The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Bu çalışmalarda kullanılan tüm fareler Charles River Laboratories den temin edilen CD-1 fareler. Önceki kültürü deneyleri, aynı zamanda, C57BL / 6J (veriler gösterilmemiştir) gibi başka suşlar üzerinde gerçekleştirilmiştir, ancak herhangi bir suşu kullanılabilir. Hamile yetişkin kadın yaklaşık 2-3 aylık ve servikal dislokasyon ve embriyo çıkarılması öncesinde ikili torakotomi ardından CO 2 inhalasyon yoluyla ötenazi edildi. Fareler NIH esaslara uygun olarak muhafaza edildi ve deneysel protokoller Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> % 70 etanol çözeltisi hazırlayın. (Nemlendirilmiş odaları yapmak için ve / seyreltilmesi çözüm yapmak için) Otoklav deiyonize su. % 70 etanol ile aşağı püskürtülerek diseksiyon araçları (forseps, makas ve 27 G iğne şırınga) sterilize edin. </li><li> HazırlamakMl 1 M MgCl2 CaCl2, 3,75 1 M PO 4, 6.75 mi, kalsiyum ve magnezyum (80 g NaCl, 2 g KCI, 14.4 g 2 Na HPO 4, 2.4 g KH 2 içeren 10X fosfat tamponlu tuz (PBS) ). 1 L steril otoklava su içinde çözülür ve daha sonra filtre kağıdı ile filtre karıştırın. 1X PBS yapmak için, su ile 10 kat seyreltilir. </li><li> Isı 30 dakika boyunca 55 ° C &#39;de cenin sığır serumu (FBS) inaktive ve filtre, bir 0.22 mikron bir şırınga filtresi ile sterilize edin. </li><li> Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) &#39;den oluşan, (tam bir DMEM, cDMEM adlandırılır) 38 mi 1X komple kültür ortamı hazırlayın,% 10 penisilin-streptomisin stokunun ısı ile inaktive edilmiş FBS ile 1/100 seyreltme filtre edilmiştir. Bu genellikle taze kullanılabilir, ama 1 ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> 5 mg / ml&#39;lik bir stok konsantrasyonu için DMSO içinde VEGFR Tirosin kinaz önleyici II (TK II) sulandırın ve bir çalışma çözeltisinin yapılması için cDMEM ile stok seyreltin. Nihai conBu çalışma için sentrasyonu cDMEM içinde 1,875 ng / ml &#39;dir. Şirketin tavsiyelerine göre, stok çözeltileri -20 ° C&#39;de en fazla 6 ay süreyle stabildir. Çalışma çözümleri gibi taze yapmak ve aynı gün kullanın. Not: çalışma çözeltisi içinde, bu, ilacın konsantrasyonunun (bu damlacık iki kat seyreltilmiş olacaktır çünkü) arzu edilen son konsantrasyona göre iki kat daha yüksek olması gerekir. Aynı zamanda, &quot;kontrol&quot; tedavi için DMSO aynı hacimde içeren cDMEM aynı hacimde hazırlar. </li><li> Damıtılmış su ayrı ayrı kuyruk sindirim reaktifler (50 mM NaOH ve 1 M Tris-HCI [pH 8.0]) hazırlayın. </li><li> XY PCR primerleri, bir 25 uM stok olun (XY ileri 5&#39;-TGA TGG AGC TTT CTT TGA G-3 &#39;ve 5&#39;-in XY Arka CCG CCA CTG AAT TCT TTG G-3&#39;) birlikte nükleaz içermeyen su içinde. </li><li> 50X TAE tamponu (242 g Trizma Baz, 57.1 ml buzlu asetik asit Hazırlama, 100 mi 0,5 M EDTA, pH 8.5 ve ek su, 1 L final hacim). 1X TAE çalıştırma tamponu hazırlayın (20 mi 50X TAE 1 L toplam hacim, su ile sulandırılmış). </li><li> Kaynar kadar mikrodalga% 2.5 agaroz çözeltisi (0.625 gr agaroz, 0.5 ml 50X TAE tamponu, 24.5 ml su) ısı agaroz çözüm oluşturmak için, daha sonra soğumaya bırakın yaklaşık 55-65 ° C (dokunabilmek) kadar. Soğuduktan sonra,% 1 etidyum bromür çözeltisi 2 ul ve jel dökün. DİKKAT! Etidyum bromür mutajen ve teratojen olduğu; nitril eldiven ve uygun güvenlik protokolü taşıma kullanın. Seçenek olarak ise, diğer potansiyel olarak daha az toksik jel çözme maddeleri ya da boyalar kullanılabilir. </li><li> Imüno (% 0.1 Triton X-100,% 10 fetal sığır serumu [FBS] ve% 3 sığır serum albümini [BSA] PBS) Bloklama çözeltisi hazırlayın. </li><li> Immünofloresans için yıkama Solüsyonu (% 0.1 Triton X-100 PBS ile,% 1 FBS ve% 3 BSA) hazırlayın. </li><li> Imüno (% 0.1 Triton X-100 ile PBS) PBTx hazırlayın. </li><li> Cu kuluçka odaları hazırlayınlture. Su otoklavlanmış 35 ml büyük (100 mm çapında) petri kaplarına doldurulur. Diseksiyon ve kültürler yapılacaktır yere