışık ile çalışırken, uygun koruma giymek.</li>
	<li>Paslanmaz çelik kafesler 30 ortaçağ halk ozanı için 121 ° C'de otoklav ısıtıcı ile sterilize. 
	Not: Paslanmaz çelik kafes belli bir yükseklikten hava-sıvı arabirimindeki filtreler desteklemek için gereklidir ve bu telin üstünde çelik kafes ( şekil 1 A) ile gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Seyreltik fluoksetin 10 µM son bir konsantrasyonu uzun vadeli M5300 içine kültür orta ve karışımı eşit. 
	Not: altı-şey plaka için 2 mL M5300 uzun vadeli kültür her şey için uygun ortamdır. Hidrokortizon 10 -6 M, seçmeli olarak orta seyreltilmiş.</li>
	<li>Altı-şey plakaları veya yemekleri 10 µM fluoksetin ile desteklenmiş orta aktarmak ve sterilize edilmiş paslanmaz çelik kafesler orta koydu.</li>
	<li>Cam hücre kültür tabağına sterilizasyon için her zaman iki kez 3 dakika için 0,65 µm filtreleri kaynar su ile yıkayın. Sonra şekil 1 içinde A [şematik gösterildiği gibi ayakta vasıl hava-sıvı arayüzey filtreleri tamponlanmış fosfat tuz koymak her yıkama, (PBS) için 2 ortaçağ halk ozanı ve yer ıslak paslanmaz çelik filtre kafesleri Merkezi]. 
	Not: kaynar su asepsis elde etmek otoklav ısıtıcı ile oluşturulabilir ve ekipman alınmalıdır otoklav Sterilizatör zamanında dışarı sıcaklık düşüş önlemek için.</li>
</ol> 2. AGM kültür Explant <ol><li>dikkatle E10.5 veya E11 embriyo Forseps ile gelen AGM bölgeleri ayırmak.
	<ol><li>Hamile fareler gelen rahim diseksiyon makası ile şerit ve embriyoların rahim ayırmak.</li>
		<li>Sarısı sac, göbek kordonu ve iç organlar embriyo vücuttan yok etmek.</li>
		<li>Dorsal sinir doku ve kas çevre dokular dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
		<li>Kesim sitesinde ön ve arka bacaklarda Forseps ile belgili tanımlık doku kapalı ve AGM bölge embriyo vücudundan ayırmak. rakamlar 1 ABC göstermek şematik gösterim ve morfolojisi disseke AGM.</li>
	</ol></li> <li>Disseke AGMs filtreleri, hava-sıvı arayüzey ( şekil 1 A) ve kültür olarak 37 ° C'de % 5 CO 2 ayrı ayrı üzerine 2-3 gün boyunca explant. 
	Not: Disseke AGM çelik Kafes Tel üzerine yerleştirin ve filtreleri hava-sıvı arayüzey kültür sırasında olduğundan emin olun. AGM yanı sıra sarısı sac ve fetal karaciğer de bu sistem 7 ile kültürlü.</li>
</ol> 3. İfade analizleri <ol><li>mRNA düzeyi <ol><li>1 mL PBS içine kültürlü AGMs toplamak ve 4 ° c, 310 x g 6 dakika süreyle santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant kaldırdıktan sonra toplam RNA fenol, monophasic çözeltisi ile toplanan AGMs üreticiye göre çıkarılan &#39; s yönergeleri.</li>
		<li>Toplam RNA (2 µg) sonra geriye doğru M-MLV transkriptaz cDNA şablon olarak elde etmek için kullanarak transkripsiyonu. Nicel gerçek zamanlı PCR deneyleri SYBR yeşil ile gerçekleştirilir ve Gapdh iç kontrol kullanılır.</li>
	</ol></li> <li>Protein seviyesi <ol><li>yukarıda 3.1.1. adımda açıklandığı gibi kültürlü AGM toplamak.</li>
		<li>Protein hücre lizis arabelleği ile kültürlü AGM üzerinden hazırlamak (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl ve % 0,5 NP-40) proteaz inhibitörü ve protein seviyesi daha önce tespit etmek için Batı kurutma için kullanım içeren açıklanan 13.</li>
	</ol></li></ol> 4. Koloni oluşturan birimler kültür (CFU-C) tahlil <ol><li>2-3 gün sonra kültür, 1 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 4 ° c, 310 x g 6 dakika santrifüj AGM bölgelere toplamak ve 200 µL collagenase (PBS %0,1) 37 ile ayırmak ° C. 
	Not: yaklaşık 20 dakika collagenase tek hücre-süspansiyonlar oluşturmak gerekli zamanı geldi. AGM içeren tüp sallayarak her 5 ortaçağ halk ozanı sindirim süreci hızlandırabilir. 200 µL % 0,1 collagenase her AGM için kullanılır ve 200 µL % 10 serum reaksiyonu durdurmak için kullanılır.</li>
	<li>Tek hücre-süspansiyonlar Ultra düşük ek 24-şey plakaları M3434 ortamda kültür. 
	Not: kirlenmesini önlemek için penisilin-streptomisin çözüm seçerek orta eklenebilir. M3434 orta yapışkan olduğundan, 1.0 cc enjektör iğne olmadan bu hücreleri ve orta karıştırmak için kullanılan.</li>
	<li>Sonra 7 - 10 gün kültür 37 ° C % 5 CO 2, koloniler eritrosit, makrofaj, megakaryocyte (CFU-et) birimi--erythroid (BFU-E), CFU-granulo-monosit (CFU-GM) ve CFU-granülosit, şekillendirme patlama da dahil olmak üzere her tür sayısı ayırt edici morfolojisi dayalı ve ters bir mikroskopla ( Şekil 2 C) attı mı.</li>
</ol> 5. Vivo Nakli tahlil explant kültürü, <ol><li>koloni oluşturan birimler-dalak (CFU-S) tahlil <ol><li>sonra 2 - 3 gün AGMs toplamak ve 200 µL collagenase (PBS %0,1) 20 ile kuluçka tarafından tek hücre süspansiyonlar hazırlamak min.</li>
		<li>Ölümcül ışınlama (röntgen 9 Gy) 8 - 10 - hafta yaşlı erkek C57BL/6 farelerin gerçekleştirmek 4-5 h hücre enjeksiyon önce.</li>
		<li>Radyoaktif fare faaliyetini kısıtlamak için bir restrainer koymak.</li>
