Programlanmış kök hücrelerden elde edilen böbrek organ kültürü ve organeller böbrek gelişimi ve hastalığının arkasındaki mekanizmaları incelemek için mükemmel yollar sağlar. Ancak mevcut organ kültür sistemi böbreğe kan akışını sağlamaz. Bu nedenle, mevcut modeller eksik ve kan filtrasyon olan böbreğin ana işlevini recapitulate başarısız nedeni.
Bu yayında, tavuk embriyosunun koroallantoik zarında embriyo böbreklerinin ve organoidlerinin yetiştirilmesi ve görüntülenmesi için geliştirilmiş bir protokol sunacağız. Yeni deneysel kurulumumuzda, CAM'e nakledilen böbrek ilkelerini kültür ortamıyla dolu geçirimli anlam rezervuarları ile kaplıyoruz. Bu protokol önemli ölçüde böbrek rudiments ve aynı zamanda içsel endotel hücrelerinin hayatta artırır.
Bu yöntem gelişmekte olan glomerulus kan akışını sağlar. Son zamanlarda da yüksek çözünürlüklü konfokal 3D hızlandırılmış görüntüleme sunan yeni bir sabit set yön organ kültürü yöntemi yayınladı. Bu yöntem organoidlerin ve organ ilkelerinin uzun süreli konfokal görüntülemesi için en uygun koşulları sağlamıştır.
Yaklaşımda, biz yavaşça bir cam kapak kayma ve geçirimli membran arasında doku sıkıştırmak. Burada özel tasarlanmış plakaların nasıl yapıldığını ve kültür deneylerinin nasıl kurulduğunu gösteriyoruz. Bu nedenle, bu yayında geliştirilmiş bir renal organel tüp kültür tekniği sayılmiyoruz.
Bu yöntem, organel oluşumumodeli ve embriyonik böbrekler ve böbrek organoidleri ex vivo çalışma için yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapmak için daha iyi bir yol sunuyor. Deneyinize bağlı olarak, altı kuyulu veya 12 kuyulu plakalar için tasarlanmış transfer hücresi kontra uçlarını alın. Bir Dremel aracı kullanarak sıcık ın kenarlarını kesilerek, ona bağlı geçirilebilir bir zar bulunan iki milimetre yüksekliğinde plastik bir halka oluşturun.
Bir neşter veya keskin bir bıçak ile swarf gelen halka kenarları lehçe. Mini rezervuarları en az bir saat boyunca %70 etanol ile sterilize edin. Daha sonra mini rezervuarları distile su yla otoklavda yıkayın ve laminar bir başlıkta kurulayın.
PBS ve kültür ortamındaki mini rezervuarları durula. Rezervuarı, membran yukarı bakacak şekilde kültür ortamımızın üzerine bir petri kabına yerleştirin. Membran üzerinde diseksiyon ex vivo embriyonik böbrekler veya böbrek organoidler düzenleyin.
Örneklerin etrafında çok fazla sıvı bırakmaktan kaçının ve onları bir hücre kültürü kuluçka makinesinde 2 ila 24 saat bağlı bırakın. Sekiz günlük eski ovo embriyonik tavuğun koryoallantoik zarına eksenal transplantasyon yapılır. Mini rezervuarları membranın grefti kapsaabilmesi için aktarın.
Embriyoyu örtmesinler diye CAM'in çevresine yerleştirin. Sonra mini rezervuarlar için kültür orta ekleyin. Maksimum olarak dokuz gün boyunca tavuk CAM üzerinde örnekleri yetiştirmek.
Mini rezervuarlarda günlük kültür ortamıdeğiştirin. Örneklerin vaskülarizasyonu transplantasyondan 24-48 saat sonra gözlenebilir. Sabit kültür için özel tasarlanmış altı-iyi plakalar yapmak için.
Uygun bir matkap ucu ile bir sondaj makinesi kullanarak plakanın alt kısmında 20 milimetrelik delikler delme ile başlamak gerekir. Daha sonra, plakanın üst tarafındaki deliklerin jantlarını parlatın. Son olarak, en az bir saat boyunca% 70 etanol plakaları sterilize.
Daha sonra plakaları distile su ile otoklavda yıkayın ve lemiar başlık içinde kurulayın. 22x22 milimetrelik kapağı %70 etanolde yıkayın ve tamamen kurutun. Tutkal doku tutkal kullanarak bir kuyunun dibinde bir deliğin üstüne kapak kayma.
Kurutuldıktan sonra, steril mikroskop altında plakaları inceleyin ve fazla tutkal çıkarın. İlk olarak, eşit miktarda hidrojen ile polistiren boncukbir aliquot karıştırın. Transfill kesici kesici sokucu, membran yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve böbrekleri membran üzerinde düzenleyin.
Dikkatle böbrekler yanında hidro-jel boncuk karışımı bir damla ekleyin. Transfill insertini ters çevirin, böylece membran ve böbrekler aşağı bakacak şekilde. Sonra dikkatle özel tasarlanmış altı kuyuplaka bizim kuyu içine eklemek yerleştirin.