yakın yerleştirin. </li></ol> Mus musculus kaynaklı Fetal TESTİSLERİN 2. izolasyonu <ol><li> Her sabah vajinal fişler için dişi fare kontrol edin. Vajinal fişi tespit edildiği gün öğle E0.5 olarak kabul edilir. Onaylı hayvan protokolleri ile uyumlu bir şekilde, E11.5 hamile kadın fare Euthanize. </li><li> % 70 etanol ile fare karın aşağı Sprey. </li><li> Ince makas kullanarak bir V-şekilli kesi ile karın deri ve periton açın ve iç organları maruz doku kapağı geri çekin. </li><li> Uterin horn iki ucunda yumurtalık bulun. Makas kullanarak, annenin vücudundan embriyoları içeren rahim ayırmak için yumurtalığın ve bağ dokusu kesilir. </li><li> Yavaşça, plasenta karşı tarafında kesme sarısı kesesi teşhir ederek rahim duvarına açın. Pu dikkatli olun değilncture yolk kesesi zarar veya kaybetme embriyolar önlemek için. </li><li> Embriyo içeren sarısı keseler çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum ile PBS içeren bir çanak içine yerleştirmek için plasenta yakınındaki kesin. Kalsiyum ve magnezyum iyonlarının varlığı desteği hücre adhezyon molekülleri mimari dokusu korumak ve diseksiyon araçları yapışmasını doku önlemeye yardımcı olacaktır. </li><li> Forseps ile dikkatlice embriyo dışarı kayabileceği bir delik oluşturmak için sarısı kesesi batırılarak embriyo sarısı kesesi ve amniyon çıkarın. Embriyo yumurta sarısının dışında sonra, göbek kordonu kesti. </li><li> Bu noktadan sonra, steril doku kültürü kaputu bulunan bir mikroskop kullanılır. Embriyonun kafasını çıkartın ve boyun her iki tarafında forseps ile kısma atın. </li><li> Kuyruk çıkarın ve embriyo cinsiyeti belirlemek için XY PCR analizi için yeni mikrosantrifüj tüpe koyun. Not: Hasattan sonra en kısa sürede kültür gonadlar optimal iken, aynı zamanda pos olduğunusible kuyruk DNA&#39;sının çıkarın ve her bir embriyonun cinsiyeti bilinir ve sadece arzu edilen cinsiyet kültürlenmiş olması gerekmektedir, böylece, kültür önceden XX / XY genotipleme gerçekleştirmek için. Genotipleme yapılmaktadır birlikte kültür için hazır olana kadar 4 ° C de veya buz üzerinde (bunlar izlenebilir ve böylece), embriyolar ayrıldı tutulabilir. Bir ihtar utero veya kültür koşulları dışında bu dönem potansiyel kültür sırasında kültüre ya da sonraki gelişimi için canlılığı etkileyebilir olmasıdır. </li><li> (Genelde zayıf elinde tuttuğu forseps) forseps bir çift embriyo koltukaltı iğneleyerek kültür çanak alt karşı yatar pozisyonda embriyo sabitleyin. Tüm diseksiyon sürecinde hala embriyo tutmak için yerinde bu forseps koruyun. </li><li> Forseps diğer çifti, cilt kaplayan karın kaldırmak ve yavaşça vücut duvarı geri maruz karaciğer, bağırsak, ve diğer organları çıkarın. </li><li> Gonadlar dorsal aort iki tarafında arka vücut duvarında bulunan gibi,Vücudun orta hat boyunca uzanan büyük bir kan damarı, kapalı forseps ile ürogenital sırtı altına kepçe ve forseps açılması ve yukarı kaldırarak ürogenital sırtı çıkarın. Gonadlar gevşek duvara iliştirilmiş gibi, bu bağlantıları çıkarmadan çok hızlı yukarı çekin ya da gonadlar organlara zarar, streç olabilir dikkatli olun. </li><li> Medyaya doku acclimate bir çanak cDMEM içine ürogenital sırtı taşıyın. </li><li> 27 G iğneler kullanarak ürogenital sırtın geri kalanından gonad-mezonefron kompleksi ayırın. Optimal ayrılması izin bastırarak kesti ve doğru dokuyu yönlendirmek için diğer kullanılacak bir iğne kullanın. Keskin iğneler dokuya sopa plastik kırıkları yaratacak şekilde, çanak alt karşı testere hareketi kullanmaktan kaçının. Tamamen gonad bağlı mesonephrosun tutmak için emin olun. </li></ol> Küçük moleküllü inhibitör ile gonadın 3. Kültürleme <ol><li> Iki adet 20 mikron ayarlayın15 ul her l pipetler. Diğer pipet ilaçla tedavi cDMEM yalnızca kullanılacak ise, gonadlar ve kontrol cDMEM eklenmesi transferi için temiz, steril jilet kullanarak bariyer pipet uçları kapalı bir yaklaşık 1-2 mm kesti. </li><li> Kolayca