		<li>Kapakların damarın tanıtmak için %75 alkol dolu bir pamuklu çubukla kullanarak kuyruk yok.</li>
		<li>Enjekte 0.5 embriyo eşdeğer (ee) veya 1 ee tek hücre-süspansiyonlar AGM, intravenöz radyasyonlu fare kuyruğu damar içine 1.0 cc şırıngayla. 
		Not: Hücreleri PBS ile askıya alınır ve alıcı başına 0.5 mL PBS uygun bir birimdir. Bir iğne 25 ölçer veya 26 ölçer boyutunun 1.0 cc şırıngayla enjeksiyon için kullanılır. Hava şırınga tanıttı olabilir. Kanamayı durdurmak için antiseptik bir bez ile enjeksiyon izi basın.</li>
		<li>On bir gün ekimi, ödemeli posta ve alıcı farelerin dalağı Bouin içinde düzeltmek &#39; 1-2 gün ve başka bir 1-2 gün için % 80 alkol ile yıkama için s çözüm (15 mL doymuş %1.22 Pikrik asit sulu çözüm, 2 mL % 40 metanol ve 1 mL Asetik asit). Dalak görünür kolonilerde macroscopically saymak ve koloniler ee başına sayısını belirleyen. 
		&#8203; Not: Bouin &#39; s sabitleştirici, giyim uygun koruma.</li>
	</ol></li> <li>Uzun vadeli nakli tahlil <ol><li>sonra 2-3 gün kültür explant, AGMs toplamak ve 20 dakika süreyle 200 µL collagenase (PBS %0,1) ile kuluçka tarafından tek hücre süspansiyonlar hazırlamak</li>
		<li>8 - 10 - hafta yaşlı erkek C57BL/6 fare öldürücü ışınlama (x-ray 9 Gy) 4-5 gönderilen hücre enjeksiyon önce gerçekleştirmek.</li>
		<li>Radyoaktif fare faaliyetini kısıtlamak için bir restrainer koymak.</li>
		<li>Kapakların damarın tanıtmak için %75 alkol dolu bir pamuklu çubukla kullanarak kuyruk yok.</li>
		< lBen > 0.5 embriyo eşdeğer (ee) enjekte veya 1 ee tek hücre-süspansiyonlar intravenöz ışınlanmış bir fare kuyruğu ven içine, AGM 1.0 cc şırıngayla. AGM bir doz 2 × 10 5 kemik iliği hücreleri (CD45.1 arka plan) ile alıcı başına 1 ee adlı enjekte. 
		Not: Hava şırınga tanıttı olabilir. Kanamayı durdurmak için antiseptik bir bez ile enjeksiyon izi basın.</li>
		<li>Dört ay sonrası nakli, kemik iliği alıcının toplamak ve FACS tarafından sulandırma tahlil için kullanabilirsiniz. Yalnızca alıcıları ile &#8805; % 10 chimerism donör elde edilen başarılı sulandırma sergilemek olarak kabul edilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li><li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta.">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li><li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition.">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li><li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+(HSC/RUs):+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+(AGM)+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver.">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li><li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region.">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li><li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development.">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li><li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta.">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo.">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li><li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stromal+clones+reveal+developmental+regulators+of+definitive+hematopoietic+stem+cells.">Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells.</a> PNAS. 104, 20838-20843 (2007).</li><li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells/hematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region,+with+increased+apoptosis.">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li><li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival.">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li><li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells.">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784 (2016).</li><li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis.">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li><li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment:+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels,+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes.">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li><li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood:+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine.">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li><li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake:+Lilly+110140,+3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li><li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter.">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li><li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region.">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li><li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+together+the+organoid+field:+from+early+beginnings+to+the+road+ahead.">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çakışan mali ilgi alanlarına sahip.