Sokağı yavaşça kuyuya doğru itin. Böbrek boncuklar ile düzeyde olana kadar mikroskop düzleme derecesini izleyin. Bir elinizle kuyuya hafifçe bastırArak kesiciye tutun ve lehim demiri ile kesici uç çevresinde üç noktada plastik eriterek plakaya sabitle.
Yan tarafta bir açıklık ile kuyuya iki mililitre kültür ortamı ekleyin. Hızlandırılmış bir görüntülemeye başlarken, plakayı ters bir mikroskobun sahnedeki kuluçka makinesine aktarın. Modifiye CAM yakalama protokolümüz böbrek organoidlerinin ve embriyonik böbreklerin yüksek verimli vaskülariteleştirilmesini sağlar.
Kültür ortamı içeren birçok rezervuar donör doku sağlar ve vascularizaton devam ilk dönemde kuruyan korur. Bu film bir embriyonik fare böbrek merkezinde tavuk CAM aşılanmış ve yedi gün boyunca kültürlü tavuk kan hücrelerinin akışını gösterir. Bu şekil paneli, geliştirilmiş CAM kültür yöntemimizin renal kaynaklı endotel hücreleri için izin veren koşullar sağladığını göstermektedir.
A ve B rakamları, gün aralığında beş gün boyunca yetiştirilen embriyonik böbreklerin beş gün boyunca tavuk CAM'e aşılanmış merkez olduğunu göstermektedir. Fare spesifikleri ILE boyama CD-31 antikor cam aşılı böbrek merkezinin endotel hücre ağı sol yan kontrol daha geniş olduğunu göstermektedir. Şekil C fare kan damarları fare özel CD-31 antikor ile lekeli görmek ve tavuk kan damarları ile en çok.
Şekil D ve E beş gün boyunca seyahat kültürü veya tavuk CAM yetiştirilen ve CD-31 ve Hoechst ile boyanmış fare embriyonik böbreklerin kriyokesitleri göstermektedir. Glomeruli vaskülatür daha böbreklerde kontrol kültürleri daha tavuk CAM kültürlü olgundur. Şekil F yedi gün boyunca bir transgenik GFP tavuk CAM kültürlü bir fare embriyonik böbrek gösterir.
Fare endotel hücreleri CD-31 antikor ile boyanmıştır ve xenotransplanted fare böbreklerinde vaskülatür çoğunlukla ama sadece fare türetilmiş olduğunu gözlemleyebilirsiniz. Yeni sabit set yön kültürü sınırlı bir set mesafede embriyonik böbrekler ve organoidler kültürlenme sağlar. Geleneksel bir seyahat kültüründe, kültürlü organlar metal bir ızgara tarafından bir hava orta arayüzünde tutulan bir filtre üzerine yerleştirilir.
Bu yöntem gelişme ve büyüme için iyi koşullar sağlar, ancak görüntüleme için en uygun değildir. Sabit ayarlı yön kültüründe, kültürlü organ çanak bir cam alt ve bir membran arasında preslenir ve kalınlığı burada spacer olarak çalışan polistiren boncuklar tarafından kontrol edilir. Gelişmekte olan organlar, organın daha iyi bir görünüm vererek kapak cam sağ görüntülenebilir.
Bu şekil paneli, embriyonik böbreklerin ve böbrek organoidlerinin sabit ayarlı yön kültürü yöntemiyle kültüre alınabileceğini göstermektedir. Yedinci gün embriyonik böbrekler ve böbrek organoidlerinin parlak alan görüntüleri normal gelişim göstermektedir. Şekil C'de, Şekil D ile bir böbrek organoidinin gelişen nefronlarında GFB ekspresyonu aktive edilmiştir.
E ve F figürleri 12 gün boyunca kültürlü fare böbreğini sunar. Travma bir ve nefron boyama eurethric tomurcuk ve podocites göstermektedir. Film de, MTMG bir embriyonik böbrek sunar, Tayvan cree kökenli, Tayvan cree endotel hücrelerinde GFB ifade indükler nerede.
Gelişen embriyonik böbrekte renal endotel hücrelerinin mevcut olduğunu ve kültür yönteminde endotel ağının da gelişebileceğini görüyoruz. Sağdaki panelde, endotel hücrelerinin S şeklindeki evre nefronunvasküler yarıkiçine nasıl göç ettiğinizi görebilirsiniz. Burada tavuk CAM böbrek organoidleri ve embriyonik böbreklerin kzenotransplantasyonu için geliştirilmiş protokol sunduk.
Bu protokol önemli ölçüde böbrek rudiments ve aynı zamanda içsel endotel hücrelerinin hayatta artırır. Bu yöntem gelişmekte olan glomerulus kan akışını sağlar. Burada sunulan diğer protokol, görüntüleme kalitesini artıran ve organel oluşumunu tek hücre düzeyinde incelemeye yardımcı olan sabit set yön organ kültürü yöntemidir.
Yüksek çözünürlüklü görüntüler, böbrek organoidleri ve böbrek kültürlerinde hücresel davranışların otomatik hücre segmentasyonu ve bilgisayar tabanlı çalışması için uygundur.