kesme ucu kullanılarak pipetlenebilir böylece pipet onların uzun eksen paralel gonadlar hizaya. Pipet içine yapışmasını gonadlar dikkatli olun. </li><li> Bir kontrol damlacık olarak yan ve ilaç içeren damlacık gibi diğer etiketleyin. Sadece iki damlacıkları 35 mm çanak kapağı üzerinde sığabilir. Kapaklarındaki etiketler kuyruk doku içeren mikrosantrifüj tüpler üzerindeki etiketleri uygun olduğundan emin olun. </li><li> Küçük (35 mm) kültür çanak kapağı bir damlacık içine tek bir gonad içeren cDMEM Pipet 15 ul (dipleri nemlendirilmiş petri odasına sığacak kadar uzun olduğu gibi, sadece kapaklar kullanın). Çanak her iki yanı üzerinde iki ayrı gonad ihtiva eden damlacıkları yerleştirin, iyi ayrılmış from Birbirinizi. Gonadlar damlacıklar devredilmiştir emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. </li><li> Kontrol olarak belirlenmiş damlacık için, 30 ul toplam hacim bir damlacık yapmak için (adım 1.5) yapılan DMSO içeren cDMEM ek bir 15 ul ekle. Ilaç temas olmayacak sadece &quot;kontrol&quot; pipet kullanın. </li><li> Diğer damlacık (ilaçla tedavi örnek) için, 30 ul toplam hacmi olan bir damlacık yapmak için TKİ-II içeren cDMEM 15 ul ekleyin. Ilaçla işleme tabi tutulmuş numuneler için tasarlanmış tek pipet kullanın. </li><li> Onlar çapı yaklaşık 15-18 mm ve gonad kabaca ortasında yer alır kadar pipet kullanarak, genişleyen dairesel desen damlacıklar yayılır. Onun yan yatıyor ve gonad ve mezonefron kolayca ayırt böylece gonad Orient. İki lobu düz koymak, böylece akciğer Orient. <ol><li> Damlacık çapı biraz farklı olabilir, ancak gonadlar uçuşan değildir sağlamakg ve yüzey gerilimi ile yerinde tutulur. Damlacıklar birbirleri veya kapağın yan dokunmayın emin olun. Yüzey gerilimi olmadan, organlar, organ ve böylece morfolojisi bozan, kültür sırasında kapağın üzerine büyür ve dümdüz olacak. </li></ol></li><li> Dikkatle dik büyük (100 mm) nemlendirici çanak su yüzeyi üzerine damlacıklar içeren kültür çanağı kapağı yerleştirin. Kapağın altındaki altında sıkışıp hiçbir kabarcıkları vardır emin olun ve su yüzeyinde düz yalan. Kapağı ters ve herhangi bir su damlacıkları bulunan kapağın üst dokunmasına izin vermemek için dikkatli olmayın. </li><li> Küçük, nemlendirilmiş odasına oluşturmak için, hemen gonad kültürleri içine daha büyük nemlendirici çanak kapak ile kapatın. Medya herhangi buharlaşmasını en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk hareket ederler. Daha küçük tabak serbestçe hareket etmek o ve daha büyük çanak kapak arasında oda olduğundan emin olun; Aksi takdirde, yoğuşma mühür ve b yapabilirdokuya kilidi hava değişimi. </li><li> Iki küçük kapaklar odasına yerleştirilir hemen sonra, inkübatör içine odasına yerleştirin. 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde 48 saat boyunca damla kültürleri inkübe edin. </li></ol> Embriyolar Seks Belirleme 4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüp dibine embriyonik kuyrukları ekleyin. </li><li> Her tüpe 50 mM NaOH 200 ul ekle. </li><li> 15 dakika boyunca ya da doku tamamen eriyene kadar 95 ° C&#39;de yerleştirin. </li><li> Hafif ve kısaca 50 1M Tris-HCI ul ve vorteks ekleyin. </li><li> 0.5 ul 25 uM Primer çözelti, 2.5 ul 10X Taq tamponu, 0.5 ul 10 mM dNTP (nükleotit), 19,3 ul nuclease-: 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, örneklerin toplam sayısı her hacim çarpılarak taze PCR ana karışımı yapmak serbest su, 0.2 ul DNA Taq polimerazı. İyice karıştır. </li><li> 23 EklePCR master karışımı ul sindirilmiş kuyrukları 3 ul lizatı içeren tüpler PCR için. </li><li> Flick tüpler daha sonra tüpün dibine örnekleri getirmek için kısa bir sıkma gerçekleştirin, bunları karıştırın. </li><li> XY (Kısa) PCR programı (Tablo 1) çalıştırın. </li><li> 1X TAE tamponu içinde% 2.5 agaroz jeli içinde merdiveni (5x boyayla) örnekleri yerleştirin. </li><li> XX ve XY bantları çözülebilir kadar agaroz jel elektroforezi çalıştırın. </li><li> Görüntü UV ışığı ve yakalama görüntüsü ile jel. </li><li> Y kromozomu özgü bantlar vs özgü X-kromozomu-(X kromozomu = 331 baz çifti [bp] ve XY = 302 bp) analiz 13; XY (erkek) numuneleri, 331 iki bant ve 302 bp olacak XX ise (kadın) numuneler tek 331 bp bandı olarak görünecektir. </li></ol> 5. Tüm Dağı Organ İmmünofloresan 1.gün: <ol><li> Bir kesme ucu ile 1000 ul pipet kullanılarak kültürden gonadlar çıkarın. Eğer arzu edilirse, bunlar olabilirortam ve reaktifleri yıkamak için bir PBS tabağına yerleştirilir. 