İyi olgun HSCs kemik iliğinde kan sistemi radyasyonlu alıcılarının yeniden doldurabilir bilinmektedir. Bu işlev HSCs farklı olarak, fare embriyo AGM içinde ortaya çıkan HSCs olgunlaşmamış. Doğrudan nakli sonuçlar gösterdi bu tür ben (VE-cad+ CD45- CD41+) ve tip II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs sahip hiçbir sulandırma yeteneği20. AGM explant kültür sistemi, AGM bölgedeki doğmakta olan HSCs yararlanarak alıcıları ekimi tah...

Hematopoetik kök hücre (HSCs) erythroid, myeloid, dahil olmak üzere multilineage potansiyel ve lenfoid hücrelerin yanı sıra kendi kendini yenileme yeteneği sahip doku özgü erişkin kök hücreleri vardır. Erken HSCs hemogenic endotel (HE), bilinen bir popülasyondan özel endotel, endotel dorsal aort1,2 ventral duvar, hematopoetik geçiş (EHT) aracılığıyla ortaya çıkan son çalışmalar göstermiştir ,3,4. Aort-erbezi-mesonephros (AGM) bölgede embriyonik (E) 10,5 dan E12.5 için fare embriyo oluşan bir kez HSCs fetal karaciğer için genişleme içine göç ve son olarak bir kişinin hayatı boyunca yetişkin hematopoiesis korumak için kemik iliği kolonize 5 , 6. her ne kadar bu uzun yıllar boyunca inceledi, HSC ortaya çıkması ve geliştirme temel mekanizmaları tam olarak anlaşılır kalır.
Vitro fertilizasyon ve Zebra balığı embriyo gelişimi, intrauterin fare embriyo gelişimi sırasında embriyogenez kesin hematopoiesis çalışma çok daha rahatsız edici yapar. Belirli KO fareler eksikliği de hudut onların kullanma-hematopoetik araştırma alanındaki her ne kadar genetik deneyler nakavt (KO) fare kullanarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, in vivo kurtarma denemeleri kolayca KO fareler gerçekleştirilemiyor. 1996 yılından bu yana, AGM explant kültür hematopoetik çalışmaları için alan7öncüleri tarafından geliştirilmiştir. Bu kültür sistemi sayesinde, AGM bölge ventral dokuların bir ters etkisi8,9dorsal doku uygulamayın iken HSC etkinlik, tanıtmak için tespit edilmiştir. AGM explant kültür sistemi aynı zamanda Serotonin, Mpl, SCF, BMP ve kirpi HSC geliştirme10,11,12,13, sinyal rolleri belirlemek için uygulanan 14. önemli, bu da mutant embriyo13,15dakika sonra hematopoetik kusurları kurtarmak için kullanılan popüler bir yöntemdir.

<table><tbody><tr><td>durapore 0.65 &amp;micro;m filters</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM explant culture</td></tr><tr><td>M5300 long-term culture medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5300</td><td>AGM explant culture</td></tr><tr><td>Trizol&amp;nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>RNA extration</td></tr><tr><td>M-MLV reverse transcriptase</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>reverse transcription</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>quantatitive real-time PCR</td></tr><tr><td>protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>Protein extration</td></tr><tr><td>collagenase</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>digestion of AGM tissues</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>CFU-C assay</td></tr><tr><td>ultra-low attachment 24-well plates</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-C assay</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2 mice</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>CFU-S assay</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 mice</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Long-term transplantation</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM Collection</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM explant culture</td></tr><tr><td>anti-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>Long-term transplantation</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>Long-term transplantation</td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD</td><td>039-14402</td><td>power: 30W</td></tr><tr><td>stainless steel mesh</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&amp;nbsp;</td><td>aperture diameter: 2.5 mm</td></tr><tr><td>hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>selectively diluted into M5300 medium</td></tr></tbody></table>

application of aorta-gonad-mesonephros explant culture system in developmental hematopoiesis

Hematopoiesis çalışmalar için fare embriyo kullanarak sınırlama operasyonlarında, hangi büyük ölçüde embriyo intrauterin gelişme nedeniyle eklenen rahatsızlık 's. Nakavt (KO) fareler genetik verileri ikna edici rağmen KO fareler tüm genler için gerektiği gibi oluşturmak için gerçekçi değildir. Ayrıca, in vivo gerçekleştirme KO fareler elde edilen verileri birleştirmek için kurtarma deneyler değil uygun. Bu sınırlamalarını aşmak için aort-erbezi-Mesonephros (AGM) explant kültür hematopoetik kök hücre (HSC) geliştirme eğitim için uygun bir sistem olarak geliştirilmiştir. Özellikle kurtarma denemeleri için bu KO farelerde Engelli hematopoiesis kurtarmak için kullanılabilir. Uygun kimyasallar orta ekleyerek, Engelli sinyal yeniden etkinleştirilebilir veya yukarı düzenlenir yolları inhibe olabilir. Bu yöntemin kullanılması, birçok deney HSC gelişiminin kritik düzenleyiciler tanımlamak için gerçekleştirilen, HSC gen ekspresyonu mRNA ve protein düzeyleri, koloni oluşumu yeteneği ve sulandırma kapasitesi ile ilgili. Bu dizi deney memelilerde HSC gelişimi için gerekli temel mekanizmaları tanımlamada yardımcı olabilir.

Son yayın AGM13' te pro-apoptotik yolu engelleyerek endotel hücre kaynaklı serotonin HSCs yaşama teşvik bildirdi. HSC geliştirme teşvik etkisi serotonin onaylamak için fluoksetin dahil edildi. Bir selektif serotonin re-uptake inhibitörü olarak (SSRI), fluoksetin serotonin yeniden emme periferik dokulara16,17,18etkisizleştirmek için kanıtlanmıştır. AGM kulla...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis at JoVE.com

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Bu iletişim kuralı kültürlü aort-erbezi-Mesonephros ifade analizleri, koloni oluşturan birimlerinde kültür ve dalak ve uzun vadeli sulandırma için düzenleyici faktörler ve sinyal yolları hematopoetik kök üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılmasını açıklar hücre gelişimi. Bu hematopoetik kök hücre biyolojisi ve işlev çalışmak için etkili bir sistem olarak göstermiştir.