0.5 ml&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde PBS içine yerleştirin. Daha küçük tüp boyutu reaktifleri korumak ve daha kolay tüp numune takip etmek için yapacaktır. <ol><li> Potansiyel ilaç kirlenmesini önlemek için ayrı ayrı tüplerde, kontrol ve tedavi örnekleri yanı sıra, XX ve XY örnekleri tutmak ve pipetler ayrı setleri ile kültürden bunları kaldırmak için emin olun. </li></ol></li><li> PBS ile iki kez gonadlar yıkayın. Bu noktada andan itibaren, bu protokol kalsiyum ve magnezyum eksik 1X PBS kullanabilirsiniz. Onları yıkamak için, gonadlar (yerçekimi) tarafından tüpün dibine çöker ve daha sonra yukarıda sıvı kaldırmak için izin verir. Onlara çok yakın pipetleme gonadlar kaybetmek değil dikkatli olun. </li><li> Tüpten mümkün olduğunca PBS çıkarın. PBS,% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden içinde% 4 paraformaldehit 250 ul ekleyin ve bir rocker 4 ° C &#39;de O / N inkübe edin. Seçenek olarak ise, bu tespit bir rocker 4 ° C &#39;de 2 saat süre ile yapılabilir. DİKKAT! ParaforFormaldehit işlerken bu nedenle güvenlik protokolünü takip toksik bir maddedir. </li></ol> 2. Gün: <ol start="4"><li> Oda sıcaklığında 250 ul PBTx iki kez gonadlar durulayın. </li><li> Bir rocker oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 250 ul PBTx ile gonadlar 3 kez yıkayın. </li><li> Bir rocker oda sıcaklığında çözüm Engelleme 250 ul gonadlar en az 1 saat engelleyin. </li><li> Çözüm Engelleme içinde seyreltilmiş 250 ul primer antikor bir rocker 4 ° C &#39;de gonadlar O / N Leke. </li></ol> 3. Gün: <ol start="8"><li> 250 ul Yıkama Çözüm kez gonadlar durulayın. </li><li> Bir rocker oda sıcaklığında 10 dakika her biri için gonadlar 250 ul Yıkama Çözeltisi ile 3 kere yıkayın. </li><li> Gonadlar bir rocker RT&#39;de Çözüm Engelleme 250 ul 1 saat engelleyin. </li><li> Işıktan, ışıltılı ikincil antikorlar korumak için alüminyum folyo ile mikrosantrifüj tüpü örtün. </li><li> Ar üzerinde oda sıcaklığında gonadlar 2-4 saat bekletinOcker Alternatif olarak Hoechst 33342. ihtiva eden bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmiş 250 ul ikincil antikor, rocker 4 ° C &#39;de, ikincil antikor ve Hoechst 33342 inkübasyon O / N gerçekleştirin. </li><li> 250 ul PBTx iki kez gonadlar durulayın. </li><li> Bir rocker oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 250 ul PBTx içinde gonad 3 kere yıkayın. </li><li> Bir kesme pipet kullanarak, en az bir sıvı, bir lam üzerine gonadlar aktarın. Pipet yardımıyla fazla sıvıyı çıkarın, ancak doku kurumasına değil emin olun. </li><li> Forseps ile istenilen şekilde gonadlar yönlendirmek ve hızlı bir şekilde slayt gonadlar monte etmek montaj medya bir damla ekleyin. Montaj medya mantolar tamamen bütün numuneler emin olunuz; o örnekleri kurumasına izin kaçınmak için kritik öneme sahiptir. </li><li> Uygun büyüklükte kullanılması lamelleri (sayı 1.5 tarzı) yavaşça örnekleri kapsayacak. Lamel tüm yüzeyine temas montaj medya yayılmasını edelim. Gerekirse, çok hafifçe böylece lamel köşelerinde basınhiçbir büyük hava kabarcıkları vardır. </li><li> Montaj medya buharlaşmasını azaltmak için kenarlarda açık oje ile slaytlar mühür. Mağaza 4 ° C&#39;de karanlıkta slaytlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).</li><li>Maatouk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+beta-catenin+in+XY+gonads+causes+male-to-female+sex-reversal.">Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).</li><li>DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk-sac-derived+macrophages+regulate+fetal+testis+vascularization+and+morphogenesis.">Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).</li><li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ,+the+gonad.">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).</li><li>Walton, K. D., Kolterud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fetal+whole+intestine+culture+system+for+ex+vivo+manipulation+of+signaling+pathways+and+three-dimensional+live+imaging+of+villus+development.">Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development.</a> J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).</li><li>Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+culture+system+to+study+thyroid+development.">An ex vivo culture system to study thyroid development.</a> J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).</li><li>Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+embryonic+mouse+kidney,+culture+in+vitro,+and+imaging+of+the+developing+organ.">Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Combes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Endothelial+cell+migration+directs+testis+cord+formation.">et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation.</a> Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).</li><li>Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+kinase+domain+region+receptor+are+involved+in+both+seminiferous+cord+formation+and+vascular+development+during+testis+morphogenesis+in+the+rat.">Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat.</a> Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).</li><li>Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-mesenchymal+cross-talk+through+Vegf+and+Pdgf+drives+organ+patterning.">Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).</li><li>Clapcote, S. J., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplex+PCR+assay+for+sex+determination+in+mice.">Simplex PCR assay for sex determination in mice.</a> BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).</li><li>Nel-Themaat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Morphometric+Analysis+of+Testis+Cord+Formation+in.">et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in.</a> Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).</li><li>Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+male-specific+role+for+SOX9+in+vertebrate+sex+determination.">A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination.</a> Development. 122, 2813-2822 (1996).</li><li>Morais da Silva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Sox9+expression+during+gonadal+development+implies+a+conserved+role+for+the+gene+in+testis+differentiation+in+mammals+and+birds.">et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds.</a> 14, 62-68 (1996).</li><li>Rockich, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9+plays+multiple+roles+in+the+lung+epithelium+during+branching+morphogenesis.">Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).</li><li>Brennan, J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+tissue,+two+fates:+Molecular+genetic+events+that+underlie+testis+versus+ovary+development.">One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development.</a> Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).</li><li>Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-specific+cell+migration+into+the+developing+gonad.">Male-specific cell migration into the developing gonad.</a> Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).</li><li>Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis+using+an+organ+culture+technique.">In vitro spermatogenesis using an organ culture technique.</a> Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu çalışma fetal gelişimi eğitimi için birçok potansiyel uygulamalar vardır bir ex vivo tüm organ damlacık yöntemi gösterir. Bu teknik sayesinde embriyo ve potansiyel embriyonik letalitesinin erişilememesi biyolojik in vivo kullanarak incelemek için zor sorulara yaklaşımları ele araştırmacı birden organlar için kullanılan ve izin verir edilebilir. Bu kültür yöntemi memeli hücre çizgileri gibi yaklaşımlar nitro Diğer üzerinde ek avantajları vardır: bütün organ...

Insanlarda in vivo olarak organ yenilenmesi çok sınırlıdır; Bu nedenle, doku mühendisliği, doku ve bir ev sahibi tarafından bağışlanan bireysel hücrelerden organ gelişimi, organ değişimi için cazip bir potansiyel tedavi haline geliyor. Bu tedavi stratejisi başarılı olması için, ancak, faktörler ve organ morfolojilerinden katılan hücresel etkileşimleri iyice incelenmesi gerekir ve iyi anladım. Geleneksel yaklaşımlara belirli organların gelişimini incelemek için yetersizlik nedeniyle, araştırmacılar, alternatif bütün embriyo veya tüm organ kültürlerinde döndü. Kalaskar ve ark., 1 o ex vivo kültür yöntemleri organogenezisin çalışmaları için uygun bir alternatif düşündüren, utero geliştirme için (kültürlü embriyoların% 58&#39;inde) o ex vivo tüm embriyogenez kültür karşılaştırılabilir sonuçlar verir göstermiştir. Bir bireyselleştirilmiş organ kültürü sistemi gibi bu ex vivo drofarmakolojik reaktifler veya antikorların ilavesi ile, belirli bir sinyal yolu ya da hücresel etkileşimler manipülasyonu izin verirken plet kültür sistemi, sistemik etkileri tüm organ analizi bağımsız sağlar. Geleneksel olarak, fetal organ gelişimine çalışma maternal teslim farmakolojik reaktifler yanı sıra, transgenik fare ve boşaltma teknolojileri ile sınırlı olmuştur. Ancak, in vivo bu teknikleri ve tedavileri kapsayan teknik sorunlar vardır; En endişeleri genellikle embriyonik öldürücülüğü sonuçları eş zamanlı olarak çeşitli organları etkileyen etkileri etrafında döner. Fetal gelişimi manipüle çalışmaların ilave endişe farmakolojik tür reaktifler plasental bariyeri geçmek eğer (örneğin, ilacın anne metabolizma o embriyoyu ulaşmadan önce) ve intrauterin embriyonik gelişimi üzerindeki ilaçların anne etkisidir. Tüm organ kültürü tekniği tarifBurada bütün fetal gonadlar ex vivo dik damlacık kültürleri inkübe edildiği ilk Maatouk ve ark., 2 tarafından tarif edilen protokol uyarlanmıştır. Fetal gonadlar kültürlenmesi önemli bir avantajı, küçük molekül inhibitörleri ile kolaylıkla difüzyon ile bütün bir organ erişebilir olmasıdır. . DeFalco ve arkadaşları, küçük-molekül inhibitörleri ile bağlantılı olarak, bu ex vivo damlacık kültür yöntemi kullanılarak süreçler ve gonad gelişimi sırasında meydana gelen 3 etkileşimleri sinyal incelemek için kullanılabilir olduğunu göstermiştir; bu işlemler nedeniyle teknik zorlukları in vivo incelenmesi zor olacağını (örneğin, plasenta ya da genetik ya da farmakolojik yaklaşımlar kullanarak birden fazla organı etkileyen ölümcül yoluyla ilaçların geçişi). Damlacık kültürü sadece utero deneme belirli yönleri üzerinde bir gelişmedir, ama aynı zamanda in vitro ve ex vi üzerinde bir gelişmedirvo sistemleri de. Bunlar, çok çeşitli hücre tiplerini eksikliği, organ mimarisinin oluşmasına izin kritik hücre dışı matris (ECM) bileşenleri yoksundur ve sinyal basamaklarının gölgeleri göstermemesi için morfonogenezi çalışma hücre çizgilerinin kullanımı son derece zordur. Doku mühendisliği ECM taklit iskeleleri oluştururken önemli iyileştirmeler yapılmış olmasına rağmen, sinyaller organogenezis sırasında her hücre türüne göre gerekli olan ilgili bilgi eksikliği zorlu in vitro organ sistemini oluşturmak için yapar. Diğer ex vivo sistemler daha önce, filtreler 6 ve diğer iskele matrisleri 7,8 organogenezi incelemek için kurulan ya da daha spesifik olarak morfogenez ve agar 4 fetal organların canlı görüntüleme için çok başarılı olmuştur, 5 transwells oylandı. Damlacık kültür sisteminin avantajı, o kadar az reaktifleri, kullanma olanağı sağlayarak morfogenez çalışma olanak sağlamasıdırFTEN pahalı, ama aynı zamanda büyüme ve sinyal yetenekleri 9 için önemli olan, organ yüzey gerilimi vererek. Fare, ilk testis morfogenezisi embriyonik (E) arasında yer alan E11.5 E13.5 ve aşamaları; Bu aşamalar cinsiyete özgü farklılaşma etkileyen faktörleri incelemek için en uygun zaman penceresini içermektedir. Testis oluşumu sırasında meydana gelen önemli işlemler arasında testis kord mimarisinin üretimi ve testis özgü damar ağı oluşumu bulunmaktadır. Bu ex vivo tüm organ damlacık kültür sistemi kullanmak, bir erkek spesifik vaskülarizasyon değiştirebilir ve küçük bir molekül inhibitörü kullanmak suretiyle testis morfogenetiğine inhibe edebilir engelleyen, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) için reseptör etkinliği; VEGF-aracılı vasküler yeniden modellenme Testis gelişiminin 10-12 için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, başarılı bir diğer organlara uygulanabilir ve belirli bir zaman hedefleyebilirgelişme pencereler. Tüm montaj organı görüntüleme hayati yapıların görselleştirme yanı sıra çeşitli inhibitörlerinin uygulanmasından kaynaklanan yapısal ve hücresel değişiklikler sağlar. Önemli olarak, bu sistem, bir araştırmacı, in vivo hedefli gen stratejileri maternal ilaç uygulama ya da sistemik olarak bozulması potansiyel karıştırıcı etkilerini atlayabilir avantajlıdır. Böylece, bütün bu organın ex vivo damlacık kültürü sistemi önemli ölçüde fetal gelişim sırasında belirli organları içinde özellikle meydana gelen etkileşimleri ve sinyalizasyon anlama yeteneğini geliştirmek olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Strip 0.2 mL PCR Tubes &#38; Detached Flat Caps</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T3218-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1096FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe with 27gauge needles</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;M PES syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO14S-120-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuare</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>R-3200-1XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ445 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute 200 proof Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9938&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY PCR Primer&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2482-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Ethidium bromide solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td>
			<td>Denville</td>
			<td>CB-4050-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorMount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Chloride (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>Heat-inactivate before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>676481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Use at dilution: 1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Use at 2ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-165-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

Intrauterin organogenezi incelenmesi rahim içinde gelişmesi embriyolar nedeniyle reaktif erişilememesi plasenta memelilerde teknik olarak oldukça zor bir süreçtir. Yeni geliştirilen ex vivo dik damlacık kültür yöntemi rahimde yapılan çalışmalara cazip bir alternatif sunuyor. Ex vivo damlacık kültürü incelemek ve çeşitli engelleme ve aktive bileşiklerin kullanımı ile hücresel etkileşimleri ve çeşitli sinyal yolları işlemek için yeteneği sağlar; buna ek olarak, belirli bir organların gelişimi üzerindeki çeşitli farmakolojik reaktifler etkileri in utero sistemik ilaç verilmesi, istenmeyen yan etkiler olmadan incelenebilir. Vitro sistemler diğer karşılaştırıldığında, damlacık kültürü, memeli hücre çizgilerinde üretilemeyen, üç boyutlu morfogenez ve hücre-hücre etkileşimini incelemek için yeteneği, izin verir, ancak, aynı zamanda daha az r gerektirir sadeceex vivo ve in vitro diğerinden daha protokollerde eagents. Bu yazıda yöntemin etkinliğini göstermek için tüm organ immünofloresan ardından uygun fare fetal organı diseksiyonu ve dik damlacık kültürü teknikleri, göstermektedir. Ex vivo damlacık kültürü yöntemi benzer in vivo olarak gözlenen ve in vivo modellerde embriyon ölümlerine nedeniyle, aksi takdirde zor çalışma süreçleri incelemek için kullanılabilir ne organ mimarisi oluşumunu sağlar. Bir örnek uygulama sistemi olarak, bir küçük moleküllü inhibitör testiküler morfojenezinde damarlanma rolünü araştırmak için kullanılacaktır. Her organ yoğun olması protokole herhangi bir organ spesifik değişiklikler belirlemek için okudu gerekir, ancak bu ex vivo damlacık kültür yöntemi, akciğer ve potansiyel diğerleri gibi diğer fetal organ sistemlerinde, yükseltilebiliyor. Bu organ kültür sisteminde fetal organlar ile deney esneklik sağlar ve obtaine sonuçlarıd araştırmacılar fetal gelişim içgörüler elde etmenize yardımcı olacaktır, bu tekniği kullanarak.

Ex vivo damlacık kültürü kimse, böyle bir gonad olarak bütün organların, işlemek için hücresel etkileşimleri ve dinamiklerini incelemek için. 1, bir E11.5 gonadal damlacık kültürü nasıl hazırlanacağını adım adım moda gösteriyor Şekil verir. Kültür protokolünde ilk adımlar anne fare (Şekil 1A ve 1B) gelen embriyo içeren rahim başlangıçtaki kaldırılmasını içerir. Anneden rahim çıkarılmasından sonra rahi...

Watch this Scientific Journal Video about Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis at JoVE.com

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

using-ex-vivo-upright-droplet-cultures-whole-fetal-organs-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K Görüntüleme.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Video: Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Gelişim Biyolojisi

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

Cilt Onarımını Doğru Değerlendirmek için İnsan Ex vivo Yara Modeli ve Tam Montajlı Boyama Yaklaşımı

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

Ex Utero Pregastrülasyondan İleri Organogenez'e Fare Embriyolarının Kültürü

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal skeleton. These morphological changes are initiated and sustained through diverse signaling interactions, which often include protein phosphorylation by kinases. Here, two examples of physiologically-relevant contexts in which to study phosphorylation of proteins during mammalian craniofacial development are provided: mouse facial processes, in particular E11.5 maxillary processes, and cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells derived from E13.5 secondary palatal shelves. To overcome the common barrier of dephosphorylation during protein isolation, adaptations and modifications to standard laboratory methods that allow for isolation of phosphoproteins are discussed. Additionally, best practices are provided for proper analysis and quantification of phosphoproteins following western blotting of whole cell protein lysates. These techniques, particularly in combination with pharmacological inhibitors and/or murine genetic models, can be used to gain greater insight into the dynamics and roles of various phosphoproteins active during craniofacial development.

The protocol presents a method for isolating whole cell protein lysates from dissected mouse embryo facial processes or cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells and performing subsequent western blotting to assess phosphorylated protein levels.

Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Methods Article

Kullanımı