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

application-aorta-gonad-mesonephros-explant-culture-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.4K Görüntüleme.  Chinese Academy of Sciences. Bu iletişim kuralı kültürlü aort-erbezi-Mesonephros ifade analizleri, koloni oluşturan birimlerinde kültür ve dalak ve uzun vadeli sulandırma için düzenleyici faktörler ve sinyal yolları hematopoetik kök üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılmasını açıklar hücre gelişimi. Bu hematopoetik kök hücre biyolojisi ve işlev çalışmak için etkili bir sistem olarak göstermiştir.

Video: Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Gelişim Biyolojisi

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

Normal ve Anormal İnsan Hematopoezin ex vivo Mimicry

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Biyomühendislik

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental processes and modelling kidney disease. However, the models are limited by a lack of vascularization and functionality. To address this, an improved protocol for the method of xenografting cells and tissues to the chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo to gain vascularization and restoration of blood flow was developed. The grafts are overlaid with custom-made minireservoirs that fix the samples to the CAM and supply them with culture medium that protects the grafts from drying. The improved culture method allows xenografts to grow for up to 9 days. The manuscript also describes how to provide optimal conditions for long-term confocal imaging of renal organoids and organotypic cultures using the previously published Fixed Z-Direction (FiZD) method. This method gently compresses an embryonic organ or organoid between a glass coverslip and membrane in a large amount of medium and provides excellent conditions for imaging for up to 12 days. Together, these methods allow vascularization and blood flow to renal organoids and organotypic kidney cultures with improved confocal imaging. The methods described here are highly beneficial for studying fundamental and applied functions of kidneys ex vivo. Both methods are applicable to various types of tissues and organoids.

This work describes two methods for studying organ development, an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos that allows for vascularization of cultured embryonic organs and organoids and a novel fixed z-direction organ culture method with modified experimental conditions that allows for high-resolution time-lapse confocal imaging.

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

Modifiye ES / OP9 Co-Kültür Protokolü Hematopoetik Döl Geliştirilmiş Karakterizasyonu sağlar.

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Işınlanmış farelerde etkili HSCT için osteo-organoid türevli hücreler

In Vivo Osteo-organoid Approach for Harvesting Therapeutic Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an adequate source of HSPCs, we developed an in vivo osteo-organoid by implanting scaffolds loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) into an internal muscle pouch near the femur in mice. After 12 weeks of implantation, we retrieved the in vivo osteo-organoids and conducted flow cytometry analysis on HPSCs, revealing a significant presence of HSPC subsets within the in vivo osteo-organoids.
We then established a sublethal model of hematopoietic/immune system injury in mice through radiation and performed hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) by injecting the extracted osteo-organoid-derived cells into the peripheral blood of radiated mice. The effect of hematopoietic recovery was evaluated through hematological, peripheral blood chimerism, and solid organ chimerism analyses. The results confirmed that in vivo osteo-organoid-derived cells can rapidly and efficiently reconstruct damaged peripheral and solid immune organs in irradiated mice. This approach holds potential as an alternative source of HSPCs for HSCT, offering benefits to a larger number of patients.

<meta charset="utf8"></head><body>Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Here, we established in vivo osteo-organoids triggered by bone morphogenetic protein-2-loaded gelatin scaffolds to harvest therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells for the reconstruction of a damaged hematopoietic and immune system. Overall, this approach can provide a promising cell source for cell therapies.

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an ...

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kullanımı

Normal ve Anormal İnsan Hematopoezin ex vivo Mimicry

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

Modifiye ES / OP9 Co-Kültür Protokolü Hematopoetik Döl Geliştirilmiş Karakterizasyonu sağlar.

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım